Imagem de célula única de cérebro inteiro e análise de cérebros de camundongos neonatais intactos usando ressonância magnética, limpeza de tecidos e microscopia de folha de luz

Resumo

Este protocolo descreve métodos para a realização de ressonância magnética, limpeza e imunomarcação de cérebros de camundongos intactos usando iDISCO+, seguido por uma descrição detalhada de imagens usando microscopia de folha de luz e análises a jusante usando NuMorph.

Resumo

A limpeza tecidual seguida de microscopia de folha de luz (LSFM) permite a imagem de resolução celular da estrutura cerebral intacta, permitindo a análise quantitativa de mudanças estruturais causadas por perturbações genéticas ou ambientais. A imagem de todo o cérebro resulta em quantificação mais precisa das células e no estudo de diferenças específicas da região que podem ser perdidas com a microscopia comumente usada de tecido fisicamente seccionado. O uso de microscopia de folha de luz para visualizar cérebros limpos aumenta muito a velocidade de aquisição em comparação com a microscopia confocal. Embora essas imagens produzam quantidades muito grandes de dados estruturais cerebrais, a maioria das ferramentas computacionais que realizam a quantificação de características em imagens de tecido limpo são limitadas à contagem de populações de células esparsas, em vez de todos os núcleos.

Aqui, demonstramos o NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), um grupo de ferramentas de análise, para quantificar todos os núcleos e marcadores nucleares dentro de regiões anotadas de um cérebro de rato pós-natal dia 4 (P4) após limpeza e imagem em um microscópio de folha de luz. Descrevemos a ressonância magnética (RM) para medir o volume cerebral antes do encolhimento causado pelas etapas de desidratação da limpeza do tecido, limpeza do tecido usando o método iDISCO +, incluindo imunomarcação, seguida de microscopia de folha de luz usando uma plataforma comercialmente disponível para visualizar cérebros de camundongos em resolução celular. Em seguida, demonstramos esse pipeline de análise de imagem usando o NuMorph, que é usado para corrigir diferenças de intensidade, costurar blocos de imagem, alinhar vários canais, contar núcleos e anotar regiões cerebrais por meio do registro em atlas disponíveis publicamente.

Projetamos essa abordagem usando protocolos e softwares disponíveis publicamente, permitindo que qualquer pesquisador com o microscópio e os recursos computacionais necessários para realizar essas técnicas. Essas ferramentas de limpeza de tecidos, imagens e computação permitem a medição e quantificação da organização tridimensional (3D) dos tipos de células no córtex e devem ser amplamente aplicáveis a qualquer projeto de estudo de camundongo do tipo selvagem / knockout.

Introdução

A imagem de todo o cérebro em resolução de célula única é um desafio importante na neurociência. As imagens cerebrais de resolução celular permitem a análise detalhada e o mapeamento em nível de sistema dos circuitos cerebrais e como esses circuitos são interrompidos por fatores de risco genéticos ou ambientais para distúrbios neuropsiquiátricos, comportamento celular em embriões em desenvolvimento, bem como circuitos neurais no cérebro adulto ^1,2,3. Existem vários métodos histológicos que permitem imagens de alta resolução do cérebro 3D reconstruído; no entanto, essas técnicas requerem equipamentos caros e especializados, podem não ser compatíveis com a imunomarcação e a natureza bidimensional (2D) de alguns métodos pode levar a danos teciduais e cisalhamento durante a seccionamento ^4,5.

Avanços recentes forneceram uma abordagem alternativa para a imagem de cérebros inteiros que não requer seccionamento de tecidos; eles envolvem o uso de limpeza de tecidos para tornar os cérebros transparentes. A transparência é alcançada na maioria dos métodos de limpeza tecidual tanto pela remoção de lipídios, pois eles são uma importante fonte de espalhamento de luz, quanto pela correspondência do índice de refração (IR) do objeto com o IR da solução de imersão da amostra durante a imagem. A luz pode então passar através da fronteira entre os materiais sem ser espalhada 6,7,8,9.

Métodos de clareamento tecidual, como o iDISCO+, são frequentemente combinados com imagens 3D rápidas usando microscopia de excitação de fóton único, como LSFM 6,7,10. Dentro de tecidos transparentes marcados com fluoróforo, as imagens de microscopia de fluorescência de folha de luz são seções por excitação com um plano fino de luz¹¹. A principal vantagem do LSFM é que uma única seção óptica é iluminada de cada vez, com toda a fluorescência das moléculas dentro dessa seção sendo excitada, o que minimiza o fotobranqueamento. Além disso, a imagem de uma fatia óptica inteira permite a detecção baseada em câmera dessa fatia excitada, aumentando a velocidade em relação à varredura pontual¹². O LSFM produz de forma não destrutiva seções ópticas bem registradas que são adequadas para reconstrução 3D.

