Одноклеточная визуализация всего мозга и анализ интактного мозга новорожденных мышей с использованием МРТ, очистки тканей и микроскопии световых листов

Резюме

Этот протокол описывает методы проведения магнитно-резонансной томографии, очистки и иммуномаркировки интактного мозга мыши с использованием iDISCO+, за которым следует подробное описание визуализации с использованием микроскопии светового листа и последующих анализов с использованием NuMorph.

Аннотация

Очистка тканей с последующей микроскопией светового листа (LSFM) позволяет визуализировать неповрежденную структуру мозга с клеточным разрешением, что позволяет проводить количественный анализ структурных изменений, вызванных генетическими или экологическими возмущениями. Визуализация всего мозга приводит к более точной количественной оценке клеток и изучению региональных различий, которые могут быть пропущены при обычно используемой микроскопии физически разделенной ткани. Использование световой листовой микроскопии для изображения очищенного мозга значительно увеличивает скорость получения по сравнению с конфокальной микроскопией. Хотя эти изображения производят очень большие объемы структурных данных мозга, большинство вычислительных инструментов, которые выполняют количественную оценку признаков на изображениях очищенной ткани, ограничены подсчетом разреженных клеточных популяций, а не всех ядер.

Здесь мы демонстрируем NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), группу инструментов анализа, для количественной оценки всех ядер и ядерных маркеров в аннотированных областях мозга мыши послеродового дня 4 (P4) после очистки и визуализации на световом микроскопе. Мы описываем магнитно-резонансную томографию (МРТ) для измерения объема мозга до усадки, вызванной этапами обезвоживания тканей, очистки тканей с использованием метода iDISCO+, включая иммуномаркировку, с последующей микроскопией светового листа с использованием коммерчески доступной платформы для изображения мозга мыши с клеточным разрешением. Затем мы демонстрируем этот конвейер анализа изображений с помощью NuMorph, который используется для коррекции различий в интенсивности, сшивания плиток изображений, выравнивания нескольких каналов, подсчета ядер и аннотирования областей мозга путем регистрации в общедоступных атласах.

Мы разработали этот подход с использованием общедоступных протоколов и программного обеспечения, позволяя любому исследователю с необходимым микроскопом и вычислительными ресурсами выполнять эти методы. Эти инструменты очистки тканей, визуализации и вычислений позволяют измерять и количественно определять трехмерную (3D) организацию типов клеток в коре головного мозга и должны быть широко применимы к любому дизайну исследования дикого типа / нокаутированных мышей.

Введение

Визуализация всего мозга с разрешением одной клетки является важной проблемой в нейробиологии. Изображения мозга с клеточным разрешением позволяют проводить подробный анализ и картирование на системном уровне схем головного мозга и того, как эта схема нарушается генетическими или экологическими факторами риска нервно-психических расстройств, клеточного поведения у развивающихся эмбрионов, а также нейронных цепей во взрослом мозге ^1,2,3. Существует несколько гистологических методов, которые позволяют получать изображения с высоким разрешением реконструированного 3D-мозга; однако эти методы требуют дорогостоящего специализированного оборудования, могут быть несовместимы с иммуномаркировкой, а двумерный (2D) характер некоторых методов может привести к повреждению тканей и сдвигу во время сечения ^4,5.

Последние достижения обеспечили альтернативный подход к визуализации всего мозга, который не требует разрезания тканей; они включают в себя использование очистки тканей, чтобы сделать мозг прозрачным. Прозрачность достигается в большинстве методов очистки тканей как путем удаления липидов, поскольку они являются основным источником рассеяния света, так и путем сопоставления показателя преломления (RI) объекта с RI раствора погружения образца во время визуализации. Затем свет может проходить через границу между материалами, не рассеиваясь 6,7,8,9.

Методы очистки тканей, такие как iDISCO+, часто сочетаются с быстрой 3D-визуализацией с использованием однофотонной микроскопии возбуждения, такой как LSFM ^6,7,10. Внутри прозрачных тканей, меченных флуорофором, светоплотная флуоресцентная микроскопия рисует участки путем возбуждения тонкой плоскостью света¹¹. Основным преимуществом LSFM является то, что одна оптическая секция освещается за один раз, при этом вся флуоресценция от молекул в этой секции возбуждается, что сводит к минимуму фотоотбеливание. Кроме того, визуализация всего оптического среза позволяет обнаруживать этот возбужденный срез на основе камеры, увеличивая скорость по сравнению с точечным сканированием¹². LSFM неразрушающе производит хорошо зарегистрированные оптические секции, которые подходят для 3D-реконструкции.

