Imagerie unicellulaire du cerveau entier et analyse de cerveaux de souris néonatales intactes à l’aide de l’IRM, du nettoyage des tissus et de la microscopie à feuille de lumière

Résumé

Ce protocole décrit les méthodes d’imagerie par résonance magnétique, d’effacement et d’immunomarquage de cerveaux de souris intacts à l’aide d’iDISCO+, suivies d’une description détaillée de l’imagerie à l’aide de la microscopie à feuille de lumière et des analyses en aval à l’aide de NuMorph.

Résumé

Le nettoyage des tissus suivi de la microscopie à feuille de lumière (LSFM) permet l’imagerie à résolution cellulaire de la structure cérébrale intacte, permettant une analyse quantitative des changements structurels causés par des perturbations génétiques ou environnementales. L’imagerie du cerveau entier permet une quantification plus précise des cellules et l’étude des différences spécifiques à la région qui peuvent être manquées avec la microscopie couramment utilisée des tissus sectionnés physiquement. L’utilisation de la microscopie à feuille de lumière pour imager les cerveaux dégagés augmente considérablement la vitesse d’acquisition par rapport à la microscopie confocale. Bien que ces images produisent de très grandes quantités de données structurelles sur le cerveau, la plupart des outils informatiques qui effectuent la quantification des caractéristiques dans les images de tissus clairsemés se limitent à compter des populations de cellules clairsemées, plutôt que tous les noyaux.

Ici, nous démontrons NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), un groupe d’outils d’analyse, pour quantifier tous les noyaux et marqueurs nucléaires dans les régions annotées d’un cerveau de souris postnatal du jour 4 (P4) après élimination et imagerie au microscope à feuille de lumière. Nous décrivons l’imagerie par résonance magnétique (IRM) pour mesurer le volume cérébral avant le rétrécissement causé par les étapes de déshydratation de l’élimination des tissus, le nettoyage des tissus à l’aide de la méthode iDISCO +, y compris l’immunomarquage, suivi de la microscopie à feuille de lumière à l’aide d’une plate-forme disponible dans le commerce pour imager les cerveaux de souris à la résolution cellulaire. Nous démontrons ensuite ce pipeline d’analyse d’images à l’aide de NuMorph, qui est utilisé pour corriger les différences d’intensité, assembler des tuiles d’image, aligner plusieurs canaux, compter les noyaux et annoter les régions du cerveau grâce à l’enregistrement dans des atlas accessibles au public.

Nous avons conçu cette approche à l’aide de protocoles et de logiciels accessibles au public, permettant à tout chercheur disposant du microscope et des ressources informatiques nécessaires pour effectuer ces techniques. Ces outils de nettoyage tissulaire, d’imagerie et de calcul permettent de mesurer et de quantifier l’organisation tridimensionnelle (3D) des types cellulaires dans le cortex et devraient être largement applicables à toute conception d’étude de souris de type sauvage / knockout.

Introduction

L’imagerie du cerveau entier à une résolution unicellulaire est un défi important en neurosciences. Les images cérébrales à résolution cellulaire permettent une analyse détaillée et une cartographie au niveau du système des circuits cérébraux et de la façon dont ces circuits sont perturbés par des facteurs de risque génétiques ou environnementaux de troubles neuropsychiatriques, le comportement cellulaire dans les embryons en développement, ainsi que les circuits neuronaux dans le cerveau adulte ^1,2,3. Il existe de multiples méthodes histologiques qui permettent d’obtenir des images haute résolution du cerveau 3D reconstruit; cependant, ces techniques nécessitent un équipement spécialisé coûteux, peuvent ne pas être compatibles avec l’immunomarquage, et la nature bidimensionnelle (2D) de certaines méthodes peut entraîner des lésions tissulaires et un cisaillement pendant la sectionnement ^4,5.

Les progrès récents ont fourni une approche alternative pour l’imagerie de cerveaux entiers qui ne nécessite pas de section de tissu; Ils impliquent l’utilisation de l’élimination des tissus pour rendre les cerveaux transparents. La transparence est obtenue dans la plupart des méthodes de nettoyage tissulaire en éliminant les lipides, car ils sont une source majeure de diffusion de la lumière, et en faisant correspondre l’indice de réfraction (RI) de l’objet avec l’IR de la solution d’immersion de l’échantillon pendant l’imagerie. La lumière peut alors traverser la frontière entre les matériaux sans être dispersée 6,7,8,9.

Les méthodes de nettoyage tissulaire, telles que iDISCO+, sont souvent combinées à une imagerie 3D rapide utilisant la microscopie d’excitation monophotonique, telle que LSFM 6,7,10. Dans les tissus transparents marqués avec un fluorophore, la microscopie à fluorescence à feuille de lumière présente des coupes par excitation avec un mince plan de lumière¹¹. Le principal avantage de LSFM est qu’une seule section optique est éclairée à la fois, toute la fluorescence des molécules de cette section étant excitée, ce qui minimise le photoblanchiment. De plus, l’imagerie d’une tranche optique entière permet de détecter cette tranche excitée par caméra, ce qui augmente la vitesse par rapport au balayage ponctuel¹². LSFM produit de manière non destructive des sections optiques bien enregistrées qui conviennent à la reconstruction 3D.

