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要約

このプロトコルでは、iDISCO+を使用して無傷のマウス脳の磁気共鳴イメージング、クリアリング、および免疫標識を行う方法について説明し、その後、ライトシート顕微鏡を使用したイメージングの詳細な説明、およびNuMorphを使用したダウンストリーム分析について説明します。

要約

組織透明化とそれに続くライトシート顕微鏡(LSFM)により、無傷の脳構造の細胞分解能イメージングが可能になり、遺伝的または環境的摂動によって引き起こされる構造変化の定量的分析が可能になります。全脳イメージングは、細胞のより正確な定量化と、物理的に切片化された組織の一般的に使用される顕微鏡では見逃される可能性のある領域特異的な違いの研究をもたらします。ライトシート顕微鏡を使用してクリアされた脳を画像化すると、共焦点顕微鏡と比較して取得速度が大幅に向上します。これらの画像は非常に大量の脳構造データを生成しますが、除去された組織の画像で特徴の定量化を実行するほとんどの計算ツールは、すべての核ではなく、まばらな細胞集団のカウントに限定されています。

ここでは、分析ツールのグループであるNuMorph(核ベースの形態測定)を示し、生後4日目(P4)マウスの脳のアノテーション領域内のすべての核および核マーカーを、ライトシート顕微鏡でクリアしてイメージングした後、定量化します。組織クリアの脱水ステップによって引き起こされる収縮前の脳容積を測定する磁気共鳴画像法(MRI)、免疫標識を含むiDISCO+法を使用した組織クリアリング、続いて市販のプラットフォームを使用してマウスの脳を細胞解像度で画像化するライトシート顕微鏡について説明します。次に、強度差の修正、画像タイルのステッチ、複数のチャネルの整列、核のカウント、公開されているアトラスへの登録による脳領域の注釈付けに使用されるNuMorphを使用したこの画像分析パイプラインを示します。

このアプローチは、公開されているプロトコルとソフトウェアを使用して設計され、必要な顕微鏡と計算リソースを持つすべての研究者がこれらの手法を実行できるようにしました。これらの組織クリアリング、イメージング、および計算ツールは、皮質内の細胞タイプの3次元(3D)組織の測定と定量化を可能にし、あらゆる野生型/ノックアウトマウス研究デザインに広く適用できるはずです。

概要

単一細胞分解能での全脳イメージングは、神経科学における重要な課題です。細胞解像度の脳画像は、脳回路の詳細な分析とシステムレベルのマッピングを可能にし、その回路が神経精神障害の遺伝的または環境的危険因子、発生中の胚の細胞挙動、および成人脳の神経回路によってどのように破壊されるかを可能にします1,2,3。再構築された3D脳の高解像度画像を可能にする複数の組織学的方法があります。しかしながら、これらの技術は、高価で特殊な装置を必要とし、免疫標識と互換性がない場合があり、そしていくつかの方法の2次元(2D)性質は、切片化中の組織損傷および剪断をもたらし得る4、5。

最近の進歩は、組織切片を必要としない脳全体を画像化するための代替アプローチを提供しました。それらは、脳を透明にするために組織クリアリングを使用することを含みます。ほとんどの組織透明化法では、光散乱の主要な光源である脂質を除去し、イメージング中に目的の屈折率(RI)をサンプル浸漬溶液のRIと一致させることによって、透明性が達成されます。その後、光は散乱されることなく材料間の境界を通過することができます6、7、8、9。

iDISCO+などの組織クリアリング法は、LSFM 6,7,10などの単一光子励起顕微鏡を用いた迅速な3Dイメージングと組み合わせることがよくあります。蛍光色素で標識した透明組織内で、光の薄い平面11で励起することにより光シート蛍光顕微鏡画像切片を画像化する。LSFMの主な利点は、一度に1つの光学セクションが照らされ、そのセクション内の分子からのすべての蛍光が励起され、光退色が最小限に抑えられることです。さらに、光学スライス全体を画像化することで、その励起スライスのカメラベースの検出が可能になり、ポイントスキャン12に対して速度が増加する。LSFMは、3D再構成に適した十分に登録された光学セクションを非破壊で生成します。

iDISCO+法は~3週間以内に安価な組織透明化を可能にしますが、プロトコル内の脱水ステップは、組織の収縮とサンプル形態の潜在的な変化につながる可能性があり、したがって体積測定に影響を与える可能性があります6,10。組織クリアリング手順の前に使用するMRIなどの二次イメージング法を追加すると、サンプル全体の組織クリアリング誘発収縮の程度を測定できます。脱水ステップでは、灰白質と白質の機械的特性の違いが脳物質の不均一な変形を引き起こし、野生型サンプルと変異型サンプルの間で異なる組織透明化誘発体積変形を引き起こし、これらのサンプルの体積差の解釈を混乱させる可能性があります10,13.MRIは、まず動物を造影剤(例えば、ガドリニウム)で灌流し、続いて、画像化14の前に、目的の抽出された組織を浸漬溶液(例えば、フォンブリン)中でインキュベートすることによって行われる。MRIは、同じサンプルで組織を透明化し、LSFMを実行することと互換性があります。