В то время как метод iDISCO+ позволяет провести недорогую очистку тканей в течение ~ 3 недель, этапы обезвоживания в рамках протокола могут привести к усадке ткани и потенциальному изменению морфологии образца, что влияет на объемные измерения ^6,10. Добавление вторичного метода визуализации, такого как МРТ, который будет использоваться до процедуры очистки тканей, может измерить степень усадки, вызванной очисткой тканей, по всему образцу. На этапах обезвоживания различия в механических свойствах между серым и белым веществом могут привести к неоднородным деформациям мозгового вещества, что приводит к неоднородным объемным деформациям, вызванным очисткой тканей, между образцами дикого типа и мутантами и может сбивать с толку интерпретации объемных различий в этих образцах^10,13 . МРТ выполняют путем сначала перфузии животного контрастным веществом (например, гадолинием), а затем инкубированием интересующей ткани в иммерсионном растворе (например, фомблине) перед визуализацией¹⁴. МРТ совместима с очисткой тканей и выполнением LSFM на одном образце.

LSFM часто используется для создания крупномасштабных микроскопических изображений для качественной визуализации интересующей ткани мозга, а не количественной оценки структуры мозга (рисунок 1). Без количественной оценки трудно продемонстрировать структурные различия, возникающие в результате генетических или экологических нарушений. По мере совершенствования технологий очистки тканей и визуализации, наряду с уменьшением затрат на хранение и вычислительную мощность, количественная оценка локализаций клеточного типа в интересующей ткани становится все более доступной, что позволяет большему количеству исследователей включать эти данные в свои исследования.

С более чем 100 миллионами клеток в мозге мыши¹⁵ и сеансами визуализации всего мозга, которые могут генерировать терабайты данных, существует повышенный спрос на передовые инструменты анализа изображений, которые позволяют точно количественно оценивать особенности в изображениях, такие как клетки. Существует множество методов сегментации для изображений, очищенных тканью, которые применяют пороговое значение для интенсивности ядерного окрашивания и фильтруют объекты с предопределенными формами, размерами или плотностями 10,16,17,18. Однако неточные интерпретации результатов могут возникать из-за различий в таких параметрах, как размер ячейки, контрастность изображения и интенсивность маркировки. В этой статье описывается наш установленный протокол для количественной оценки клеточных ядер в мозге мыши. Во-первых, мы подробно описываем шаги по сбору тканей мозга мыши P4, за которыми следует протокол очистки и иммуномаркировки тканей, оптимизированный из общедоступного метода iDISCO+¹⁰. Во-вторых, мы описываем получение изображений с помощью МРТ и световой микроскопии, включая параметры, используемые для захвата изображений. Наконец, мы описываем и демонстрируем NuMorph¹⁹, набор инструментов анализа изображений, разработанных нашей группой, которые позволяют количественно определять специфический клеточный тип после очистки тканей, иммуномаркировку ядерными маркерами и визуализацию аннотированных областей на световых листах.

протокол

Все мыши использовались в соответствии с и одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Университете Северной Каролины в Чапел-Хилл.

1. Рассечение и перфузия мыши

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие вскрытия были выполнены на мышах P4 и P14 с использованием шприца. Объем перфузионной жидкости будет варьироваться в зависимости от возраста животного.

1. Перфузия
   ВНИМАНИЕ: Параформальдегид (PFA) является опасным химическим веществом. Выполните все этапы перфузии в химическом вытяжном шкафу.
   1. Перед операцией введите пентобарбитал с помощью внутрибрюшинной инъекции (100 мг / кг) и дайте анестетику вступить в силу.
   2. После того, как животное достигло хирургической плоскости анестезии, используйте метод ответа на защемление пальцев ног, чтобы подтвердить невосприимчивость.
   3. Сделайте боковой разрез под грудной клеткой, чтобы обнажить грудную полость животного.
   4. Используя изогнутые, хирургические ножницы, аккуратно прорежьте грудную клетку до ключицы с одной стороны животного и сделайте идентичный разрез на противоположной стороне, позволив грудине оторваться, обнажив сердце.
   5. Не повреждая нисходящую аорту, тщательно обрежьте любую ткань, связанную с сердцем, прежде чем сделать небольшой разрез в правом предсердии, чтобы позволить крови вытечь из сосудистой системы.
   6. Используя метод на основе шприца, перфузируйте мышь через левый желудочек 10 мл и 7 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) для P14 и P4, соответственно, со скоростью перфузии 1,5 мл / мин через систему.
   7. Как только кровь очищена, снова перфьюируют 10 мл PBS + 4% PFA и 7 мл PBS + 4% PFA для P14 и P4, соответственно, при 4 °C со скоростью перфузии 1,5 мл / мин для фиксации животного.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будет наблюдаться фиксация тремора, и животное будет жестким по завершении. При использовании МРТ на образцах перфузируйте с аналогичными объемами PBS и PFA для каждой временной точки + 20% контрастное вещество МРТ на основе гадолиния в растворе PFA.
   8. Удаляют головку хирургическими ножницами и капельно-фиксируют PBS + 4% PFA в течение 24 ч при 4 °C для полной фиксации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе мозг остается нетронутым с черепом (см. Раздел 2). Точка паузы: мозг может храниться в течение нескольких месяцев на этом этапе в PBS + 0,1% азида натрия при 4 °C.