Embora o método iDISCO+ permita a limpeza de tecidos de baixo custo dentro de ~3 semanas, as etapas de desidratação dentro do protocolo podem levar ao encolhimento tecidual e potencial alteração da morfologia da amostra, afetando assim as medidas volumétricas ^6,10. A adição de um método de imagem secundário, como a ressonância magnética, a ser usado antes do procedimento de limpeza de tecidos pode medir o grau de encolhimento induzido pela limpeza tecidual em toda a amostra. Durante as etapas de desidratação, diferenças nas propriedades mecânicas entre a substância cinzenta e a substância branca podem levar a deformações não uniformes da substância cerebral, resultando em deformações de volume induzidas por clareamento tecidual diferentes entre amostras do tipo selvagem e mutantes e podem confundir interpretações de diferenças volumétricas nessas amostras^10,13 . A RNM é realizada primeiro perfundindo o animal com um agente de contraste (por exemplo, gadolínio), seguido pela incubação do tecido extraído de interesse em uma solução de imersão (por exemplo, fomblin) antes da imagem¹⁴. A RNM é compatível com a limpeza tecidual e a realização de LSFM na mesma amostra.

O LSFM é frequentemente usado para criar imagens de microscopia em larga escala para visualização qualitativa do tecido cerebral de interesse, em vez de avaliação quantitativa da estrutura cerebral (Figura 1). Sem avaliação quantitativa, é difícil demonstrar diferenças estruturais resultantes de insultos genéticos ou ambientais. À medida que as tecnologias de limpeza de tecidos e imagem melhoram, juntamente com a diminuição dos custos de armazenamento e poder de computação, a quantificação das localizações de tipo celular dentro do tecido de interesse está se tornando mais acessível, permitindo que mais pesquisadores incluam esses dados em seus estudos.

Com mais de 100 milhões de células no cérebro do rato¹⁵ e sessões de imagem de todo o cérebro que podem gerar terabytes de dados, há uma demanda crescente por ferramentas avançadas de análise de imagem que permitem a quantificação precisa de recursos dentro das imagens, como células. Existe uma série de métodos de segmentação para imagens limpas por tecidos que aplicam limiares para intensidade de coloração nuclear e filtram objetos com formas, tamanhos ou densidades predefinidos^10,16,17,18. No entanto, interpretações imprecisas dos resultados podem surgir de variações em parâmetros como tamanho da célula, contraste da imagem e intensidade da rotulagem. Este artigo descreve nosso protocolo estabelecido para quantificar núcleos celulares no cérebro de camundongos. Primeiro, detalhamos as etapas para a coleta de tecidos do cérebro de camundongo P4, seguidas por um protocolo de limpeza tecidual e imunomarcação otimizado a partir do método iDISCO+^{disponível publicamente 10}. Em segundo lugar, descrevemos a aquisição de imagens usando ressonância magnética e microscopia de folha de luz, incluindo os parâmetros utilizados para a captura de imagens. Finalmente, descrevemos e demonstramos o NuMorph¹⁹, um conjunto de ferramentas de análise de imagens que nosso grupo desenvolveu que permite quantificação específica do tipo celular após a limpeza tecidual, imunomarcação com marcadores nucleares e imagem de folha de luz de regiões anotadas.

Protocolo

Todos os camundongos foram utilizados de acordo com e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill.

1. Dissecção e perfusão do rato

NOTA: As seguintes dissecções foram realizadas em camundongos P4 e P14 usando uma seringa. O volume de fluido de perfusão irá variar dependendo da idade do animal.

1. Perfusão
   CUIDADO: O paraformaldeído (PFA) é um produto químico perigoso. Execute todas as etapas de perfusão em um exaustor químico.
   1. Antes da cirurgia, administrar pentobarbital via injeção intraperitoneal (100 mg/kg) e permitir que o anestésico faça efeito.
   2. Uma vez que o animal tenha atingido um plano cirúrgico de anestesia, use o método de resposta de beliscar o dedo do pé para confirmar a falta de resposta.
   3. Faça uma incisão lateral sob a caixa torácica para expor a cavidade torácica do animal.
   4. Usando uma tesoura cirúrgica curva, corte cuidadosamente a caixa torácica até a clavícula de um lado do animal e faça um corte idêntico no lado oposto, permitindo que o esterno seja levantado, expondo o coração.
   5. Sem danificar a aorta descendente, corte cuidadosamente qualquer tecido conectado ao coração antes de fazer uma pequena incisão no átrio direito para permitir que o sangue flua para fora da vasculatura.
   6. Usando um método baseado em seringa, perfundir o camundongo através do ventrículo esquerdo com 10 mL e 7 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) para P14 e P4, respectivamente, com uma taxa de perfusão de 1,5 mL/min através do sistema.
   7. Uma vez que o sangue esteja limpo, perfundir novamente com 10 mL de PBS + 4% PFA e 7 mL de PBS + 4% PFA para P14 e P4, respectivamente, a 4 °C com uma taxa de perfusão de 1,5 mL/min para fixar o animal.
      NOTA: Tremores de fixação serão observados, e o animal ficará rígido após a conclusão. Se estiver usando a RNM em amostras, perfunda com volumes semelhantes de PBS e PFA para cada ponto de tempo + agente de contraste de RM à base de gadolínio a 20% na solução de PFA.
   8. Retirar a cabeça com tesoura cirúrgica e drop-fix com PBS + 4% PFA durante 24 h a 4 °C para fixação completa.
      NOTA: Nesta fase, o cérebro permanece intacto com o crânio ligado (ver secção 2). Ponto de pausa: os cérebros podem ser armazenados por vários meses nesta fase em PBS + azida de sódio a 0,1% a 4 °C.

