Imaging a singola cellula dell'intero cervello e analisi di cervelli di topo neonatale intatti mediante risonanza magnetica, pulizia dei tessuti e microscopia a foglio luminoso

Riepilogo

Questo protocollo descrive i metodi per condurre la risonanza magnetica, la pulizia e l'immunomarcatura di cervelli di topo intatti utilizzando iDISCO +, seguita da una descrizione dettagliata dell'imaging utilizzando la microscopia a foglio di luce e analisi a valle utilizzando NuMorph.

Abstract

La pulizia dei tessuti seguita dalla microscopia a foglio luminoso (LSFM) consente l'imaging a risoluzione cellulare della struttura cerebrale intatta, consentendo l'analisi quantitativa dei cambiamenti strutturali causati da perturbazioni genetiche o ambientali. L'imaging dell'intero cervello si traduce in una quantificazione più accurata delle cellule e nello studio delle differenze specifiche della regione che possono essere perse con la microscopia comunemente usata del tessuto fisicamente sezionato. L'uso della microscopia a foglio di luce per visualizzare i cervelli chiari aumenta notevolmente la velocità di acquisizione rispetto alla microscopia confocale. Sebbene queste immagini producano grandi quantità di dati strutturali cerebrali, la maggior parte degli strumenti computazionali che eseguono la quantificazione delle caratteristiche nelle immagini di tessuto eliminato si limitano a contare popolazioni cellulari sparse, piuttosto che tutti i nuclei.

Qui, dimostriamo NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), un gruppo di strumenti di analisi, per quantificare tutti i nuclei e i marcatori nucleari all'interno delle regioni annotate di un cervello di topo postnatale giorno 4 (P4) dopo la pulizia e l'imaging su un microscopio a foglio di luce. Descriviamo la risonanza magnetica (MRI) per misurare il volume del cervello prima del restringimento causato dalle fasi di disidratazione della pulizia dei tessuti, la pulizia dei tessuti utilizzando il metodo iDISCO +, inclusa l'immunomarcatura, seguita dalla microscopia a foglio luminoso utilizzando una piattaforma disponibile in commercio per visualizzare il cervello dei topi a risoluzione cellulare. Dimostriamo quindi questa pipeline di analisi delle immagini utilizzando NuMorph, che viene utilizzato per correggere le differenze di intensità, cucire le tessere dell'immagine, allineare più canali, contare i nuclei e annotare le regioni del cervello attraverso la registrazione agli atlanti disponibili pubblicamente.

Abbiamo progettato questo approccio utilizzando protocolli e software disponibili pubblicamente, consentendo a qualsiasi ricercatore con il microscopio e le risorse computazionali necessarie di eseguire queste tecniche. Questi strumenti di pulizia dei tessuti, imaging e calcolo consentono la misurazione e la quantificazione dell'organizzazione tridimensionale (3D) dei tipi di cellule nella corteccia e dovrebbero essere ampiamente applicabili a qualsiasi progetto di studio su topi wild-type/knockout.

Introduzione

L'imaging dell'intero cervello con risoluzione di una singola cellula è una sfida importante nelle neuroscienze. Le immagini cerebrali a risoluzione cellulare consentono un'analisi dettagliata e la mappatura a livello di sistema dei circuiti cerebrali e di come tali circuiti siano interrotti da fattori di rischio genetici o ambientali per disturbi neuropsichiatrici, comportamento cellulare negli embrioni in via di sviluppo e circuiti neurali nel cervello adulto ^1,2,3. Esistono diversi metodi istologici che consentono immagini ad alta risoluzione del cervello 3D ricostruito; tuttavia, queste tecniche richiedono attrezzature costose e specializzate, potrebbero non essere compatibili con l'immunomarcatura e la natura bidimensionale (2D) di alcuni metodi può portare a danni tissutali e taglio durante il sezionamento ^4,5.

I recenti progressi hanno fornito un approccio alternativo per l'imaging di interi cervelli che non richiede il sezionamento dei tessuti; Implicano l'uso della pulizia dei tessuti per rendere trasparente il cervello. La trasparenza si ottiene nella maggior parte dei metodi di pulizia dei tessuti sia rimuovendo i lipidi, in quanto sono una delle principali fonti di diffusione della luce, sia abbinando l'indice di rifrazione (RI) dell'oggetto con il RI della soluzione di immersione del campione durante l'imaging. La luce può quindi passare attraverso il confine tra i materiali senza essere dispersa 6,7,8,9.

I metodi di pulizia dei tessuti, come iDISCO+, sono spesso combinati con l'imaging 3D rapido utilizzando la microscopia a eccitazione a singolo fotone, come LSFM ^6,7,10. All'interno di tessuti trasparenti marcati con un fluoroforo, la microscopia a fluorescenza a foglio di luce immagini sezioni per eccitazione con un sottile piano di luce¹¹. Il vantaggio principale di LSFM è che una singola sezione ottica viene illuminata alla volta, con tutta la fluorescenza delle molecole all'interno di quella sezione eccitata, il che riduce al minimo il fotosbiancamento. Inoltre, l'imaging di un'intera fetta ottica consente il rilevamento basato su telecamera di quella fetta eccitata, aumentando la velocità rispetto alla scansione puntuale¹². LSFM produce in modo non distruttivo sezioni ottiche ben registrate che sono adatte per la ricostruzione 3D.