2. Визуализация грубой структуры мозга на основе МРТ с неповрежденным черепом и анализом

ПРИМЕЧАНИЕ: Мозг должен быть перфузирован и инкубирован в гадолинии, как описано выше, без удаления из черепа. Все МРТ происходит до удаления мозга из черепа, чтобы избежать непреднамеренной потери тканей во время рассечения. Визуализация с неповрежденным черепом также обеспечивает поддержку мозга в держателе образца (т. Е. Шприце) во время подготовки образца и визуализации.

1. Пробоподготовка
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги оптимизированы для образцов мозга мыши P4 и P14. Размер необходимого шприца будет зависеть от физического размера образца.
   1. При выполнении МРТ на образце удаляют кожу из черепа и инкубируют в PBS + 3% гадолиния в течение 23 дней при 4 °C перед визуализацией¹⁴. Через 23 дня быстро промыть образцы в PBS.
   2. Используйте шприцы 5 мл для создания держателя образца для МРТ, используя поршни шприца для закрытия каждого конца держателя, изготовленного с помощью шприца²⁰. Используйте пластиковые кусочки, чтобы плотно удерживать череп на месте в держателе (рисунок 2А). Удалите маркировку на шприце этанолом, чтобы предотвратить артефакты при визуализации.
   3. Надежно поместите череп в держатель образца и заполните иммерсионным раствором, совместимым с МРТ (см. Таблицу материалов). Закройте держатель и удалите все пузырьки воздуха с помощью шприца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Точка паузы: череп может храниться в растворе погружения в течение нескольких месяцев перед визуализацией.
2. Грубая визуализация структуры мозга (МРТ)
   1. Изобразите образцы с помощью системы МРТ животных с горизонтальным отверстием 9,4 Тл/30 см с использованием объемной катушки 15 мм и последовательности на основе спин-эха со следующими параметрами: Пространственное разрешение: 60 мкм x 60 мкм x 60 мкм; общее время сканирования: 7 ч 12 мин; время эхо (TE): 6,83 мс; время повторения (TR): 40 мс; углы возбуждения/перефокусировки: 90/180 градусов; размер изображения: 166 х 168 х 209 вокселей; Поле зрения (FOV): 9,9 мм x 10,1 мм x 12,4 мм; полоса пропускания: 100 000 кГц.
3. Вычислительный анализ структуры мозга
   1. Удалите окружающий череп из необработанных изображений МРТ, вручную отслеживая мозг мыши с помощью программного обеспечения сегментации. Затем примените операцию умножения вокселя между изображением маски и необработанным МРТ-изображением для создания изображения МРТ головного мозга с удалением черепа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выходные данные представляют собой двоичное изображение маски, где интенсивность для вокселей мозга установлена на 1 и 0 в противном случае.
   2. Примените жесткую регистрацию изображения (оценивая только трансляцию и вращение), используя «флирт» в пакете FSL^21,22, чтобы выровнять МРТ-изображение черепа (движущееся изображение) с соответствующим изображением микроскопии светового листа (эталонное изображение).
   3. Применение нежесткой регистрации (с использованием "SyN" в программном обеспечении ANTS²³) для поиска точечных соответствий между жестко выровненным МРТ-изображением на этапе 2.3.2 и изображением светового листа (то же эталонное изображение на этапе 2.3.2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выходные данные включают искаженное изображение МРТ и поле деформации, связанное с изменениями объема от МРТ до изображений светового листа.
   4. Вычислите определитель Якоба на поле деформации, сгенерированном на шаге 2.3.3, который количественно определяет изменение объема в локальном окружении 3 x 3 x 3 вокселя.
   5. Выровняйте изображения с черепом в атласе мозга мыши Allen Developmental с помощью деформируемой регистрации изображений.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Установленное пространственное соответствие точка-точка позволяет автоматически аннотировать области мозга, представляющие интерес, в новом изображении мыши (рисунок 2C-H).