LSFMは、脳構造の定量的評価ではなく、目的の脳組織を定性的に視覚化するための大規模な顕微鏡画像を作成するためによく使用されます(図1)。定量的評価がなければ、遺伝的または環境的侮辱に起因する構造の違いを実証することは困難です。組織透明化およびイメージング技術が向上し、ストレージと計算能力のコストが削減されるにつれて、関心のある組織内の細胞タイプの局在を定量化することがよりアクセスしやすくなり、より多くの研究者がこれらのデータを研究に含めることができます。

マウスの脳内の1億個以上の細胞15と、テラバイトのデータを生成できる全脳イメージングセッションにより、細胞などの画像内の特徴を正確に定量化できる高度な画像解析ツールの需要が高まっています。核染色強度の閾値を適用し、事前定義された形状、サイズ、または密度10、16、17、18でオブジェクトをフィルタリングする、組織クリア画像には多数のセグメンテーション方法が存在します。ただし、結果の不正確な解釈は、セルサイズ、画像のコントラスト、標識強度などのパラメーターの変動から発生する可能性があります。この論文では、マウス脳内の細胞核を定量するための確立されたプロトコルについて説明します。まず、P4マウス脳の組織採取の手順を詳しく説明し、続いて、公開されているiDISCO+メソッド10から最適化された組織クリアリングおよび免疫標識プロトコルについて説明します。次に、MRIとライトシート顕微鏡を使用した画像取得について、画像のキャプチャに使用されるパラメーターを含めて説明します。最後に、組織クリアリング後の細胞種特異的定量、核マーカーによる免疫標識、アノテーション領域のライトシートイメージングを可能にする、当グループが開発した画像解析ツールのセットであるNuMorph19について説明し、デモンストレーションします。

プロトコル

すべてのマウスは、ノースカロライナ大学チャペルヒル校の施設動物管理使用委員会(IACUC)に従って使用され、承認されました。

1.マウスの解剖と灌流

注:以下の解剖は、注射器を使用してP4およびP14マウスで実施されました。灌流液の量は動物の年齢によって異なります。

  1. 灌 流
    注意: パラホルムアルデヒド(PFA)は危険な化学物質です。化学ヒュームフードですべての灌流ステップを実行します。
    1. 手術前に、腹腔内注射(100 mg / kg) で ペントバルビタールを投与し、麻酔薬を有効にします。.
    2. 動物が麻酔の手術面に到達したら、つま先をつまむ反応法を使用して無反応を確認します。
    3. 胸郭の下に横方向の切開を行い、動物の胸腔を露出させます。
    4. 湾曲した外科用ハサミを使用して、動物の片側の鎖骨まで胸郭を注意深く切り、反対側に同じ切り込みを入れて、胸骨を持ち上げて心臓を露出させます。
    5. 下行大動脈を損傷することなく、心臓に接続されている組織を慎重にトリミングしてから、右心房を少し切開して血管系から血液が流出できるようにします。
    6. シリンジベースの方法を使用して、P14およびP4に対してそれぞれ10 mLおよび7 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を左心室にマウスに灌流し、システム内を1.5 mL / minの灌流速度で灌流します。
    7. 血液が透明になったら、P14とP4に対してそれぞれ10 mLのPBS + 4%PFAと7 mLのPBS + 4%PFAを4°Cで1.5 mL / minの灌流速度で再度灌流して動物を固定します。
      注:固定振戦が観察され、完了すると動物は硬直します。サンプルにMRIを使用する場合は、PFA溶液中の各時点+ 20%ガドリニウムベースのMRI造影剤について、同量のPBSおよびPFAを灌流します。
    8. 外科用ハサミを使用してヘッドを取り外し、PBS + 4%PFAで4°Cで24時間ドロップフィックスして完全に固定します。
      注:この段階では、脳は頭蓋骨をつけたまま無傷のままです(セクション2を参照)。 一時停止ポイント: 脳は、この段階でPBS + 0.1%アジ化ナトリウムで4°Cで数ヶ月間保存できます。