2. Imagem da estrutura cerebral grosseira baseada em RM com crânio intacto e análise

NOTA: O cérebro deve ser perfundido e incubado em gadolínio, conforme descrito acima, sem ser removido do crânio. Toda a ressonância magnética ocorre antes da remoção do cérebro do crânio para evitar a perda de tecido não intencional durante a dissecção. A imagem com um crânio intacto também fornece suporte ao cérebro no suporte da amostra (ou seja, seringa) durante a preparação da amostra e a imagem.

1. Preparação da amostra
   Observação : as etapas a seguir são otimizadas para amostras de cérebro de mouse P4 e P14. O tamanho da seringa necessário dependerá do tamanho físico da amostra.
   1. Ao realizar a RM na amostra, retire a pele do crânio e incube em PBS + gadolínio a 3% por 23 dias a 4 °C antes da imagem¹⁴. Após 23 dias, enxaguar as amostras rapidamente em PBS.
   2. Use seringas de 5 mL para criar um suporte de amostra para ressonância magnética, usando pistões de seringa para fechar cada extremidade do suporte feito com a seringa²⁰. Use peças de plástico para manter o crânio firmemente no lugar no suporte (Figura 2A). Remova as marcas na seringa com etanol para evitar artefatos após a imagem.
   3. Coloque com segurança o crânio no suporte da amostra e preencha com uma solução de imersão compatível com ressonância magnética (ver Tabela de Materiais). Feche o suporte e remova todas as bolhas de ar usando uma seringa.
      NOTA: Ponto de pausa: O crânio pode ser armazenado na solução de imersão por vários meses antes da imagem.
2. Imagem da estrutura cerebral grosseira (MRI)
   1. Fotografar as amostras com um sistema de RM animal de 9,4T/30 cm de diâmetro horizontal, utilizando uma bobina de volume de 15 mm e uma sequência baseada em spin-echo com os seguintes parâmetros: Resolução espacial: 60 μm x 60 μm x 60 μm; tempo total de varredura: 7 h 12 min; tempo de eco (TE): 6,83 ms; tempo de repetição (TR): 40 ms; excitação/refocalização dos ângulos de inversão: 90/180 graus; tamanho da imagem: 166 x 168 x 209 voxels; Campo de visão (FOV): 9,9 mm x 10,1 mm x 12,4 mm; largura de banda: 100.000 kHz.
3. Análise computacional da estrutura cerebral grosseira
   1. Remova o crânio circundante de imagens brutas de ressonância magnética rastreando manualmente o cérebro do rato usando um software de segmentação. Em seguida, aplique a operação de multiplicação em termos de voxel entre a imagem da máscara e a imagem de ressonância magnética bruta para gerar a imagem de ressonância magnética cerebral despojada do crânio.
      NOTA: A saída é uma imagem de máscara binária onde a intensidade para voxels cerebrais é definida como 1 e 0 caso contrário.
   2. Aplicar registro de imagem rígido (estimando apenas translação e rotação) usando 'flerte' no pacote FSL^21,22 para alinhar a imagem de ressonância magnética despojada do crânio (imagem em movimento) à imagem de microscopia de folha de luz correspondente (imagem de referência).
   3. Aplique o registro não rígido (usando 'SyN' no software ANTS²³) para encontrar as correspondências ponto-a-ponto entre a imagem de ressonância magnética alinhada rigidamente na etapa 2.3.2 para a imagem da folha de luz (mesma imagem de referência na etapa 2.3.2).
      NOTA: A saída inclui a imagem de ressonância magnética distorcida e o campo de deformação associado às mudanças de volume da ressonância magnética para as imagens da folha de luz.
   4. Calcule o determinante jacobiano no campo de deformação gerado na etapa 2.3.3, que quantifica a mudança de volume em uma vizinhança local de voxel 3 x 3 x 3.
   5. Alinhe imagens despojadas de crânio ao Allen Developmental Mouse Brain Atlas usando registro de imagem deformável.
      NOTA: A correspondência espacial ponto-a-ponto estabelecida permite a anotação automática de regiões cerebrais de interesse na nova imagem do mouse (Figura 2C-H).