Mentre il metodo iDISCO+ consente una pulizia dei tessuti economica entro ~ 3 settimane, le fasi di disidratazione all'interno del protocollo possono portare al restringimento del tessuto e alla potenziale alterazione della morfologia del campione, influenzando così le misurazioni volumetriche ^6,10. L'aggiunta di un metodo di imaging secondario, come la risonanza magnetica, da utilizzare prima della procedura di pulizia del tessuto può misurare il grado di restringimento indotto dalla pulizia del tessuto attraverso il campione. Durante le fasi di disidratazione, le differenze nelle proprietà meccaniche tra la materia grigia e bianca possono portare a deformazioni non uniformi della materia cerebrale, con conseguenti deformazioni di volume indotte dalla pulizia dei tessuti dissimili tra campioni wild-type e mutanti e possono confondere le interpretazioni delle differenze volumetriche in questi campioni^10,13 . La risonanza magnetica viene eseguita prima perfondendo l'animale con un agente di contrasto (ad esempio, gadolinio), seguita dall'incubazione del tessuto estratto di interesse in una soluzione di immersione (ad esempio, fomblin) prima di imaging¹⁴. La risonanza magnetica è compatibile con la pulizia dei tessuti e l'esecuzione di LSFM sullo stesso campione.

LSFM viene spesso utilizzato per creare immagini di microscopia su larga scala per la visualizzazione qualitativa del tessuto cerebrale di interesse piuttosto che la valutazione quantitativa della struttura cerebrale (Figura 1). Senza una valutazione quantitativa, è difficile dimostrare differenze strutturali derivanti da insulti genetici o ambientali. Con il miglioramento delle tecnologie di pulizia dei tessuti e di imaging, insieme alla riduzione dei costi di archiviazione e potenza di calcolo, la quantificazione delle localizzazioni dei tipi di cellule all'interno del tessuto di interesse sta diventando più accessibile, consentendo a più ricercatori di includere questi dati nei loro studi.

Con oltre 100 milioni di cellule nel cervello del topo¹⁵ e sessioni di imaging dell'intero cervello in grado di generare terabyte di dati, vi è una crescente domanda di strumenti avanzati di analisi delle immagini che consentano una quantificazione accurata delle caratteristiche all'interno delle immagini, come le cellule. Esistono numerosi metodi di segmentazione per le immagini con eliminazione tissutale che applicano soglie per l'intensità della colorazione nucleare e filtrano oggetti con forme, dimensioni o densità predefinite^10,16,17,18. Tuttavia, interpretazioni imprecise dei risultati possono derivare da variazioni di parametri quali dimensioni delle celle, contrasto dell'immagine e intensità dell'etichettatura. Questo articolo descrive il nostro protocollo stabilito per quantificare i nuclei cellulari nel cervello del topo. In primo luogo, descriviamo in dettaglio i passaggi per la raccolta dei tessuti del cervello del topo P4, seguiti da un protocollo di pulizia dei tessuti e immunoetichettatura ottimizzato dal metodo iDISCO +¹⁰ disponibile pubblicamente. In secondo luogo, descriviamo l'acquisizione delle immagini utilizzando la risonanza magnetica e la microscopia a foglio leggero, compresi i parametri utilizzati per l'acquisizione delle immagini. Infine, descriviamo e dimostriamo NuMorph¹⁹, una serie di strumenti di analisi delle immagini che il nostro gruppo ha sviluppato che consente la quantificazione specifica del tipo di cellula dopo la pulizia dei tessuti, l'immunomarcatura con marcatori nucleari e l'imaging a foglio luminoso di regioni annotate.

Protocollo

Tutti i topi sono stati utilizzati in conformità e approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso l'Università della Carolina del Nord a Chapel Hill.

1. Dissezione e perfusione del topo

NOTA: Le seguenti dissezioni sono state eseguite su topi P4 e P14 utilizzando una siringa. Il volume del liquido di perfusione varierà a seconda dell'età dell'animale.