2. 無傷の頭蓋骨を用いたMRベースの脳肉眼構造イメージングと解析

注:脳は、頭蓋骨から取り出されることなく、上記のようにガドリニウムに灌流およびインキュベートする必要があります。すべてのMRIは、解剖中の意図しない組織損失を避けるために、頭蓋骨から脳を切除する前に行われます。無傷の頭蓋骨によるイメージングは、サンプル調製およびイメージング中にサンプルホルダー(すなわち、シリンジ)内の脳へのサポートも提供します。

  1. サンプル調製
    注:次の手順は、P4およびP14マウスの脳サンプル用に最適化されています。必要なシリンジのサイズは、サンプルの物理的なサイズによって異なります。
    1. サンプルに対してMRIを行う場合は、頭蓋骨から皮膚を取り出し、PBS + 3%ガドリニウム中で4°Cで23日間インキュベートしてからイメージング14を行います。23日後、サンプルをPBSですばやくすすぎます。
    2. 5mLシリンジを使用してMRI用のサンプルホルダーを作成し、シリンジピストンを使用してシリンジ20で作られたホルダーの両端を閉じる。プラスチック片を使用して、頭蓋骨をホルダーの所定の位置にしっかりと保持します(図2A)。シリンジのマーキングをエタノールで取り除き、イメージング時のアーチファクトを防ぎます。
    3. 頭蓋骨をサンプルホルダーにしっかりと置き、MRIと互換性のある液浸液を充填します( 材料の表を参照)。ホルダーを閉じ、シリンジを使用してすべての気泡を取り除きます。
      注: 一時停止ポイント: 頭蓋骨は、イメージングの前に数ヶ月間浸漬溶液に保存することができます。
  2. 脳肉眼構造イメージング(MRI)
    1. 15 mmの体積コイルと以下のパラメータを持つスピンエコーベースのシーケンスを使用して、9.4T/30 cmの水平ボア動物MRIシステムでサンプルを画像化します。 空間分解能:60 μm x 60 μm x 60 μm;合計スキャン時間:7時間12分;エコーまでの時間 (TE): 6.83 ミリ秒;繰り返し時間 (TR): 40 ミリ秒;励起/再焦点フリップ角度:90/180度;画像サイズ:166 x 168 x 209ボクセル;視野角: 9.9 ミリメートル x 10.1 ミリメートル x 12.4 ミリメートル;帯域幅:100,000キロヘルツ。
  3. 計算総脳構造解析
    1. セグメンテーションソフトウェアを使用してマウスの脳を手動でトレースすることにより、生のMRI画像から周囲の頭蓋骨を削除します。次に、マスク画像と生のMRI画像の間にボクセル単位の乗算演算を適用して、頭蓋骨を剥ぎ取った脳MRI画像を生成します。
      注:出力はバイナリマスク画像であり、脳ボクセルの強度は1に設定され、それ以外の場合は0に設定されています。
    2. FSLパッケージ21、22 内の「flirt」を用いて剛体画像登録(平行移動および回転のみを推定する)を適用して、頭蓋骨剥離MRI画像(動画)を対応するライトシート顕微鏡画像(参照画像)に位置合わせする。
    3. 非剛体レジストレーション(ANTSソフトウェア23の「SyN」を使用)を適用して、ステップ2.3.2の剛体位置合わせMRI画像とライトシート画像(ステップ2.3.2の同じ参照画像)の間のポイントツーポイント対応を見つけます。
      注:出力には、歪んだMRI画像と、MRIからライトシート画像へのボリューム変化に関連する変形フィールドが含まれます。
    4. ステップ 2.3.3 で生成された変形フィールドのヤコビ行列式を計算し、3 x 3 x 3 ボクセルのローカル近傍の体積変化を定量化します。
    5. 変形可能な画像登録を使用して、頭蓋骨を剥ぎ取った画像をアレン発達マウス脳アトラスに合わせます。
      注:確立された空間ポイントツーポイント対応により、新しいマウス画像の関心のある脳領域の自動注釈が可能になります(図2C-H)。

3.頭蓋骨からの脳解剖

  1. 頭蓋骨の上部に沿って首から鼻まで正中線を切開し、頭蓋骨を露出させます。
  2. 残りの首の筋肉と他のすべての残りの筋肉を切り取って、頭蓋骨の付け根を露出させます。
  3. 鋭利な手術用ハサミを使用して、頭蓋骨の内面に沿って慎重に切断し、鋭利な手術器具で切断しながら穏やかな上向きの圧力を維持することで脳を傷つけないように注意します。
  4. ピンセットを使用して、頭蓋骨の2つのカット半分を脳から剥がし、脳に付着した余分な脂肪を注意深く取り除きます。
  5. 外科用ハサミを使用して脳と頭蓋骨をつなぐ硬膜を整え、ヘラを使用して脳を頭からそっと取り除きます。
  6. 脳を取り出し、PBSで洗浄した後、0.1%アジ化ナトリウムを含むPBSに交換し、長期保存のために4°Cに保ちます。