3. Рассечение мозга из черепа

1. Сделайте разрез средней линии вдоль верхней части черепа от шеи до носа, чтобы обнажить череп.
2. Обнажите основание черепа, обрезав оставшуюся мышцу шеи и все другие остаточные мышцы.
3. Используя острые хирургические ножницы, аккуратно разрезайте вдоль внутренней поверхности черепа, заботясь о том, чтобы не повредить мозг, поддерживая мягкое давление вверх при резке острым хирургическим оборудованием.
4. Используйте пинцет, чтобы отклеить две разрезанные половины черепа от мозга и аккуратно отрезать лишний жир, прикрепленный к мозгу.
5. Используйте хирургические ножницы, чтобы обрезать любую твердую мозговую оболочку, которая соединяет мозг с черепом, а затем используйте шпатель, чтобы аккуратно удалить мозг из головы.
6. Удалите мозг, промойте PBS, а затем замените на PBS 0,1% азида натрия и держите при температуре 4 °C для длительного хранения.

4. Очистка тканей

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол адаптирован из протокола iDISCO+ для мышей P4⁶ с незначительными изменениями. Некоторые детали могут меняться для разных временных точек/видов/экспериментов). ВНИМАНИЕ: Метанол, дихлорметан (DCM) и дибензиловый эфир (DBE) являются опасными химическими веществами. Эти этапы очистки тканей выполняются в химическом вытяжном шкафу.

1. Проверка антител
   ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо проверить совместимость метанола с непроверенными антителами, поскольку на них могут негативно повлиять жесткие промывки метанола, требуемые протоколом iDISCO+. Список антител, которые, как было показано, работают в iDISCO+, см. на веб-сайте²⁴.
   1. Соберите 10 мкм замороженных участков интересующей ткани, зафиксированной PFA, на стереологических слайдах.
   2. Инкубировать срезы в 100% метаноле в течение 3 ч при комнатной температуре.
   3. Регидратировать в PBS, прежде чем приступать к стандартным протоколам иммуногистохимии, чтобы определить, показывает ли антитело ожидаемую картину флуоресценции после промывки метанола. Для положительного контроля используйте слайд, не обработанный метанолом.
2. Подготовка буфера
   1. Подготовьте буферы в соответствии с официальным протоколом iDISCO. См. Таблицу материалов для определения состава буферов и других растворов, используемых в этом протоколе.
3. Предварительная обработка
   1. Обезвоживать образец метанолом/ПБС серией: 20%, 40%, 60%, 80%, 100%; 1 ч каждый при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование PBS во время обезвоживания помогает предотвратить растрескивание образцов в метаноловых промывках.
   2. Промыть образец в 100% метаноле в течение 1 ч, а затем охладить при 4 °C в течение 1 ч перед инкубацией на ночь с встряхиванием в 66% DCM/33% метанола при комнатной температуре.
   3. Промыть образец в 2 раза в 100% метаноле при комнатной температуре, а затем охладить его при 4 °C.
   4. Используйте свежий 5% H_2O2 в метаноле для отбеливания образца в течение ночи при 4 °C.
   5. Регидратация образца метанолом/ПБС серий: 80%, 60%, 40%, 20%, PBS; 1 ч при комнатной температуре и промывка 2x в течение 1 ч в PTx.2 при комнатной температуре.
   6. Инкубируйте образец в 1x PBS/0,2% TritonX-100/20% DMSO при 37 °C в течение ночи.
   7. Инкубируйте образец в 1x PBS/0,1% Tween-20/0,1% TritonX-100/0,1% дезоксихолата/0,1% NP40/20% DMSO при 37 °C в течение ночи.
   8. Стирать в PTx.2 при комнатной температуре в течение 1 ч дважды.
4. Иммуномаркировка
   1. Инкубируйте образцы в растворе для пермеабилизации при 37 °C в течение 2 дней (~48 ч).
   2. Заблокируйте образцы в блокирующем растворе при 37 °C в течение 2 дней (~48 ч).
   3. Инкубировать образцы с первичным антителом в PTwH / 5% DMSO / 3% сыворотке при 37 °C в течение 4 дней (~ 96 ч) (например, антитела кролика (Rb) Brn2 / POU3F2 mAb (1: 100) и антитела против Ctip2 крыс (Rt) (1: 400) (Таблица материалов).
   4. Промыть 3 х 1 ч в PTwH. Промыть еще 2 ч в PTwH. Оставить в моющем растворе на ночь при комнатной температуре.
   5. Инкубировать образцы со вторичным антителом и ядерным красителем, таким как TO-PRO-3, в PTwH / 3% сыворотке при 37 °C в течение 4 дней (~96 ч; например, козий анти-Rb(1:50) и (козий анти-Rt(1:200)) (Таблица материалов).
   6. Промыть 3 х 1 ч в PTwH Промыть еще 2 ч в PTwH. Оставить в моющем растворе на ночь при комнатной температуре.
5. Очистка
   1. Обезвоживание в серии метанол/ПБС - 20%, 40%, 60%, 80%, 100%-1 ч при комнатной температуре. Инкубировать в течение 3 ч, при встряхивании, в 66% DCM/33% метаноле при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образец можно оставить на ночь при комнатной температуре сразу после обезвоживания в 100% метаноле.
   2. Инкубировать в 100% DCM в течение 15 мин дважды при комнатной температуре (с встряхиванием) для промывки MeOH.
   3. Инкубировать в дибензиловом эфире (ДБЭ) без встряхивания при комнатной температуре. Убедитесь, что трубка почти полностью заполнена DBE, чтобы предотвратить окисление образца. Закончите смешивание раствора, перевернув пару раз перед визуализацией.