1. Perfusione
   ATTENZIONE: La paraformaldeide (PFA) è una sostanza chimica pericolosa. Eseguire tutte le fasi di perfusione in una cappa aspirante chimica.
   1. Prima dell'intervento chirurgico, somministrare pentobarbital tramite iniezione intraperitoneale (100 mg/kg) e lasciare che l'anestetico abbia effetto.
   2. Una volta che l'animale ha raggiunto un piano chirurgico di anestesia, utilizzare il metodo di risposta del pizzicamento delle dita dei piedi per confermare la mancata risposta.
   3. Fai un'incisione laterale sotto la gabbia toracica per esporre la cavità toracica dell'animale.
   4. Usando forbici chirurgiche curve, tagliare con cura la gabbia toracica fino alla clavicola su un lato dell'animale e fare un taglio identico sul lato opposto, permettendo allo sterno di essere sollevato, esponendo il cuore.
   5. Senza danneggiare l'aorta discendente, tagliare con cura qualsiasi tessuto collegato al cuore prima di praticare una piccola incisione sull'atrio destro per consentire al sangue di fluire fuori dal sistema vascolare.
   6. Utilizzando un metodo basato su siringa, perfondere il mouse attraverso il ventricolo sinistro con 10 ml e 7 ml di soluzione salina tamponata fosfato (PBS) per P14 e P4, rispettivamente, con una velocità di perfusione di 1,5 ml / min attraverso il sistema.
   7. Una volta eliminato il sangue, perfondere nuovamente con 10 ml di PBS + 4% PFA e 7 mL di PBS + 4% PFA per P14 e P4, rispettivamente, a 4 °C con una velocità di perfusione di 1,5 mL/min per fissare l'animale.
      NOTA: Si osserveranno tremori di fissazione e l'animale sarà rigido al termine. Se si utilizza la risonanza magnetica su campioni, perfondere con volumi simili di PBS e PFA per ciascun timepoint + 20% di mezzo di contrasto MRI a base di gadolinio nella soluzione PFA.
   8. Rimuovere la testa con le forbici chirurgiche e drop-fix con PBS + 4% PFA per 24 ore a 4 °C per una fissazione completa.
      NOTA: In questa fase, il cervello rimane intatto con il cranio acceso (vedere Sezione 2). Punto di pausa: i cervelli possono essere conservati per diversi mesi in questa fase in PBS + 0,1% di azoturo di sodio a 4 °C.

2. Imaging della struttura cerebrale grossolana basato su RM con cranio intatto e analisi

NOTA: Il cervello deve essere perfuso e incubato in gadolinio come descritto sopra senza essere rimosso dal cranio. Tutta la risonanza magnetica si verifica prima della rimozione del cervello dal cranio per evitare la perdita di tessuto involontaria durante la dissezione. L'imaging con un cranio intatto fornisce anche supporto al cervello nel supporto del campione (cioè siringa) durante la preparazione del campione e l'imaging.

1. Preparazione del campione
   NOTA: i seguenti passaggi sono ottimizzati per i campioni di cervello di topo P4 e P14. La dimensione della siringa necessaria dipenderà dalla dimensione fisica del campione.
   1. Se si esegue la risonanza magnetica sul campione, rimuovere la pelle dal cranio e incubare in PBS + 3% gadolinio per 23 giorni a 4 °C prima di eseguire l'imaging¹⁴. Dopo 23 giorni, sciacquare rapidamente i campioni in PBS.
   2. Utilizzare siringhe da 5 ml per creare un portacampioni per la risonanza magnetica, utilizzando pistoni per siringhe per chiudere ciascuna estremità del supporto realizzato con la siringa²⁰. Utilizzare pezzi di plastica per tenere il cranio saldamente in posizione nel supporto (Figura 2A). Rimuovere i segni sulla siringa con etanolo per evitare artefatti durante l'imaging.
   3. Posizionare saldamente il cranio nel supporto del campione e riempire con una soluzione ad immersione compatibile con la risonanza magnetica (vedere la tabella dei materiali). Chiudere il supporto e rimuovere tutte le bolle d'aria usando una siringa.
      NOTA: Punto di pausa: il cranio può essere conservato nella soluzione di immersione per diversi mesi prima dell'imaging.
2. Imaging della struttura cerebrale grossolana (MRI)
   1. Immagini dei campioni con un sistema di risonanza magnetica animale a foro orizzontale di 9,4 T/30 cm utilizzando una bobina di volume di 15 mm e una sequenza basata su spin-eco con i seguenti parametri: Risoluzione spaziale: 60 μm x 60 μm x 60 μm; Tempo totale di scansione: 7 h 12 min; tempo di eco (TE): 6,83 ms; tempo di ripetizione (TR): 40 ms; angoli di eccitazione/rimessa a fuoco: 90/180 gradi; dimensione dell'immagine: 166 x 168 x 209 voxel; Campo visivo (FOV): 9,9 mm x 10,1 mm x 12,4 mm; larghezza di banda: 100.000 kHz.
3. Analisi computazionale della struttura cerebrale grossolana
   1. Rimuovere il cranio circostante dalle immagini di risonanza magnetica grezze tracciando manualmente il cervello del topo utilizzando il software di segmentazione. Quindi, applicare l'operazione di moltiplicazione voxel-saggio tra l'immagine della maschera e l'immagine MRI grezza per generare l'immagine MRI cerebrale spogliata del cranio.
      NOTA: l'output è un'immagine maschera binaria in cui l'intensità per i voxel cerebrali è impostata su 1 e 0 in caso contrario.
   2. Applicare la registrazione rigida dell'immagine (stimando solo la traslazione e la rotazione) utilizzando "flirt" nel pacchetto FSL^21,22 per allineare l'immagine MRI spogliata del cranio (immagine in movimento) alla corrispondente immagine al microscopio a foglio luminoso (immagine di riferimento).
   3. Applicare la registrazione non rigida (utilizzando 'SyN' nel software ANTS²³) per trovare le corrispondenze punto-punto tra l'immagine MRI allineata rigidamente nel passaggio 2.3.2 e l'immagine del foglio luminoso (stessa immagine di riferimento nel passaggio 2.3.2).
      NOTA: L'output include l'immagine MRI deformata e il campo di deformazione associato alle variazioni di volume dalla risonanza magnetica alle immagini del foglio di luce.
   4. Calcolare il determinante jacobiano sul campo di deformazione generato nel passo 2.3.3, che quantifica la variazione di volume in un quartiere locale di voxel 3 x 3 x 3.
   5. Allinea le immagini spogliate del cranio all'Atlante del cervello del topo di Allen Developmental utilizzando la registrazione delle immagini deformabili.
      NOTA: La corrispondenza spaziale punto-punto stabilita consente l'annotazione automatica delle regioni cerebrali di interesse nella nuova immagine del topo (Figura 2C-H).