4.組織の透明化

注:このプロトコルは、P4マウス6用のiDISCO+プロトコルから適応されていますが、わずかな変更が加えられています。一部の詳細は、異なる時点/種/実験によって変更される場合があります)。注意: メタノール、ジクロロメタン(DCM)、およびジベンジルエーテル(DBE)は危険な化学物質です。これらの組織透明化ステップは、化学ヒュームフード内で実行されます。

  1. 抗体バリデーション
    注:未試験の抗体のメタノール適合性は、iDISCO+プロトコルで必要とされる過酷なメタノール洗浄によって悪影響を受ける可能性があるため、確認する必要があります。iDISCO+で機能することが示されている抗体のリストについては、ウェブサイト24を参照してください。
    1. 目的のPFA固定組織の10 μm凍結切片をステレオスライドに回収します。
    2. 切片を100%メタノール中で室温で3時間インキュベートする。
    3. 標準的な免疫組織化学プロトコルに進む前にPBSで再水和して、抗体がメタノール洗浄後に予想される蛍光パターンを示すかどうかを判断します。ポジティブコントロールには、メタノールで処理されていないスライドを使用してください。
  2. バッファー調製
    1. 公式のiDISCOプロトコルに従ってバッファを準備します。このプロトコルで使用されるバッファーおよびその他の溶液の構成については、 材料表 を参照してください。
  3. 前処理
    1. メタノール/ PBSシリーズでサンプルを脱水します:20%、40%、60%、80%、100%;室温で各1時間。
      注意: 脱水中にPBSを使用すると、メタノール洗浄でのサンプルの割れを防ぐことができます。
    2. サンプルを100%メタノールで1時間洗浄した後、4°Cで1時間冷却した後、室温で66%DCM/33%メタノール中で振とうしながら一晩インキュベートします。
    3. サンプルを室温で100%メタノールで2回洗浄し、4°Cで冷却します。
    4. メタノール中の新鮮な5%H2O2を使用して、サンプルを4°Cで一晩漂白します。
    5. メタノール/ PBSシリーズでサンプルを再水和します:80%、60%、40%、20%、PBS。室温でそれぞれ1時間、室温でPTx.2で1時間2回洗浄します。
    6. サンプルを1x PBS/0.2% TritonX-100/20% DMSO 中で 37 °C で一晩インキュベートします。
    7. サンプルを1x PBS/0.1%トゥイーン-20/0.1%トリトンX-100/0.1%デオキシコール酸/0.1%NP40/20%DMSO中で37°Cで一晩インキュベートします。
    8. PTx.2で室温で1時間2回洗浄します。
  4. 免疫標識
    1. サンプルを透過処理液中で 37 °C で 2 日間 (~48 時間) インキュベートします。
    2. ブロッキング溶液で37°Cで2日間(~48時間)ブロックします。
    3. サンプルをPTwH / 5%DMSO / 3%血清中で37°Cで4日間(~96時間)インキュベートします(例:ウサギ(Rb)Brn2/POU3F2 mAb(1:100)および抗Ctip2ラット(Rt)抗体(1:400)(材料の表)。
    4. PTwHで3 x 1時間洗浄します。 PTwHでさらに2時間洗浄します。 洗浄液に室温で一晩放置します。
    5. サンプルを二次抗体およびTO-PRO-3などの核色素とともに、PTwH / 3%血清中で37°Cで4日間インキュベートします(~96時間;ヤギ抗Rb(1:50)およびヤギ抗Rt(1:200)など)(表)。
    6. PTwHで3 x 1時間洗浄します PTwHでさらに2時間洗浄します。 洗浄液に室温で一晩放置します。
  5. 消去
    1. メタノール/PBSシリーズで室温でそれぞれ20%、40%、60%、80%、100%-1時間脱水します。室温で66%DCM / 33%メタノール中で振とうしながら3時間インキュベートする。
      注:サンプルは、100%メタノール中で脱水した直後に室温で一晩放置することができます。
    2. 100%DCM中で室温で2回(振とうしながら)15分間インキュベートし、MeOHを洗浄します。
    3. 室温で振とうせずにジベンジルエーテル(DBE)中でインキュベートします。サンプルの酸化を防ぐために、チューブがDBEでほぼ完全に満たされていることを確認してください。イメージングの前に数回反転させて、溶液を混合し続けます。