5. Визуализация светового листа

ПРИМЕЧАНИЕ: Очищенный тканью мозг iDISCO был сфотографирован с помощью светового микроскопа, оснащенного объективом 2X/0.5 NA, дополнительной полупроводниковой камерой из оксида металла и программным обеспечением для работы микроскопа и получения изображений при 0,75 x 0,75 x 4 мкм/воксел для временной точки P4, поскольку это позволяло использовать одноклеточное разрешение в коре головного мозга (рисунок 3A, B).

1. Монтаж образцов
   1. Аккуратно установите образец в держатель образца правильного размера таким образом, чтобы образец был ориентирован с z-размерностью не более 5,2 мм в глубину из-за номинального рабочего расстояния светового листового микроскопа (5,7 мм минус запас прочности 0,5 мм)²⁵.
   2. Поместите держатель в подставку для образцов винтом держателя под углом 45° к опорам люльки (рисунок 1B). Расположите колыбель так, чтобы световой путь был перпендикулярен образцу (рисунок 1С).
2. Параметры визуализации
   1. Установите для корпуса зума на микроскопе 4-кратное увеличение или выше, дающее 0,75 мкм/пиксель.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Одноэлементный вычислительный анализ изображений P4 может быть выполнен с помощью любого коммерчески доступного светового микроскопа, который допускает разрешение 0,75 x 0,75 x 4 мкм/воксель или выше. Более низкое разрешение достаточно для мозга в более поздние моменты времени, в которых ядра более разрежены.
   2. В программном обеспечении для получения изображений выберите один световой лист с NA = ~0,08 (толщина 9 мкм/шаг z 4 мкм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта настройка в сочетании с горизонтальной динамической фокусировкой позволяет визуализировать весь мозг с одноклеточным разрешением мозга мыши в течение разумного времени. Для мозга на 4-й послеродовой день (P4) время получения изображения оценивается в 11-15 ч для трех каналов в зависимости от размера мозга.
   3. Чтобы обеспечить поддержание осевого разрешения по ширине изображения, выберите «Горизонтальная динамическая фокусировка» и примените рекомендуемое количество шагов в зависимости от длины волны лазера. Для всего мозга мыши P4 установите горизонтальную динамическую фокусировку на 11. Настройте fine Focus для каждого канала по отношению к каналу регистрации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь канал TO-PRO-3 (647 нм) зарегистрирован в Allen Developmental Mouse Brain Atlas, поскольку он маркирует все ядра.
   4. Отрегулируйте мощность лазера на канал в соответствии со свойствами канала.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более длинные волны требуют более высокой мощности лазера по сравнению с более короткими длинами волн. Например, 780 нм необходимо визуализировать при высокой мощности лазера (70% - 75%) и низкой экспозиции (50 мс), в то время как канал 647 нм требует средней мощности лазера (40% - 45%) и низкой экспозиции (50 мс).
   5. Отрегулируйте ширину светлого листа до ~50% , чтобы обеспечить оптимальное распределение мощности листа в размере y для данного размера образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В сочетании с горизонтальной динамической фокусировкой ширина листа 50% обеспечивает среднее распределение мощности по всему изображению с уменьшенным риском фотоотбеливания²⁵.
   6. Установите количество плиток по отношению к размеру выборки с рекомендуемым перекрытием 15% между плитками и захватите изображения для каждого канала последовательно для каждого стека в заданном положении плитки.