3. Dissezione cerebrale dal cranio

1. Fai un'incisione sulla linea mediana lungo la parte superiore del cranio dal collo al naso per esporre il cranio.
2. Esporre la base del cranio tagliando via il muscolo del collo rimanente e tutti gli altri muscoli residui.
3. Utilizzando forbici chirurgiche affilate, tagliare con cura lungo la superficie interna del cranio, facendo attenzione a non danneggiare il cervello mantenendo una leggera pressione verso l'alto durante il taglio con l'attrezzatura chirurgica affilata.
4. Usa le pinzette per staccare le due metà tagliate del cranio dal cervello e tagliare con cura il grasso in eccesso attaccato al cervello.
5. Usa una forbice chirurgica per tagliare qualsiasi dura che collega il cervello al cranio, quindi usa una spatola per rimuovere delicatamente il cervello dalla testa.
6. Rimuovere il cervello, lavare con PBS, quindi passare a PBS con azoturo di sodio allo 0,1% e conservare a 4 ° C per la conservazione a lungo termine.

4. Pulizia dei tessuti

NOTA: Questo protocollo è adattato dal protocollo iDISCO+ per i mouse P4⁶, con modifiche minori. Alcuni dettagli possono cambiare per diversi punti temporali / specie / esperimenti). ATTENZIONE: Metanolo, diclorometano (DCM) ed etere dibenzilico (DBE) sono sostanze chimiche pericolose. Queste fasi di pulizia dei tessuti vengono eseguite in una cappa aspirante chimica.

1. Validazione anticorpale
   NOTA: La compatibilità con metanolo degli anticorpi non testati deve essere controllata in quanto potrebbero essere influenzati negativamente dai lavaggi aggressivi del metanolo richiesti nel protocollo iDISCO+. Per un elenco degli anticorpi che hanno dimostrato di funzionare in iDISCO+, vedere il sito web²⁴.
   1. Raccogliere sezioni congelate di 10 μm del tessuto di interesse fissato con PFA su vetrini stereologici.
   2. Incubare le sezioni in metanolo al 100% per 3 ore a temperatura ambiente.
   3. Reidratare in PBS prima di procedere con i protocolli immunoistochimici standard per determinare se l'anticorpo mostra il modello atteso di fluorescenza dopo i lavaggi con metanolo. Per un controllo positivo, utilizzare un vetrino non trattato con metanolo.
2. Preparazione del buffer
   1. Preparare i buffer secondo il protocollo ufficiale iDISCO. Vedere la tabella dei materiali per la composizione dei buffer e delle altre soluzioni utilizzate in questo protocollo.
3. Pretrattamento
   1. Disidratare il campione con metanolo/serie PBS: 20%, 40%, 60%, 80%, 100%; 1 h ciascuno a temperatura ambiente.
      NOTA: L'uso di PBS durante la disidratazione aiuta a prevenire la rottura dei campioni nei lavaggi a metanolo.
   2. Lavare il campione in metanolo al 100% per 1 ora, quindi raffreddare a 4 °C per 1 ora prima di incubare per una notte agitando in 66% DCM / 33% metanolo a temperatura ambiente.
   3. Lavare il campione 2 volte in metanolo al 100% a temperatura ambiente, quindi raffreddarlo a 4 °C.
   4. Utilizzare H₂O₂ fresco al 5% in metanolo per sbiancare il campione durante la notte a 4 °C.
   5. Reidratare il campione con metanolo/serie PBS: 80%, 60%, 40%, 20%, PBS; 1 h ciascuno a temperatura ambiente e lavare 2x per 1 ora in PTx.2 a temperatura ambiente.
   6. Incubare il campione in 1x PBS/0,2% TritonX-100/20% DMSO a 37 °C durante la notte.
   7. Incubare il campione in 1x PBS/0,1% Tween-20/0,1% TritonX-100/0,1% Deossicolato/0,1% NP40/20% DMSO a 37 °C durante la notte.
   8. Lavare in PTx.2 a temperatura ambiente per 1 h due volte.
4. Immunomarcatura
   1. Incubare i campioni in soluzione di permeabilizzazione a 37 °C per 2 giorni (~48 h).
   2. Bloccare i campioni in soluzione bloccante a 37 °C per 2 giorni (~48 h).
   3. Incubare i campioni con anticorpo primario in PTwH / 5% DMSO / 3% siero a 37 °C per 4 giorni (~96 h) (ad esempio, coniglio (Rb) Brn2 / POU3F2 mAb (1:100) e anticorpo anti-Ctip2 rat (Rt) (1:400) (Tabella dei materiali).
   4. Lavare 3 x 1 h in PTwH. Lavare per altre 2 ore in PTwH. Lasciare nella soluzione di lavaggio per una notte a temperatura ambiente.
   5. Incubare i campioni con anticorpi secondari e un colorante nucleare, come TO-PRO-3, in PTwH / siero al 3% a 37 °C per 4 giorni (~96 h; ad esempio, capra anti-Rb(1:50) e (capra anti-Rt(1:200)) (Tabella dei materiali).
   6. Lavare 3 x 1 h in PTwH Lavare per altre 2 ore in PTwH. Lasciare nella soluzione di lavaggio per una notte a temperatura ambiente.
5. Spurgo
   1. Disidratare in metanolo/serie PBS-20%, 40%, 60%, 80%, 100%-1 h ciascuno a temperatura ambiente. Incubare per 3 ore, con agitazione, in 66% DCM / 33% metanolo a temperatura ambiente.
      NOTA: Il campione può essere lasciato durante la notte a temperatura ambiente immediatamente dopo la disidratazione in metanolo al 100%.
   2. Incubare in DCM al 100% per 15 minuti due volte a temperatura ambiente (con agitazione) per lavare il MeOH.
   3. Incubare in etere dibenzilico (DBE) senza agitare a temperatura ambiente. Assicurarsi che il tubo sia riempito quasi completamente con DBE per evitare l'ossidazione del campione. Terminare di miscelare la soluzione invertendo un paio di volte prima dell'imaging.