5. ライトシートイメージング

注:iDISCOの組織クリア脳は、2X/0.5 NA対物レンズ、相補型金属酸化膜半導体カメラ、顕微鏡操作および画像取得ソフトウェアを備えたライトシート顕微鏡で、皮質内の単一細胞分解能を可能にするため、P4タイムポイントで0.75 x 0.75 x 4 μm/ボクセルで画像化されました(図3A、B)。

  1. サンプル実装
    1. ライトシート顕微鏡の定格作動距離(5.7 mmマイナス0.5 mmの安全マージン)25により、サンプルがz寸法の深さが5.2 mm以下になるように、サンプルを正しいサンプルサイズホルダーに慎重に取り付けます。
    2. ホルダーのネジをクレードルサポートに対して45°の角度で使用して、サンプルクレードルにホルダーを配置します(図1B)。光路がサンプルに対して垂直になるようにクレードルを配置します(図1C)。
  2. イメージングパラメータ
    1. 顕微鏡のズーム本体を倍率 4倍 以上に設定し、0.75μm/ピクセルにします。
      注:P4ライトシート画像のシングルセル計算分析は、0.75 x 0.75 x 4 μm/ボクセル以上の分解能が可能な市販のライトシート顕微鏡で行うことができます。原子核がよりまばらに分布している後の時点の脳には、より低い解像度で十分です。
    2. 画像取得ソフトウェアで、NA = ~0.08(厚さ9 μm/4 μm zステップ)のライトシートを1枚選択します。
      注:この設定と水平ダイナミックフォーカスを組み合わせることで、妥当な時間内にマウス脳の単一細胞解像度で全脳イメージングが可能になります。生後4日目(P4)の脳の場合、画像取得時間は、脳のサイズに応じて、3つのチャネルで11〜15時間と推定されます。
    3. 画像の幅に沿って軸方向の解像度を維持するには、「 水平ダイナミックフォーカス 」を選択し、レーザー波長に応じて推奨されるステップ数を適用します。P4マウスの脳全体に対して、水平ダイナミックフォーカスを11に設定します。レジストレーションチャンネルに対して各チャンネルの ファインフォーカス を調整します。
      注:ここでは、 TO-PRO-3チャネル(647 nm) がアレン発達マウス脳アトラスに登録されており、すべての核が標識されています。
    4. チャンネルのプロパティに関して、チャンネルごとの レーザー出力 を調整します。
      注:波長が長いほど、短い波長に比べて高いレーザー出力が必要です。たとえば、780 nmは高レーザー出力(70%〜75%)と低露光(50ミリ秒)でイメージングする必要がありますが、647 nmチャネルには平均レーザー出力(40%〜45%)と低露出(50ミリ秒)が必要です。
    5. ライトシート幅を~50%に調整して、シートパワーがこのサンプルサイズのY次元で最適に分布するようにします。
      注:水平ダイナミックフォーカスと組み合わせると、シート幅が50%になると、画像全体に平均パワー分布が得られ、光退色のリスクが軽減されます25。
    6. サンプルのサイズに対してタイルの数を設定し、 タイル 間の オーバーラップ を推奨 15% に設定し、特定のタイル位置にあるスタックごとに各チャネルの画像を順番にキャプチャします。

6. ニューモーフを用いた画像処理

注: NuMorph パイプラインには、3D 画像分析のための 3 つの主要部分 (前処理、分析、評価) があります。これらの部分は、以下で説明するNMp_template.m、NMa_template.m、およびNMe_template.mに編成されています。さらに、NuMorphをスムーズに実行するために必要なソフトウェアパッケージをダウンロードしてインストールするためのNM_setup.mが追加されました。NM_samples.mは、画像取得情報を入力するためのテンプレートも提供します。