3. Dissecção cerebral do crânio

1. Faça uma incisão na linha média ao longo do topo do crânio, do pescoço ao nariz, para expor o crânio.
2. Exponha a base do crânio aparando o músculo restante do pescoço e todos os outros músculos residuais.
3. Usando tesoura cirúrgica afiada, cuidadosamente cortada ao longo da superfície interna do crânio, tomando cuidado para não danificar o cérebro, mantendo uma pressão ascendente suave durante o corte com o equipamento cirúrgico afiado.
4. Use pinças para descascar as duas metades cortadas do crânio para longe do cérebro e cortar cuidadosamente o excesso de gordura ligado ao cérebro.
5. Use uma tesoura cirúrgica para aparar qualquer dura-máter que conecte o cérebro ao crânio e, em seguida, use uma espátula para remover suavemente o cérebro da cabeça.
6. Remova o cérebro, lave com PBS e, em seguida, troque para PBS com azida de sódio a 0,1% e mantenha a 4 °C para armazenamento a longo prazo.

4. Limpeza de tecidos

NOTA: Este protocolo é adaptado do protocolo iDISCO+ para ratos P4⁶, com pequenas alterações. Alguns detalhes podem mudar para diferentes pontos de tempo/espécies/experimentos). CUIDADO: Metanol, diclorometano (DCM) e éter dibenzílico (DBE) são produtos químicos perigosos. Essas etapas de limpeza de tecido são realizadas em um exaustor químico.

1. Validação de anticorpos
   NOTA: A compatibilidade com metanol de anticorpos não testados precisa ser verificada, pois eles podem ser afetados negativamente pelas lavagens severas de metanol exigidas no protocolo iDISCO+. Para obter uma lista de anticorpos que demonstraram funcionar no iDISCO+, consulte o site²⁴.
   1. Colha 10 μm de seções congeladas do tecido fixo em PFA de interesse em lâminas estereológicas.
   2. Incubar as seções em metanol a 100% por 3 h à temperatura ambiente.
   3. Reidratar em PBS antes de prosseguir com protocolos imuno-histoquímicos padrão para determinar se o anticorpo mostra o padrão esperado de fluorescência após lavagens com metanol. Para controle positivo, use uma lâmina não tratada com metanol.
2. Preparação do buffer
   1. Prepare buffers de acordo com o protocolo oficial iDISCO. Consulte a Tabela de Materiais para composição dos buffers e outras soluções utilizadas neste protocolo.
3. Pré-tratamento
   1. Desidratar a amostra com metanol/PBS série: 20%, 40%, 60%, 80%, 100%; 1 h cada à temperatura ambiente.
      NOTA: O uso de PBS durante a desidratação ajuda a evitar rachaduras das amostras em lavagens com metanol.
   2. Lavar a amostra em metanol a 100% durante 1 h e, em seguida, arrefecer a 4 °C durante 1 h antes de incubar durante a noite com agitação em metanol a 66% DCM/33% à temperatura ambiente.
   3. Lavar a amostra 2x em metanol a 100% à temperatura ambiente e, em seguida, arrefecer a 4 °C.
   4. Utilizar 5% H 2 O₂frescos em metanol para branquear a amostra durante a noite a 4 °C.
   5. Reidratar a amostra com metanol/PBS série: 80%, 60%, 40%, 20%, PBS; 1 h cada à temperatura ambiente e lavar 2x por 1 h em PTx.2 à temperatura ambiente.
   6. Incubar a amostra em 1x PBS/0,2% TritonX-100/20% DMSO a 37 °C durante a noite.
   7. Incubar a amostra em 1x PBS/0,1% Tween-20/0,1% TritonX-100/0,1% Desoxicolato/0,1% NP40/20% DMSO a 37 °C durante a noite.
   8. Lavar em PTx.2 à temperatura ambiente durante 1 h duas vezes.
4. Imunomarcação
   1. Incubar as amostras em Solução de Permeabilização a 37 °C durante 2 dias (~48 h).
   2. Bloquear as amostras em Solução de Bloqueio a 37 °C durante 2 dias (~48 h).
   3. Incubar as amostras com anticorpo primário em PTwH / 5%DMSO / 3% de soro a 37 °C por 4 dias (~96 h) (por exemplo, coelho (Rb) Brn2/POU3F2 mAb (1:100) e anticorpo anti-Ctip2 rato(Rt) (1:400) (Tabela de Materiais).
   4. Lave 3 x 1 h em PTwH. Lave por mais 2 h em PTwH. Deixe na solução de lavagem durante a noite à temperatura ambiente.
   5. Incubar as amostras com anticorpo secundário e um corante nuclear, como TO-PRO-3, em PTwH/soro a 3% a 37 °C por 4 dias (~96 h; por exemplo, anti-Rb de cabra(1:50) e (anti-Rt(1:200)) (Tabela de Materiais).
   6. Lave 3 x 1 h em PTwH Lave por mais 2 h em PTwH. Deixe na solução de lavagem durante a noite à temperatura ambiente.
5. Clareira
   1. Desidratar em metanol/PBS série -20%, 40%, 60%, 80%, 100%-1 h cada um à temperatura ambiente. Incubar por 3 h, com agitação, em 66% DCM / 33% metanol à temperatura ambiente.
      NOTA: A amostra pode ser deixada durante a noite à temperatura ambiente imediatamente após a desidratação em metanol a 100%.
   2. Incubar em 100% DCM durante 15 min duas vezes à temperatura ambiente (com agitação) para lavar o MeOH.
   3. Incubar em éter dibenzílico (DBE) sem agitar à temperatura ambiente. Certifique-se de que o tubo está preenchido quase completamente com DBE para evitar a oxidação da amostra. Termine de misturar a solução invertendo algumas vezes antes da imagem.