6. Обработка изображений с помощью NuMorph

ПРИМЕЧАНИЕ: Конвейер NuMorph состоит из трех основных частей для анализа 3D-изображений: предварительная обработка, анализ и оценка. Эти части были организованы в NMp_template, NMa_template и NMe_template, соответственно, которые обсуждаются ниже. Кроме того, добавлен NM_setup.m для загрузки и установки пакетов программного обеспечения, необходимых для бесперебойной работы NuMorph. NM_samples.m также предоставляет шаблон для ввода информации о приобретении изображения.

1. Настройка NuMorph
   1. Загрузите и установите диспетчер среды conda для Linux²⁶. Загрузите и установите инструменты обработки изображений NuMorph¹⁹ .
   2. В командной строке запустите Matlab. Запустите NM_setup.m из NuMorph, чтобы загрузить и установить программные пакеты для анализа образов, необходимые для анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг обеспечивает правильную настройку среды conda, а также правильную загрузку и установку всех инструментов и дополнений, необходимых Matlab для запуска каждого из трех конвейеров. Наиболее примечательными здесь являются Elastix для запуска регистрации и 3D-Unet для обнаружения и подсчета клеток.
2. Укажите имена образцов, входные и выходные каталоги, информацию о каналах и параметры изображения светового листа, отредактировав файл NM_samples.m.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь рекомендуется дважды проверить, чтобы убедиться, что правильная информация, особенно каталог ввода изображения, указана правильно. Ошибки обычно не вызываются здесь до выполнения последующих шагов.
3. Предварительная обработка изображений
   1. Регулировка интенсивности
      1. В NMp_template задайте регулировку интенсивности = true.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Установите значение true, если требуется регулировка интенсивности. Если нет, установите регулировку интенсивности = false. Существует также возможность использовать 'update' для перезаписи предыдущих параметров настройки.
      2. Установить использовать обработанные изображения = false при работе с новым набором изображений. В противном случае укажите любые ранее сохраненные наборы данных изображений в выходном каталоге (например, «выровненные», «сшитые») для использования на последующих этапах обработки.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Эта опция предоставляется в случае, когда входные изображения уже были предварительно обработаны. В этом случае в качестве входных изображений будут использоваться препроцессированные изображения, а опция будет установлена на имя подкаталога в выходном каталоге.
      3. Установите значение сохранить изображения = true.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Использование этой опции гарантирует, что обработанные изображения будут сохранены в выходном каталоге; в противном случае будут вычисляться и сохраняться только параметры.
      4. Задайте значение для сохранения образцов = true.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Эта опция гарантирует, что результаты выборки сохраняются для каждого основного шага.
      5. Установите параметр adjust tile shading = basic для применения коррекции затенения с помощью алгоритма BaSiC²⁷ или вручную для применения коррекции затенения плитки с помощью измерений из микроскопа светового листа при определенной ширине светового листа.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Этот параметр корректирует неравномерное освещение вдоль размера y, вызванное формой талии листа.
   2. Выравнивание канала изображения
      1. В NMp_template задайте выравнивание канала = true. Установите для этого параметра значение true, если требуется выравнивание каналов. Если нет, установите значение false. Задайте для метода выравнивания каналов либо трансляцию (жесткий), либо эластикс (нежесткий).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Метод трансляции использует жесткие подходы 2D-регистрации при выравнивании нескольких каналов, в то время как метод эластикса использует нежесткие B-сплайны²⁸ для коррекции вращательного дрейфа, который может произойти во время длительного захвата изображения¹⁹.
   3. Итеративная сшивка изображений
      1. В NMp_template установите stitch images = true.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Установите для этого параметра значение true, если требуется сшивание.
      2. Уточнение просеивателя множества = true.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Этот параметр используется для дальнейшего уточнения преобразования в xy с помощью Scale Invariant Feature Transform²⁹.
      3. Задайте параметры выравнивания нагрузки = true.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Эта опция использует трансляции выравнивания каналов во время сшивания. Этот вариант рекомендуется использовать при многоканальной визуализации. В противном случае задайте значение false.
      4. Установите значение перекрытия = 0,15 для сопоставления перекрытий плиток во время обработки изображений.
   4. Чтобы выполнить любой из этих шагов предварительной обработки, выполните следующие действия в Matlab вне среды NMp_template:
      1. Укажите имя образца. Set config = NM_config(процесс;образец).
      2. Выполните любой из шагов предварительной обработки, указав NM_process(config,stage) и укажите этап, используя интенсивность, выравнивание или сшивание для любого из процессов. Проверьте выходной каталог на наличие выходных файлов для каждого из этапов (рисунок 3 и рисунок 4).
4. Анализ изображений
   1. До NuMorph
      1. Начните с 3D-изображения атласа и связанного с ним изображения аннотации, которое присваивает каждый воксель определенной структуре.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь используется атлас мозга мыши P4 Allen Developmental, созданный на основе MagellanMapper³⁰ .
      2. Выровняйте изображение атласа и файл аннотации, чтобы убедиться, что они правильно совпадают в правильной ориентации.
   2. В городе НуМорф
      ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь, когда атлас и его аннотации выровнены правильно, файлы должны быть «обработаны» или обработаны в NuMorph, чтобы их можно было сохранить для последующего использования. Для этого используйте функцию munge_atlas для указания входных данных, как показано ниже.