  1. ニューモーフのセットアップ
    1. Linux26用のconda環境マネージャーをダウンロードしてインストールします。NuMorph19 画像処理ツールをダウンロードしてインストールします。
    2. コマンド ラインで Matlab を実行します。NuMorphからNM_setup.mを実行し 、解析に必要な画像解析ソフトウェアパッケージをダウンロードしてインストールします。
      注: この手順により、conda 環境が適切にセットアップされ、Matlab が 3 つのパイプラインのそれぞれを実行するために必要なすべてのツールとアドオンが正しくダウンロードおよびインストールされます。ここで最も注目すべきは、登録を実行するためのElastixと、細胞の検出とカウントのための3D-Unetです。
  2. サンプル名、入力ディレクトリと出力ディレクトリ、チャンネル情報、ライトシートイメージングパラメータを指定するには、ファイル NM_samples.m を編集します。
    注:ここでは、正しい情報、特に画像入力ディレクトリが正しく指定されていることを確認するために再確認することをお勧めします。通常、後続のステップを実行するまで、ここでエラーは呼び出されません。
  3. 画像前処理
    1. 強度調整
      1. NMp_templateで、 強度調整 = true を設定します。
        注: 強度の調整が必要な場合は、true に設定します。そうでない場合は、 強度調整 = false を設定します。「update」を使用して以前の調整パラメータを上書きするオプションもあります。
      2. 新しい画像セットを操作する場合は、 処理済み画像を使用する = false を設定します。それ以外の場合は、出力ディレクトリに以前に保存した画像データセット ("整列"、"ステッチ済み" など) を後続の処理ステップに使用するように指定します。
        注: このオプションは、入力画像が既に前処理されている場合に提供されます。この場合、前処理された画像が入力画像として使用され、オプションは出力ディレクトリ内のサブディレクトリの名前に設定されます。
      3. 保存画像を設定する = true。
        注: このオプションを使用すると、処理されたイメージが出力ディレクトリに保存されます。それ以外の場合は、パラメーターのみが計算されて保存されます。
      4. 保存サンプルの設定 = true。
        注: このオプションを使用すると、主要なステップごとにサンプル結果が保存されます。
      5. BaSiCアルゴリズム27を使用してシェーディング補正を適用するには、タイルシェーディングの調整=基本を設定するか、特定のライトシート幅でのライトシート顕微鏡からの測定値を使用してタイルシェーディング補正を適用するには手動を設定します。
        注: このオプションは、シートウエストの形状に起因する y 寸法に沿った不均一な照明を補正します。
    2. 画像チャンネルの位置合わせ
      1. NMp_template では、 チャネル アライメント = true を設定します。チャネルの位置合わせが必要な場合は、このオプションを true に設定します。そうでない場合は、false に設定します。チャネル アライメント方法を平行移動 (リジッド) または elastix (非リジッド) に設定します。
        注:平行移動法は、複数のチャネルを整列させる際に剛体2Dレジストレーションアプローチを利用しますが、elastix法は、長い画像取得中に発生する可能性のある回転ドリフトを補正するために非剛体Bスプライン28 を利用します19。
    3. 反復画像スティッチング
      1. NMp_templateでは、 ステッチ画像=trueを設定します。
        注: ステッチが必要な場合は、このオプションを true に設定します。
      2. ふるいの絞り込み = true を設定します。
        注: このオプションは、[スケール不変フィーチャ変換29] を使用して xy での変換をさらに絞り込むために使用されます。
      3. 荷重アライメントパラメータ = true を設定します。
        メモ: このオプションは、スティッチング中にチャンネルアライメント変換を利用します。このオプションは、マルチチャネルイメージングで推奨されます。それ以外の場合は、false に設定します。
      4. オーバーラップ = 0.15 を設定して、イメージング中のタイルのオーバーラップを一致させます。
    4. これらの前処理手順のいずれかを実行するには、環境外の Matlab で次のコマンドを実行しますNMp_template。
      1. サンプル名を指定します。 設定 = NM_config(プロセス、サンプル)を設定します。
      2. NM_process(config,stage)を指定して前処理ステップを実行し、任意のプロセスに対して強度、整列、またはステッチを使用してステージを指定します。各ステージの出力ファイルの出力ディレクトリーを確認してください (図 3 および 図 4)。
  4. 画像解析
    1. ニューモーフ以前
      1. 3D アトラス画像と、各ボクセルを特定の構造に割り当てる関連するアノテーション画像から始めます。
        注:ここでは、マゼランマッパー30 から生成されたP4アレン発達マウスブレインアトラスが使用されています。
      2. 地図帳画像と注釈ファイルの両方を位置合わせして、正しい方向に正しく一致するようにします。
    2. ニューモーフ内
      注:アトラスとその注釈が正しく配置されたので、後で使用するために保存できるように、ファイルをNuMorph内で「マング」または処理する必要があります。これを行うには、munge_atlas関数を使用して、次に示すように入力を指定します。
      1. Atlas_file: (文字列) を指定します。アトラスファイルへのフルパスを指定します。
      2. Annotation_file: (文字列) を指定します。関連付けられた注釈への完全パスを指定します。
      3. 解像度の指定: (1x3 数値)。アトラスのy、x、z解像度をミクロン/ピクセルで指定します。
      4. 方向の指定: (1 x 3 文字)。アトラスの向きを指定し、クレードル内のサンプルのセットアップ(前部(a)/後部(p)、上(s)/下(i)、左(l)/右(r))と一致していることを確認します。