5. Imagem de folha de luz

NOTA: Os cérebros limpos por tecido iDISCO foram fotografados com um microscópio de folha de luz, equipado com uma objetiva de NA 2X/0,5, uma câmera semicondutora complementar de óxido metálico e software de operação e aquisição de imagens de microscópio a 0,75 x 0,75 x 4 μm/voxel para o ponto de tempo P4, pois isso permitiu a resolução de célula única dentro do córtex (Figura 3A,B).

1. Montagem da amostra
   1. Montar cuidadosamente a amostra no suporte de tamanho de amostra correto de modo que a amostra seja orientada com a dimensão z não superior a 5,2 mm de profundidade devido à distância nominal de trabalho do microscópio de folha de luz (5,7 mm menos margem de segurança de 0,5 mm)²⁵.
   2. Coloque no suporte da amostra com o parafuso do suporte em um ângulo de 45° em relação aos suportes do berço (Figura 1B). Posicione o berço de modo que o caminho da luz seja perpendicular à amostra (Figura 1C).
2. Parâmetros de imagem
   1. Defina o corpo de zoom no microscópio para ampliação de 4x ou superior, produzindo 0,75 μm/pixel.
      NOTA: As análises computacionais de célula única em imagens de folha de luz P4 podem ser feitas com qualquer microscópio de folha de luz comercialmente disponível que permita uma resolução de 0,75 x 0,75 x 4 μm/voxel ou superior. Uma resolução mais baixa é suficiente para cérebros em pontos de tempo posteriores em que os núcleos são mais esparsamente distribuídos.
   2. No software de aquisição de imagem, selecione uma única folha de luz com um NA = ~0,08 (espessura de 9 μm/passo z de 4 μm).
      NOTA: Esta configuração combinada com o foco dinâmico horizontal permite imagens de todo o cérebro em uma resolução de célula única de um cérebro de rato dentro de um tempo razoável. Para um dia pós-natal 4 (P4) cerebral, o tempo de aquisição de imagem é estimado em 11-15 h para três canais, dependendo do tamanho do cérebro.
   3. Para garantir que a resolução axial seja mantida ao longo da largura da imagem, selecione Foco dinâmico horizontal e aplique o número recomendado de etapas, dependendo do comprimento de onda do laser. Para um cérebro inteiro de rato P4, defina o foco dinâmico horizontal para 11. Ajuste o foco fino para cada canal em relação ao canal de registro.
      NOTA: Aqui, o canal TO-PRO-3 (647 nm) é registrado no Allen Developmental Mouse Brain Atlas, pois isso rotula todos os núcleos.
   4. Ajuste a potência do laser por canal em relação às propriedades do canal.
      NOTA: Comprimentos de onda mais longos requerem maior potência do laser em comparação com comprimentos de onda mais curtos. Por exemplo, o 780 nm precisa ser fotografado com uma alta potência de laser (70% - 75%) e baixa exposição (50 ms), enquanto o canal de 647 nm requer uma potência média do laser (40% - 45%) e baixa exposição (50 ms).
   5. Ajuste a largura da folha de luz para ~50% para garantir que a potência da folha seja distribuída de forma ideal na dimensão y para esse tamanho de amostra.
      NOTA: Em combinação com o foco dinâmico horizontal, uma largura de folha de 50% fornece uma distribuição média de energia em toda a imagem com um risco reduzido de fotobranqueamento²⁵.
   6. Defina o Número de Blocos em relação ao tamanho da amostra com uma Sobreposição recomendada de 15% entre blocos e capture imagens para cada canal sequencialmente para cada pilha em uma determinada posição de bloco.