      1. Укажите Atlas_file: (строка). Укажите полный путь к файлу атласа.
      2. Укажите Annotation_file: (строка). Укажите полный путь к связанным аннотациям.
      3. Укажите разрешение: (1x3 числовым). Укажите разрешение атласа y,x,z как микрон на пиксель.
      4. Укажите ориентацию: (1 x 3 символа). Обеспечьте ориентацию атласа и убедитесь, что он соответствует расположению образца в люльке (передний(a)/задний(p),верхний(s)/нижний(i),левый(l)/правый(r)).
      5. Укажите полушарие: укажите, какое полушарие мозга было изображено («левое», «правое», «оба», «нет»).
      6. Укажите out_resolution:(int). Укажите изотропное разрешение вывода атласа в микронах. (по умолчанию: 25).
      7. Выполните команду «munge_atlas(atlas_file, annotation_file, разрешение, ориентация, полушарие)», чтобы создать рукописные аннотации в /data/annotation_data и копию изображения атласа в /data/atlas.
      8. Прочитайте структуру Matlab и файл атласа, чтобы убедиться, что оба файла правильно обработаны в правильной ориентации.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительный этап классификации клеток может быть выполнен для количественной оценки типов клеток на основе совместной локализации иммуномаркированных белковых маркеров.
   3. Пересчета
      1. В NMa_template задайте значение ресамплинга изображений = true, если выполняется регистрация изображений для ссылки на атлас или для создания понижаемых объемов наборов данных с высоким разрешением.
         ПРИМЕЧАНИЕ: NMa_template.m будет использоваться для установки параметров для ресамплинга, регистрации, обнаружения ядер и подсчета клеток.
      2. Установите разрешение ресамплинга в соответствии с атласом.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь используется изотропное разрешение 25 мкм³/воксель, поскольку справочный атлас находится на этом разрешении.
      3. Укажите номер канала для ресамплинга с помощью каналов ресамплинга = [ ].
         ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь номер канала устанавливается в соответствии с ядерным каналом. Если этот параметр пуст, будет ресамплирован только канал регистрации.
   4. Регистрация
      1. В NMa_template задайте значение регистровых изображений = true. Установите значение true, если требуется регистрация. Если нет, задайте значение registration = false.
      2. Укажите файл атласа, соответствующий файлу в каталоге атласа.
      3. Задайте параметры регистрации = по умолчанию.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Этот вариант использует аффину, за которой следует сплайн-преобразование B, для оценки пространственного соответствия. В противном случае определите новый набор регистрационных параметров через Elastix в /data/elastix_parameter_files/atlas_registration.
      4. Установите значение сохранить зарегистрированные изображения = true.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Выходные файлы регистрации и ресамплинга могут быть загружены и визуально проверены в Matlab или других инструментах визуализации, таких как FIJI³¹.
   5. Обнаружение ядер, подсчет и классификация клеток
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ошибки, возникающие здесь, могут быть вызваны неправильным указанием файла аннотаций или несоответствием возраста образца правильной аннотации.
      1. В NMa_template задайте количество ядер и классифицируйте клетки = true.
      2. Метод set count = 3dunet.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Эта опция позволяет использовать обученную модель 3D-Unet¹⁹. В противном случае выберите гессенский, который использует гессенский метод обнаружения больших двоичных объектов.
      3. Установите min_intensity , чтобы определить минимальное пороговое значение интенсивности для обнаруженных объектов.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Соответствующий порог определяется эмпирически на основе отношения сигнал/шум ядерной маркировки.
      4. Установите classify_method любое пороговое значение, которое основано на неконтролируемой интенсивности флуоресценции в центроидных положениях или svm, который моделирует контролируемый линейный классификатор машины опорных векторов (SVM).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг классифицирует все обнаруженные клетки на четыре основных класса с 3-канальной визуализацией. С помощью этого протокола генерируются Ctip2⁺/Brn2^-, Ctip2^-/Brn2⁺, Ctip2^-/Brn2^- и Выбросы.
   6. Этапы анализа
      1. Укажите имя образца. Set config =NM_config(analyze,sample).
      2. Выполните любой из этапов анализа, указав NM_analyze(config,stage) и укажите этап с помощью ресамплинга, регистрации, подсчета или классификации. Проверьте выходной каталог на наличие выходных файлов для каждого из этапов (рисунок 5).
   7. Классификация по типам клеток и групповой анализ
      1. В NMe_template задайте значение update = true и перезапишите всю предыдущую рассчитанную статистику.
         ПРИМЕЧАНИЕ: NMe_template.m предоставляет возможность выполнять групповой анализ клеточного типа в областях мозга одного и того же анализируемого мозга.
      2. Установите compare_structures_by индекс для сравнения по всем уникальным аннотациям или таблицу для сравнения структур в соответствии с таблицей.
      3. Задайте template_file, который задает все возможные индексы структуры и должен существовать в /annotations.
      4. Задайте structure_table и укажите структуры для оценки.
      5. Укажите подсчет ячеек и классификацию типов ячеек, как описано в NMa_template.м.
      6. Установите compare_groups , чтобы указать группы для сравнения.
      7. Установите значение true или false для выполнения парного t-теста или t-теста с двумя образцами.
   8. Запустите анализ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы выполнить этот шаг, выполните следующее в Matlab вне среды NMe_template.m.
      1. Укажите имя образца. Set config =NM_config(evaluate;sample).
      2. Выполните этап анализа, указав NM_evaluate(config,stage) и укажите этап. Проверьте выходной каталог на наличие выходных файлов для группового анализа.