5. Imaging a foglio luminoso

NOTA: i cervelli iDISCO con eliminazione dei tessuti sono stati ripresi con un microscopio a foglio di luce, dotato di un obiettivo 2X/0.5 NA, una telecamera complementare a semiconduttore di ossido di metallo e un software di acquisizione di immagini e funzionamento al microscopio a 0,75 x 0,75 x 4 μm/voxel per il timepoint P4 in quanto ciò consentiva la risoluzione di una singola cellula all'interno della corteccia (Figura 3A,B).

1. Montaggio del campione
   1. Montare con cura il campione nel supporto della dimensione del campione corretto in modo che il campione sia orientato con la dimensione z non superiore a 5,2 mm di profondità a causa della distanza di lavoro nominale del microscopio a foglio di luce (5,7 mm meno 0,5 mm margine di sicurezza)²⁵.
   2. Posizionare il portaposto nella culla del campione con la vite del supporto con un angolo di 45° rispetto ai supporti della culla (Figura 1B). Posizionare la culla in modo che il percorso della luce sia perpendicolare al campione (Figura 1C).
2. Parametri di imaging
   1. Impostare il corpo dello zoom sul microscopio su un ingrandimento 4x o superiore con un rendimento di 0,75 μm/pixel.
      NOTA: Le analisi computazionali a singola cellula su immagini a foglio di luce P4 possono essere eseguite con qualsiasi microscopio a foglio di luce disponibile in commercio che consente una risoluzione di 0,75 x 0,75 x 4 μm / voxel o superiore. Una risoluzione inferiore è sufficiente per i cervelli in punti temporali successivi in cui i nuclei sono più scarsamente distribuiti.
   2. Nel software di acquisizione immagini, selezionare un singolo foglio luminoso con un NA = ~0,08 (spessore 9 μm / passo z 4 μm).
      NOTA: Questa impostazione combinata con la messa a fuoco dinamica orizzontale consente l'imaging dell'intero cervello con una risoluzione a singola cellula del cervello di un topo entro un tempo ragionevole. Per un cervello postnatale giorno 4 (P4), il tempo di acquisizione delle immagini è stimato in 11-15 ore per tre canali a seconda delle dimensioni del cervello.
   3. Per garantire che la risoluzione assiale venga mantenuta lungo la larghezza dell'immagine, selezionare Messa a fuoco dinamica orizzontale e applicare il numero consigliato di passaggi a seconda della lunghezza d'onda del laser. Per un intero cervello di topo P4, impostare la messa a fuoco dinamica orizzontale su 11. Regolare la messa a fuoco fine per ciascun canale rispetto al canale di registrazione.
      NOTA: Qui, il canale TO-PRO-3 (647 nm) è registrato nell'Allen Developmental Mouse Brain Atlas in quanto etichetta tutti i nuclei.
   4. Regolare la potenza del laser per canale rispetto alle proprietà del canale.
      NOTA: lunghezze d'onda più lunghe richiedono una potenza laser maggiore rispetto alle lunghezze d'onda più corte. Ad esempio, il canale a 780 nm deve essere ripreso con una potenza laser elevata (70% - 75%) e una bassa esposizione (50 ms), mentre il canale a 647 nm richiede una potenza laser media (40% - 45%) e una bassa esposizione (50 ms).
   5. Regolare la larghezza del foglio luminoso su ~50% per garantire che la potenza del foglio sia distribuita in modo ottimale nella dimensione y per questa dimensione campione.
      NOTA: In combinazione con la messa a fuoco dinamica orizzontale, una larghezza del foglio del 50% fornisce una distribuzione media della potenza sull'immagine con un rischio ridotto di sbiancamento fotografico²⁵.
   6. Impostare il numero di riquadri rispetto alle dimensioni del campione con una sovrapposizione consigliata del 15% tra i riquadri e acquisire immagini per ogni canale in sequenza per ogni pila in una determinata posizione del riquadro.