      5. 半球を指定: 画像化された脳半球を指定します(「左」、「右」、「両方」、「なし」)。
      6. out_resolution:(int) を指定します。アトラス出力の等方性分解能をミクロン単位で指定します。(デフォルト: 25)。
      7. コマンド "munge_atlas(atlas_file, annotation_file, 解像度, 方向, 半球)" を実行して、/data/annotation_data にマング注釈を生成し、/data/atlas にアトラス画像のコピーを生成します。
      8. Matlab構造とアトラスファイルを読み込んで、両方のファイルが正しい方向に正しくマングされていることを確認します。
        注:免疫標識タンパク質マーカーの共局在に基づいて細胞型を定量するために、追加の細胞分類ステップを実行できます。
    3. リサンプリング
      1. NMa_template、アトラスを参照するか、高解像度データセットのダウンサンプリングされたボリュームを生成するために画像登録を実行する場合は、 リサンプリング画像= trueに設定します。
        注意: NMa_template.mは、リサンプリング、レジストレーション、核検出、および細胞カウントのパラメーターを設定するために使用されます。
      2. アトラスと一致するようにリサンプル解像度を設定します。
        注:ここでは、参照アトラスがこの解像度であるため、25 μm3/ボクセル等方性分解能を使用しています。
      3. リサンプリングするチャンネル番号をリサンプルチャンネル=[]で指定します。
        注:ここでは、チャネル番号が核チャネルと一致するように設定されています。このオプションが空の場合、登録チャネルのみがリサンプリングされます。
    4. 登録
      1. NMa_templateでは、 レジスタ イメージ = true を設定します。登録が必要な場合は true に設定します。そうでない場合は、登録 = false を設定します。
      2. atlas ディレクトリ内のファイルと一致するように atlas ファイルを指定します。
      3. 登録パラメータの設定 = デフォルト。
        注: このオプションでは、アフィンの後に B スプライン変換を使用して、空間的対応を推定します。それ以外の場合は、Elastix を使用して /data/elastix_parameter_files/atlas_registration の新しい登録パラメータのセットを定義します。
      4. 登録した画像を保存する = true を設定します。
        注:登録およびリサンプリングからの出力ファイルは、MatlabまたはFIJI31などの他の視覚化ツールでダウンロードして視覚的に検査できます。
    5. 核検出、細胞計数および分類
      注:ここで発生するエラーは、注釈ファイルを正しく指定していないか、サンプルの年齢を正しい注釈と一致していないことが原因である可能性があります。
      1. NMa_templateでは、 核のカウント と 細胞の分類の両方を=trueに設定します。
      2. カウント方法の設定 = 3dunet。
        注: このオプションを使用すると、トレーニング済みの 3D-Unet モデル19 を使用できます。それ以外の場合は、ヘッセブロブ検出方法を利用するヘッセを選択します。
      3. min_intensityを設定して、検知されたオブジェクトの最小強度しきい値を定義します。
        注:適切なしきい値は、核標識の信号対雑音比に基づいて経験的に決定されます。
      4. classify_methodを、重心位置での教師なし蛍光強度に基づく閾値、または教師あり線形サポートベクターマシン(SVM)分類器をモデル化するsvmのいずれかに設定します。
        注:この手順では、検出されたすべての細胞を3チャネルイメージングで4つの主要なクラスに分類します。このプロトコルでは、Ctip2+/Brn2-、Ctip2-/Brn2+、Ctip2-/Brn2-、および外れ値が生成されます。
    6. 分析手順
      1. サンプル名を指定します。 設定 =NM_config(分析、サンプル) を設定します。
      2. NM_analyze(config,stage)を指定していずれかの解析ステップを実行し、リサンプリング、レジスタ、カウント、または分類を使用してステージを指定します。各ステージの出力ファイルの出力ディレクトリーを確認します (図 5)。
    7. 細胞型分類とグループ解析
      1. NMe_template で、 update = true を設定し 、以前に計算されたすべての統計情報を上書きします。
        注:NMe_template.mには、分析対象の同じ脳の脳領域全体で細胞型グループ分析を実行するオプションがあります。
      2. compare_structures_byをインデックスに設定してすべての一意の注釈で比較するか、テーブルに従って構造を比較するテーブルに設定します。
      3. 可能なすべての構造インデックスを指定し、/annotations に存在する必要がある template_fileを設定します。
      4. structure_tableを設定し、評価する構造体を指定します。
      5. NMa_template.mで説明されているように、細胞カウントと細胞タイプの分類を指定します。
      6. 比較するグループを指定するには 、[compare_groups ] を設定します。
      7. 対応のある t 検定または 2 標本の t 検定を実行するには、対応のある true または false に設定します。
    8. 分析を実行します。
      注: この手順を実行するには、NMe_template.m 環境外の Matlab で次のコマンドを実行します。
      1. サンプル名を指定します。 設定 =NM_config(評価、サンプル) を設定します。
      2. NM_evaluate(config,stage)を指定して解析ステップを実行し、ステージを指定します。グループ分析の出力ディレクトリで出力ファイルを確認します。