6. Processamento de imagens usando NuMorph

NOTA: O pipeline NuMorph tem três partes principais para análise de imagens 3D: pré-processamento, análise e avaliação. Essas partes foram organizadas em NMp_template.m, NMa_template.m, e NMe_template.m, respectivamente, que são discutidas abaixo. Além disso, NM_setup.m é adicionado para baixar e instalar pacotes de software necessários para que o NuMorph funcione sem problemas. NM_samples.m também fornece um modelo para inserir informações de aquisição de imagens.

1. Configuração do NuMorph
   1. Baixe e instale o gerenciador de ambiente conda para Linux²⁶. Baixe e instale as ferramentas de processamento de imagem do NuMorph¹⁹ .
   2. Na linha de comando, execute o Matlab. Execute NM_setup.m do NuMorph para baixar e instalar pacotes de software de análise de imagem necessários para análises.
      NOTA: Esta etapa garante que o ambiente conda esteja configurado corretamente, bem como garante que todas as ferramentas e complementos necessários para o Matlab executar cada um dos três pipelines sejam baixados e instalados corretamente. Os mais notáveis aqui são Elastix para executar o registro e 3D-Unet para detecção e contagem de células.
2. Especifique nomes de amostra, diretórios de entrada e saída, informações de canal e parâmetros de imagem de folha de luz editando o arquivo NM_samples.m.
   Observação : aqui, recomenda-se verificar novamente para certificar-se de que as informações corretas, especialmente o diretório de entrada de imagem, são especificadas corretamente. Os erros geralmente não são chamados aqui até a execução das etapas subsequentes.
3. Pré-processamento de imagem
   1. Ajuste de intensidade
      1. No NMp_template, defina ajuste de intensidade = verdadeiro.
         NOTA: Defina como true se o ajuste de intensidade for necessário. Caso contrário, defina ajuste de intensidade = false. Há também uma opção para usar 'update' para substituir os parâmetros de ajuste anteriores.
      2. Defina usar imagens processadas = false ao trabalhar com um novo conjunto de imagens. Caso contrário, indique quaisquer conjuntos de dados de imagem salvos anteriormente no diretório de saída (por exemplo, "alinhado", "costurado") a ser usado para as etapas de processamento subsequentes.
         Observação : essa opção é fornecida no caso em que as imagens de entrada já foram pré-processadas. Nesse caso, as imagens pré-processadas serão usadas como imagens de entrada e a opção será definida como o nome do subdiretório no diretório de saída.
      3. Defina salvar imagens = true.
         Observação : usando essa opção garante que as imagens processadas são salvas no diretório de saída; caso contrário, somente os parâmetros serão calculados e salvos.
      4. Defina salvar amostras = true.
         Observação : essa opção garante que os resultados de exemplo sejam salvos para cada etapa principal.
      5. Defina ajustar sombreamento de azulejo = básico para aplicar a correção de sombreamento usando o algoritmo BaSiC²⁷ ou manual para aplicar a correção de sombreamento de azulejo usando medições do microscópio de folha de luz em larguras específicas de folha de luz.
         NOTA: Esta opção corrige a iluminação irregular ao longo da dimensão y causada pela forma da cintura da folha.
   2. Alinhamento do canal de imagem
      1. Em NMp_template, defina alinhamento de canal = true. Defina essa opção como true se o alinhamento do canal for necessário. Caso contrário, defina como false. Defina o método de alinhamento do canal para tradução (rígida) ou elastix (não rígida).
         NOTA: O método de translação utiliza abordagens rígidas de registro 2D no alinhamento de múltiplos canais, enquanto o método elastix utiliza B-splines não rígidas²⁸ para corrigir a deriva rotacional, o que pode ocorrer durante a aquisição de imagens longas¹⁹.
   3. Costura de imagem iterativa
      1. Em NMp_template, defina stitch images = true.
         Observação : defina essa opção como true se a costura for necessária.
      2. Definir refinamento de peneira = verdadeiro.
         Observação : essa opção é usada para refinar ainda mais a tradução em xy usando a transformação de recurso invariante de escala²⁹.
      3. Defina parâmetros de alinhamento de carga = true.
         NOTA: Esta opção utiliza as traduções de alinhamento de canal durante a costura. Essa opção é recomendada com imagens multicanal. Caso contrário, defina como false.
      4. Defina sobreposição = 0,15 para corresponder às sobreposições de blocos durante a geração de imagens.
   4. Para executar qualquer uma dessas etapas de pré-processamento, execute o seguinte no Matlab fora NMp_template ambiente:
      1. Especifique o nome do exemplo. Defina config = NM_config(process,sample).
      2. Execute qualquer uma das etapas de pré-processamento especificando NM_process(config,stage) e especifique o estágio usando intensidade, alinhamento ou ponto para qualquer um dos processos. Verifique se há arquivos de saída no diretório de saída para cada um dos estágios (Figura 3 e Figura 4).
4. Análise de imagem
   1. Antes do NuMorph
      1. Comece com uma imagem de atlas 3D e uma imagem de anotação associada que atribui cada voxel a uma estrutura específica.
         NOTA: O P4 Allen Developmental Mouse Brain Atlas gerado a partir do MagellanMapper³⁰ é usado aqui.
      2. Alinhe a imagem do atlas e o arquivo de anotações para garantir que eles correspondam corretamente na orientação correta.
   2. Dentro do NuMorph
      NOTA: Agora que o atlas e suas anotações estão alinhados corretamente, os arquivos precisam ser "enfeitados" ou processados no NuMorph para que possam ser salvos para uso posterior. Para fazer isso, use a função munge_atlas para especificar entradas, conforme mostrado abaixo.
      1. Especifique Atlas_file: (cadeia de caracteres). Forneça o caminho completo para o arquivo atlas.