6. Elaborazione delle immagini utilizzando NuMorph

NOTA: la pipeline NuMorph ha tre parti principali per l'analisi delle immagini 3D: pre-elaborazione, analisi e valutazione. Queste parti sono state organizzate in NMp_template.m, NMa_template.m. e NMe_template.m, rispettivamente, che sono discusse di seguito. Inoltre, NM_setup.m viene aggiunto per scaricare e installare i pacchetti software necessari per il corretto funzionamento di NuMorph. NM_samples.m fornisce anche un modello per inserire informazioni sull'acquisizione delle immagini.

1. Configurazione di NuMorph
   1. Scarica e installa il gestore dell'ambiente conda per Linux²⁶. Scarica e installa gli strumenti di elaborazione delle immagini NuMorph¹⁹ .
   2. Nella riga di comando, esegui Matlab. Esegui NM_setup.m da NuMorph per scaricare e installare i pacchetti software di analisi delle immagini necessari per le analisi.
      NOTA: Questo passaggio garantisce che l'ambiente conda sia configurato correttamente e che tutti gli strumenti e i componenti aggiuntivi necessari per Matlab per eseguire ciascuna delle tre pipeline siano scaricati e installati correttamente. I più importanti qui sono Elastix per la registrazione in esecuzione e 3D-Unet per il rilevamento e il conteggio delle cellule.
2. Specificare i nomi dei campioni, le directory di input e output, le informazioni sul canale e i parametri di imaging del foglio luminoso modificando il file NM_samples.m.
   NOTA: Qui, si consiglia di ricontrollare per assicurarsi che le informazioni corrette, in particolare la directory di input dell'immagine, siano specificate correttamente. Gli errori non vengono in genere chiamati qui fino a quando non si eseguono i passaggi successivi.
3. Pre-elaborazione delle immagini
   1. Regolazione dell'intensità
      1. Nella NMp_template, impostare la regolazione dell'intensità = true.
         NOTA: impostare su true se è necessaria la regolazione dell'intensità. In caso contrario, impostare la regolazione dell'intensità = false. C'è anche un'opzione per utilizzare 'update' per sovrascrivere i parametri di regolazione precedenti.
      2. Imposta usa immagini elaborate = false quando si lavora con un nuovo set di immagini. In caso contrario, indicare eventuali set di dati di immagini salvati in precedenza nella directory di output (ad esempio, "allineati", "cuciti") da utilizzare per le successive fasi di elaborazione.
         NOTA: questa opzione è disponibile nel caso in cui le immagini di input siano già state pre-elaborate. In questo caso, le immagini preelaborate verranno utilizzate come immagini di input e l'opzione verrà impostata sul nome della sottodirectory nella directory di output.
      3. Imposta salva immagini = true.
         NOTA: l'utilizzo di questa opzione garantisce che le immagini elaborate vengano salvate nella directory di output; In caso contrario, verranno calcolati e salvati solo i parametri.
      4. Imposta salva campioni = true.
         NOTA: questa opzione garantisce che i risultati del campione vengano salvati per ogni passaggio principale.
      5. Imposta regola ombreggiatura piastrelle = base per applicare la correzione dell'ombreggiatura utilizzando l'algoritmo BaSiC²⁷ o manuale per applicare la correzione dell'ombreggiatura delle piastrelle utilizzando misurazioni dal microscopio a fogli di luce a specifiche larghezze del foglio di luce.
         NOTA: questa opzione corregge l'illuminazione irregolare lungo la dimensione y causata dalla forma della vita del foglio.
   2. Allineamento dei canali immagine
      1. In NMp_template, impostare l'allineamento dei canali = true. Impostate questa opzione su true se è richiesto l'allineamento dei canali. In caso contrario, impostare su false. Impostare il metodo di allineamento dei canali su traslazione (rigido) o elastix (non rigido).
         NOTA: Il metodo di traslazione utilizza approcci rigidi di registrazione 2D nell'allineamento di più canali, mentre il metodo elastix utilizza B-spline²⁸ non rigide per correggere la deriva rotazionale, che può verificarsi durante l'acquisizione di immagini lunghe¹⁹.
   3. Stitching iterativo delle immagini
      1. In NMp_template, impostare le immagini del punto = true.
         Nota : impostare questa opzione su true se è necessaria la cucitura.
      2. Imposta raffinamento setaccio = true.
         NOTA: questa opzione viene utilizzata per perfezionare ulteriormente la traslazione in xy utilizzando la feature Scala invariante Transform²⁹.
      3. Imposta parametri di allineamento del carico = true.
         NOTA: questa opzione utilizza le traslazioni di allineamento dei canali durante la cucitura. Questa opzione è consigliata con l'imaging multicanale. In caso contrario, impostare su false.
      4. Imposta sovrapposizione = 0,15 per abbinare le sovrapposizioni dei riquadri durante l'imaging.
   4. Per eseguire uno di questi passaggi di pre-elaborazione, esegui quanto segue in Matlab al di fuori dell NMp_template ambiente:
      1. Specificare il nome del campione. Set config = NM_config(process,sample).
      2. Eseguire uno qualsiasi dei passaggi di pre-elaborazione specificando NM_process(config,stage) e specificare lo stage utilizzando intensità, allineamento o stitch per uno qualsiasi dei processi. Controllare la directory di output per i file di output per ciascuna delle fasi (Figura 3 e Figura 4).
4. Analisi delle immagini
   1. Prima di NuMorph
      1. Inizia con un'immagine dell'atlante 3D e un'immagine di annotazione associata che assegna ogni voxel a una particolare struttura.
         NOTA: Qui viene utilizzato il P4 Allen Developmental Mouse Brain Atlas generato dal MagellanMapper³⁰ .
      2. Allineare sia l'immagine dell'atlante che il file di annotazione per assicurarsi che corrispondano correttamente con il giusto orientamento.
   2. All'interno di NuMorph
      NOTA: Ora che l'atlante e le sue annotazioni sono allineati correttamente, i file devono essere "munged" o elaborati all'interno di NuMorph in modo che possano essere salvati per un uso successivo. A tale scopo, utilizzare la funzione munge_atlas per specificare gli input come illustrato di seguito.