結果

iDISCO+プロトコルでは、目で簡単にわかる有意な組織収縮が発生するため(図2B)、組織透明化の前にこのパイプラインにMRIステップを追加して、組織透明化によって誘発される収縮を定量化しました。ワークフローは、MR画像から非脳組織を除去することから始まります(図2C)。次に、剛体変換(3つの並進角度と3つの回転角度)を適用して、MR画像をラ?...

ディスカッション

組織透明化法は、脳の3D細胞組織を測定するための有用な技術である。文献に記載されている多数の組織透明化方法があり、それぞれに利点と制限があります6、7、8、9。組織クリア画像内の細胞タイプを分析するための計算ツールの選択肢は比較的限られています。他の利用可能なツールは、セ?...

開示事項

著者は開示する利益相反を持っていません。

謝辞

この作業は、NIH(R01MH121433、R01MH118349、およびR01MH120125からJLSおよびR01NS110791からGW)と財団の支援を受けました。サンプルイメージングを支援してくれた顕微鏡サービスラボのPablo Arielに感謝します。病理学および検査医学部門の顕微鏡サービスラボは、ノースカロライナ大学(UNC)ラインバーガー総合がんセンターへのがんセンターコアサポート助成金P30 CA016086によって部分的にサポートされています。神経科学顕微鏡コアは、助成金P30 NS045892によってサポートされています。この出版物で報告された研究は、ノースカロライナバイオテクノロジーセンターの制度的支援助成金2016-IDG-1016によって部分的にサポートされています。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Bruker 9.4T/30 cm MRI ScannerBruker BiospecHorizontal Bore Animal MRI System
Dibenzyl etherSigma-Aldrich108014-1KG
Dichloromethane (DCM)Sigma-Aldrich270997-1L
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Fisher-ScientificICN19605590
Donkey serumSigma-AldrichS30-100ML
EVO 860 4TB external SSD
Fomblin YSpeciality Fluids CompanyYL-VAC-25-6perfluoropolyether lubricant
gadolinium contrast agent (ProHance)Bracco DiagnosticsA9576
gadolinium contrast agent(ProHance)Bracco Diagnostics0270-1111-03
GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPUEVGA08G-P4-6286-KR
GlycineSigma-AldrichG7126-500G
Heparin sodium saltSigma-AldrichH3393-10KUDissolved in H2O to 10 mg/mL
Hydrogen peroxide solution, 30%Sigma-AldrichH1009-100ML
ImSpector ProLaVision BioTecMicroscope image acquisition software
ITK Snapsegmentation software
MethanolFisher-ScientificA412SK-4
MVPLAPO 2x/0.5 NA ObjectiveOlympus
Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA)Sigma-Aldrich30525-89-4Dissolved in 1x PBS to 4%
Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)Corning46-013-CMDiluted to 1x in H2O
Sodium AzideSigma-AldrichS2002-100GDissolved in H2O to 10%
Sodium deoxycholateSigma-AldrichD6750-10G
Tergitol type NP-40Sigma-AldrichNP40S-100ML
TritonX-100Sigma-AldrichT8787-50ML
Tween-20Fisher-ScientificBP337 500
Ultramicroscope II Light Sheet MicroscopeLaVision BioTec
Xeon Processor E5-2690 v4IntelE5-2690
Zyla sCMOS CameraAndorComplementary metal oxide semiconductor camera
AntibodyWorking concentration
Alexa Fluor Goat 790 Anti-RabbitThermofisher ScientificA11369(1:50)
Alexa Fluor Goat 568 Anti-RatThermofisher ScientificA11077(1:200)
Rat anti-Ctip2Abcamab18465(1:400)
Rabbit anti-Brn2Cell Signaling Technology12137(1:100)
To-Pro 3 (TP3)Thermofisher ScientificT3605(1:400)

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