Результаты

Поскольку протокол iDISCO+ вводит значительную усадку тканей, которая легко заметна на глаз (рисунок 2B), мы добавили этап МРТ в этот конвейер перед очисткой ткани, чтобы количественно оценить усадку, вызванную очисткой ткани. Рабочий процесс начинается с удаления немозгово...

Обсуждение

Методы очистки тканей являются полезными методами измерения 3D-клеточной организации мозга. Существует множество методов очистки тканей, описанных в литературе, каждый со своими преимуществами и ограничениями 6,7,8,9....

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bruker 9.4T/30 cm MRI Scanner	Bruker Biospec		Horizontal Bore Animal MRI System
Dibenzyl ether	Sigma-Aldrich	108014-1KG
Dichloromethane (DCM)	Sigma-Aldrich	270997-1L
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher-Scientific	ICN19605590
Donkey serum	Sigma-Aldrich	S30-100ML
EVO 860 4TB external SSD
Fomblin Y	Speciality Fluids Company	YL-VAC-25-6	perfluoropolyether lubricant
gadolinium contrast agent (ProHance)	Bracco Diagnostics	A9576
gadolinium contrast agent(ProHance)	Bracco Diagnostics	0270-1111-03
GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPU	EVGA	08G-P4-6286-KR
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126-500G
Heparin sodium salt	Sigma-Aldrich	H3393-10KU	Dissolved in H2O to 10 mg/mL
Hydrogen peroxide solution, 30%	Sigma-Aldrich	H1009-100ML
ImSpector Pro	LaVision BioTec		Microscope image acquisition software
ITK Snap			segmentation software
Methanol	Fisher-Scientific	A412SK-4
MVPLAPO 2x/0.5 NA Objective	Olympus
Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA)	Sigma-Aldrich	30525-89-4	Dissolved in 1x PBS to 4%
Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)	Corning	46-013-CM	Diluted to 1x in H2O
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	S2002-100G	Dissolved in H2O to 10%
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750-10G
Tergitol type NP-40	Sigma-Aldrich	NP40S-100ML
TritonX-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ML
Tween-20	Fisher-Scientific	BP337 500
Ultramicroscope II Light Sheet Microscope	LaVision BioTec
Xeon Processor E5-2690 v4	Intel	E5-2690
Zyla sCMOS Camera	Andor		Complementary metal oxide semiconductor camera
Antibody			Working concentration
Alexa Fluor Goat 790 Anti-Rabbit	Thermofisher Scientific	A11369	(1:50)
Alexa Fluor Goat 568 Anti-Rat	Thermofisher Scientific	A11077	(1:200)
Rat anti-Ctip2	Abcam	ab18465	(1:400)
Rabbit anti-Brn2	Cell Signaling Technology	12137	(1:100)
To-Pro 3 (TP3)	Thermofisher Scientific	T3605	(1:400)