      1. Specificare Atlas_file: (stringa). Fornire il percorso completo del file dell'atlante.
      2. Specificare Annotation_file: (stringa). Fornire il percorso completo delle annotazioni associate.
      3. Specificare Risoluzione: (1x3 numerico). Specificate la risoluzione dell'atlante y,x,z come micron per pixel.
      4. Specificate l'orientamento: (1 x 3 caratteri). Fornire l'orientamento dell'atlante e assicurarsi che corrisponda alla configurazione del campione nella culla (anteriore(a)/posteriore(p),superiore/i/inferiore(i),sinistra(l)/destra(r)).
      5. Specifica emisfero: specifica quale emisfero cerebrale è stato ripreso ("sinistra", "destra", "entrambi", "nessuno").
      6. Specificate out_resolution:(int). Specificare la risoluzione isotropica dell'output dell'atlante in micron. (valore predefinito: 25).
      7. Eseguire il comando "munge_atlas(atlas_file, annotation_file, risoluzione, orientamento, emisfero)" per generare annotazioni munged in /data/annotation_data e una copia dell'immagine dell'atlante in /data/atlas.
      8. Leggi la struttura Matlab e il file dell'atlante per verificare che entrambi i file siano correttamente mappati con il giusto orientamento.
         NOTA: È possibile eseguire un'ulteriore fase di classificazione cellulare per quantificare i tipi cellulari in base alla co-localizzazione di marcatori proteici immunomarcati.
   3. Ricampionamento
      1. In NMa_template, impostare ricampionare le immagini = true, se si esegue la registrazione delle immagini per fare riferimento all'atlante o per generare volumi di set di dati ad alta risoluzione.
         NOTA: Il NMa_template.m verrà utilizzato per impostare i parametri per il ricampionamento, la registrazione, il rilevamento dei nuclei e il conteggio delle cellule.
      2. Impostate la risoluzione di ricampionamento in modo che corrisponda all'atlante.
         NOTA: Qui, viene utilizzata la risoluzione isotropa di 25 μm³/voxel perché l'atlante di riferimento si trova a questa risoluzione.
      3. Specificare il numero di canale da ricampionare utilizzando i canali di ricampionamento = [ ].
         NOTA: qui, il numero del canale è impostato in modo che corrisponda al canale nucleare. Se questa opzione è vuota, verrà ricampionato solo il canale di registrazione.
   4. Registrazione
      1. In NMa_template, impostare le immagini del registro = true. Impostare su true se è richiesta la registrazione. In caso contrario, impostare registration = false.
      2. Specificate il file dell'atlante in modo che corrisponda al file nella directory dell'atlante.
      3. Imposta parametri di registrazione = default.
         NOTA: questa opzione utilizza una trasformazione affine seguita da B spline per stimare la corrispondenza spaziale. Altrimenti, definire un nuovo set di parametri di registrazione tramite Elastix in /data/elastix_parameter_files/atlas_registration.
      4. Imposta salva immagini registrate = true.
         NOTA: i file di output dalla registrazione e dal ricampionamento possono essere scaricati e ispezionati visivamente in Matlab o in altri strumenti di visualizzazione come FIJI³¹.
   5. Rilevamento dei nuclei, conteggio e classificazione delle cellule
      NOTA: gli errori che si verificano qui potrebbero essere dovuti alla mancata specifica corretta del file delle annotazioni o alla mancata corrispondenza dell'età del campione con l'annotazione corretta.
      1. In NMa_template, impostare entrambi i nuclei di conteggio e classificare le cellule = vero.
      2. Imposta il metodo di conteggio = 3dunet.
         NOTA: questa opzione consente l'uso del modello 3D-Unet addestrato¹⁹. In caso contrario, selezionare Hessian che utilizza il metodo di rilevamento BLOB dell'Assia.
      3. Impostare min_intensity per definire una soglia minima di intensità per gli oggetti rilevati.
         NOTA: Una soglia appropriata è determinata empiricamente in base al rapporto segnale-rumore dell'etichettatura nucleare.
      4. Impostare classify_method su una delle due soglie, che si basa su intensità di fluorescenza non supervisionate in posizioni centroidi o svm, che modella un classificatore SVM (Support Vector Machine) lineare supervisionato.
         NOTA: questo passaggio classificherà tutte le celle rilevate in quattro classi principali con imaging a 3 canali. Con questo protocollo vengono generati Ctip2+/Brn2-, Ctip2-/Brn2⁺, Ctip2-/Brn2^- e Outliers.
   6. Fasi dell'analisi
      1. Specificare il nome del campione. Imposta config =NM_config(analyze,sample).
      2. Eseguite uno qualsiasi dei passi di analisi specificando NM_analyze(config,stage) e specificate lo stage utilizzando ricampionare, registrare, contare o classificare. Controllare la directory di output per i file di output per ciascuna delle fasi (Figura 5).
   7. Classificazione del tipo di cellula e analisi dei gruppi
      1. In NMe_template, impostare update = true e sovrascrivere tutte le statistiche calcolate in precedenza.
         NOTA: Il NMe_template.m offre la possibilità di eseguire l'analisi di gruppi di tipo cellulare attraverso regioni cerebrali dello stesso cervello analizzato.
      2. Impostare compare_structures_by su uno dei due indici per confrontare con tutte le annotazioni univoche o una tabella per confrontare le strutture in base alla tabella.
      3. Impostare il template_file, che specifica tutti i possibili indici di struttura e deve esistere in /annotations.
      4. Impostare structure_table e specificare le strutture da valutare.
      5. Specificare il conteggio delle celle e la classificazione del tipo di cella come descritto in NMa_template.m.
      6. Impostare compare_groups per specificare i gruppi da confrontare.
      7. Impostare accoppiato su true o false per eseguire il test t accoppiato o il test t a due campioni.
   8. Eseguire l'analisi.
      NOTA: per eseguire questo passaggio, eseguire quanto segue in Matlab al di fuori dell'ambiente NMe_template.m.
      1. Specificare il nome del campione. Set config =NM_config(evaluate,sample).
      2. Eseguite il passo di analisi specificando NM_evaluate(config,stage) e specificate lo stage. Controllare la directory di output per i file di output per l'analisi di gruppo.