      2. Especifique Annotation_file: (cadeia de caracteres). Forneça o caminho completo para as anotações associadas.
      3. Especifique a resolução: (1x3 numérico). Especifique a resolução do atlas y, x, z como mícron por pixel.
      4. Especifique a orientação: (1 x 3 caracteres). Forneça a orientação do atlas e certifique-se de que ela corresponda à configuração da amostra no berço (anterior(a)/posterior(p),superior(s)/inferior(i),esquerda(l)/direita(r)).
      5. Especificar Hemisfério: Especifique qual hemisfério cerebral foi fotografado ("esquerda", "direita", "ambos", "nenhum").
      6. Especifique out_resolution:(int). Especifique a resolução isotrópica da saída do atlas em mícrons. (padrão: 25).
      7. Execute o comando "munge_atlas(atlas_file, annotation_file, resolution, orientation, hemisphere)" para gerar anotações munged em /data/annotation_data e uma cópia da imagem do atlas em /data/atlas.
      8. Leia a estrutura do Matlab e o arquivo atlas para verificar se ambos os arquivos estão corretamente na orientação correta.
         NOTA: Uma etapa adicional de classificação celular pode ser realizada para quantificar os tipos de células com base na co-localização de marcadores proteicos imunomarcados.
   3. Reamostragem
      1. Em NMa_template, defina resample images = true, se estiver executando o registro de imagem para fazer referência ao atlas ou para gerar volumes reduzidos de conjuntos de dados de alta resolução.
         NOTA: O NMa_template.m será usado para definir os parâmetros para reamostragem, registro, detecção de núcleos e contagem de células.
      2. Defina a resolução de nova amostra para corresponder ao atlas.
         NOTA: Aqui, a resolução isotrópica^de 25 μm 3/voxel é usada porque o atlas de referência está nessa resolução.
      3. Especifique o número do canal a ser reamostrado usando a reamostragem de canais = [ ].
         NOTA: Aqui, o número do canal é definido para corresponder ao canal nuclear. Se essa opção estiver vazia, somente o canal de registro será reamostrado.
   4. Inscrição
      1. Em NMa_template, defina registrar imagens = true. Defina como true se o registro for necessário. Caso contrário, defina registro = false.
      2. Especifique o arquivo atlas para corresponder ao arquivo no diretório atlas.
      3. Defina parâmetros de registro = padrão.
         NOTA: Esta opção utiliza uma transformação afim seguida de spline B para estimar a correspondência espacial. Caso contrário, defina um novo conjunto de parâmetros de registro via Elastix em /data/elastix_parameter_files/atlas_registration.
      4. Defina salvar imagens registradas = true.
         NOTA: Os arquivos de saída do registro e da reamostragem podem ser baixados e inspecionados visualmente no Matlab ou em outras ferramentas de visualização, como o FIJI³¹.
   5. Detecção de Núcleos, Contagem de Células e Classificação
      Observação : erros que ocorrem aqui podem ser devido a não especificar o arquivo de anotações corretamente ou não corresponder a idade da amostra com a anotação correta.
      1. Em NMa_template, defina ambos os núcleos de contagem e classifique as células = verdadeiro.
      2. Método de contagem de conjunto = 3dunet.
         NOTA: Esta opção permite o uso do modelo¹⁹ 3D-Unet treinado. Caso contrário, selecione Hessian que utiliza o método de detecção de blobo Hessian.
      3. Defina min_intensity para definir um limite de intensidade mínima para objetos detectados.
         NOTA: Um limiar apropriado é determinado empiricamente com base na relação sinal-ruído da rotulagem nuclear.
      4. Defina classify_method para qualquer um dos limites, que é baseado em intensidades de fluorescência não supervisionadas em posições de centroide ou svm, que modela um classificador SVM (Support Vector Machine) linear supervisionado.
         Observação : esta etapa classificará todas as células detectadas em quatro classes principais com imagens de 3 canais. Com esse protocolo, Ctip2+/Brn2-, Ctip2-/Brn2⁺, Ctip2-/Brn2^-, e Outliers são gerados.
   6. Etapas de análise
      1. Especifique o nome do exemplo. Defina config =NM_config(analyze,sample).
      2. Execute qualquer uma das etapas de análise especificando NM_analyze(config,stage) e especifique o estágio usando reamostragem, registrar, contar ou classificar. Verifique se há arquivos de saída no diretório de saída para cada um dos estágios (Figura 5).
   7. Classificação do tipo celular e análise de grupo
      1. Em NMe_template, defina update = true e substitua todas as estatísticas anteriores calculadas.
         NOTA: O NMe_template.m fornece a opção de realizar análises de grupo de tipo celular em regiões cerebrais do mesmo cérebro que está sendo analisado.
      2. Defina compare_structures_by para índice para comparar por todas as anotações exclusivas ou tabela para comparar estruturas de acordo com a tabela.
      3. Defina o template_file, que especifica todos os índices de estrutura possíveis e deve existir em /annotations.
      4. Defina structure_table e especifique as estruturas a serem avaliadas.
      5. Especifique a contagem de células e a classificação do tipo de célula, conforme descrito em NMa_template.m.
      6. Defina compare_groups para especificar grupos a serem comparados.
      7. Defina emparelhado como verdadeiro ou falso para executar o teste t emparelhado ou o teste t de duas amostras.
   8. Executar análise.
      Observação : para executar esta etapa, execute o seguinte no Matlab fora NMe_template ambiente .m.
      1. Especifique o nome do exemplo. Defina config =NM_config(avaliar,amostra).
      2. Execute a etapa de análise especificando NM_evaluate(config,stage) e especifique o estágio. Verifique o diretório de saída para arquivos de saída para a análise de grupo.

Resultados

Como o protocolo iDISCO+ introduz um encolhimento significativo do tecido, que é facilmente perceptível pelo olho (Figura 2B), adicionamos uma etapa de ressonância magnética a esse pipeline antes da limpeza do tecido para quantificar o encolhimento induzido pelo clareamento tecidual. O fluxo de trabalho começa com a remoção do tecido não cerebral da imagem de RM (Figura 2C). Em seguida, uma transformação rígida (3 ângulos de translação e 3 ângulos...

Discussão

Os métodos de limpeza de tecidos são técnicas úteis para medir a organização celular 3D do cérebro. Há uma série de métodos de clareamento tecidual descritos na literatura, cada um com suas vantagens e limitações 6,7,8,9. As opções de ferramentas computacionais para analisar os tipos de células nas imagens limpas por tecidos são relativamente limitadas. Outras ferramentas dispon...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bruker 9.4T/30 cm MRI Scanner	Bruker Biospec		Horizontal Bore Animal MRI System
Dibenzyl ether	Sigma-Aldrich	108014-1KG
Dichloromethane (DCM)	Sigma-Aldrich	270997-1L
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher-Scientific	ICN19605590
Donkey serum	Sigma-Aldrich	S30-100ML
EVO 860 4TB external SSD
Fomblin Y	Speciality Fluids Company	YL-VAC-25-6	perfluoropolyether lubricant
gadolinium contrast agent (ProHance)	Bracco Diagnostics	A9576
gadolinium contrast agent(ProHance)	Bracco Diagnostics	0270-1111-03
GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPU	EVGA	08G-P4-6286-KR
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126-500G
Heparin sodium salt	Sigma-Aldrich	H3393-10KU	Dissolved in H2O to 10 mg/mL
Hydrogen peroxide solution, 30%	Sigma-Aldrich	H1009-100ML
ImSpector Pro	LaVision BioTec		Microscope image acquisition software
ITK Snap			segmentation software
Methanol	Fisher-Scientific	A412SK-4
MVPLAPO 2x/0.5 NA Objective	Olympus
Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA)	Sigma-Aldrich	30525-89-4	Dissolved in 1x PBS to 4%
Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)	Corning	46-013-CM	Diluted to 1x in H2O
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	S2002-100G	Dissolved in H2O to 10%
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750-10G
Tergitol type NP-40	Sigma-Aldrich	NP40S-100ML
TritonX-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ML
Tween-20	Fisher-Scientific	BP337 500
Ultramicroscope II Light Sheet Microscope	LaVision BioTec
Xeon Processor E5-2690 v4	Intel	E5-2690
Zyla sCMOS Camera	Andor		Complementary metal oxide semiconductor camera
Antibody			Working concentration
Alexa Fluor Goat 790 Anti-Rabbit	Thermofisher Scientific	A11369	(1:50)
Alexa Fluor Goat 568 Anti-Rat	Thermofisher Scientific	A11077	(1:200)
Rat anti-Ctip2	Abcam	ab18465	(1:400)
Rabbit anti-Brn2	Cell Signaling Technology	12137	(1:100)
To-Pro 3 (TP3)	Thermofisher Scientific	T3605	(1:400)