Risultati

Poiché il protocollo iDISCO+ introduce un significativo restringimento tissutale, che è facilmente visibile ad occhio nudo (Figura 2B), abbiamo aggiunto una fase di risonanza magnetica a questa pipeline prima della pulizia dei tessuti per quantificare il restringimento indotto dalla pulizia dei tessuti. Il flusso di lavoro inizia con la rimozione del tessuto non cerebrale dall'immagine MR (Figura 2C). Successivamente, viene applicata una trasformazione rigida ...

Discussione

I metodi di pulizia dei tessuti sono tecniche utili per misurare l'organizzazione cellulare 3D del cervello. Ci sono una miriade di metodi di pulizia dei tessuti descritti in letteratura, ognuno con i suoi vantaggi e limiti 6,7,8,9. Le opzioni per gli strumenti computazionali per analizzare i tipi di cellule nelle immagini tessutali sono relativamente limitate. Altri strumenti disponibili sono ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bruker 9.4T/30 cm MRI Scanner	Bruker Biospec		Horizontal Bore Animal MRI System
Dibenzyl ether	Sigma-Aldrich	108014-1KG
Dichloromethane (DCM)	Sigma-Aldrich	270997-1L
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher-Scientific	ICN19605590
Donkey serum	Sigma-Aldrich	S30-100ML
EVO 860 4TB external SSD
Fomblin Y	Speciality Fluids Company	YL-VAC-25-6	perfluoropolyether lubricant
gadolinium contrast agent (ProHance)	Bracco Diagnostics	A9576
gadolinium contrast agent(ProHance)	Bracco Diagnostics	0270-1111-03
GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPU	EVGA	08G-P4-6286-KR
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126-500G
Heparin sodium salt	Sigma-Aldrich	H3393-10KU	Dissolved in H2O to 10 mg/mL
Hydrogen peroxide solution, 30%	Sigma-Aldrich	H1009-100ML
ImSpector Pro	LaVision BioTec		Microscope image acquisition software
ITK Snap			segmentation software
Methanol	Fisher-Scientific	A412SK-4
MVPLAPO 2x/0.5 NA Objective	Olympus
Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA)	Sigma-Aldrich	30525-89-4	Dissolved in 1x PBS to 4%
Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)	Corning	46-013-CM	Diluted to 1x in H2O
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	S2002-100G	Dissolved in H2O to 10%
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750-10G
Tergitol type NP-40	Sigma-Aldrich	NP40S-100ML
TritonX-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ML
Tween-20	Fisher-Scientific	BP337 500
Ultramicroscope II Light Sheet Microscope	LaVision BioTec
Xeon Processor E5-2690 v4	Intel	E5-2690
Zyla sCMOS Camera	Andor		Complementary metal oxide semiconductor camera
Antibody			Working concentration
Alexa Fluor Goat 790 Anti-Rabbit	Thermofisher Scientific	A11369	(1:50)
Alexa Fluor Goat 568 Anti-Rat	Thermofisher Scientific	A11077	(1:200)
Rat anti-Ctip2	Abcam	ab18465	(1:400)
Rabbit anti-Brn2	Cell Signaling Technology	12137	(1:100)
To-Pro 3 (TP3)	Thermofisher Scientific	T3605	(1:400)