Alors que la méthode iDISCO+ permet un nettoyage des tissus peu coûteux en ~3 semaines, les étapes de déshydratation du protocole peuvent entraîner un rétrécissement des tissus et une altération potentielle de la morphologie de l’échantillon, affectant ainsi les mesures volumétriques ^6,10. L’ajout d’une méthode d’imagerie secondaire, telle que l’IRM, à utiliser avant la procédure de nettoyage des tissus peut mesurer le degré de rétrécissement induit par le nettoyage des tissus dans l’échantillon. Au cours des étapes de déshydratation, les différences de propriétés mécaniques entre la substance grise et la substance blanche peuvent entraîner des déformations non uniformes de la matière cérébrale, entraînant des déformations volumétriques dissemblables induites par la clairance tissulaire entre les échantillons de type sauvage et mutant, et peuvent confondre les interprétations des différences volumétriques dans ces échantillons^10,13 . L’IRM est réalisée en perfusant d’abord l’animal avec un agent de contraste (p. ex. gadolinium), puis en incubant le tissu extrait d’intérêt dans une solution d’immersion (p. ex. fombline) avant l’imagerie¹⁴. L’IRM est compatible avec le nettoyage tissulaire et la réalisation de LSFM sur le même échantillon.

LSFM est souvent utilisé pour créer des images de microscopie à grande échelle pour la visualisation qualitative du tissu cérébral d’intérêt plutôt que pour l’évaluation quantitative de la structure du cerveau (Figure 1). Sans évaluation quantitative, il est difficile de démontrer les différences structurelles résultant d’agressions génétiques ou environnementales. À mesure que les technologies de nettoyage et d’imagerie des tissus s’améliorent, ainsi que la diminution des coûts de stockage et de puissance de calcul, la quantification des localisations des types cellulaires dans le tissu d’intérêt devient plus accessible, ce qui permet à un plus grand nombre de chercheurs d’inclure ces données dans leurs études.

Avec plus de 100 millions de cellules dans le cerveau de la souris¹⁵ et des séances d’imagerie du cerveau entier qui peuvent générer des téraoctets de données, il existe une demande accrue d’outils d’analyse d’images avancés qui permettent une quantification précise des caractéristiques des images, telles que les cellules. Il existe une foule de méthodes de segmentation pour les images effacées par les tissus qui appliquent un seuil pour l’intensité de la coloration nucléaire et filtrent les objets avec des formes, des tailles ou des densités prédéfinies^10,16,17,18. Cependant, des interprétations inexactes des résultats peuvent résulter de variations de paramètres tels que la taille de la cellule, le contraste de l’image et l’intensité de l’étiquetage. Cet article décrit notre protocole établi pour quantifier les noyaux cellulaires dans le cerveau de la souris. Tout d’abord, nous détaillons les étapes de collecte de tissus du cerveau de souris P4, suivies d’un protocole de nettoyage tissulaire et d’immunomarquage optimisé à partir de la méthode iDISCO+¹⁰ accessible au public. Deuxièmement, nous décrivons l’acquisition d’images à l’aide de l’IRM et de la microscopie à feuille de lumière, y compris les paramètres utilisés pour capturer des images. Enfin, nous décrivons et démontrons NuMorph¹⁹, un ensemble d’outils d’analyse d’images que notre groupe a développés et qui permet la quantification spécifique du type cellulaire après nettoyage des tissus, l’immunomarquage avec des marqueurs nucléaires et l’imagerie par feuille de lumière des régions annotées.

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Protocole

Toutes les souris ont été utilisées conformément et approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Caroline du Nord à Chapel Hill.

1. Dissection et perfusion de souris

NOTE: Les dissections suivantes ont été effectuées sur des souris P4 et P14 à l’aide d’une seringue. Le volume de liquide de perfusion variera en fonction de l’âge de l’animal.

1. Perfusion
   ATTENTION : Le paraformaldéhyde (PFA) est un produit chimique dangereux. Effectuer toutes les étapes de perfusion dans une hotte chimique.
   1. Avant la chirurgie, administrer du pentobarbital par injection intrapéritonéale (100 mg / kg) et laisser l’anesthésique faire effet.
   2. Une fois que l’animal a atteint un plan chirurgical d’anesthésie, utilisez la méthode de réponse par pincement des orteils pour confirmer l’absence de réponse.
   3. Faites une incision latérale sous la cage thoracique pour exposer la cavité thoracique de l’animal.
   4. À l’aide de ciseaux chirurgicaux incurvés, coupez soigneusement à travers la cage thoracique jusqu’à la clavicule d’un côté de l’animal et faites une coupe identique du côté opposé, permettant au sternum d’être soulevé, exposant le cœur.
   5. Sans endommager l’aorte descendante, coupez soigneusement tout tissu relié au cœur avant de faire une petite incision sur l’oreillette droite pour permettre au sang de s’écouler hors du système vasculaire.
   6. À l’aide d’une méthode à base de seringue, perfuser la souris à travers le ventricule gauche avec 10 mL et 7 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour P14 et P4, respectivement, avec un taux de perfusion de 1,5 mL/min à travers le système.
   7. Une fois le sang éliminé, perfuser à nouveau avec 10 mL de PBS + 4% PFA et 7 mL de PBS + 4% PFA pour P14 et P4, respectivement, à 4 °C avec un taux de perfusion de 1,5 mL/min pour fixer l’animal.
      REMARQUE: Des tremblements de fixation seront observés et l’animal sera raide à la fin. Si vous utilisez l’IRM sur des échantillons, perfuser avec des volumes similaires de PBS et de PFA pour chaque point temporel + 20% d’agent de contraste IRM à base de gadolinium dans la solution PFA.
   8. Retirer la tête à l’aide de ciseaux chirurgicaux et poser avec du PBS + 4% PFA pendant 24 h à 4 °C pour une fixation complète.
      REMARQUE: À ce stade, le cerveau reste intact avec le crâne (voir rubrique 2). Point de pause: les cerveaux peuvent être stockés pendant plusieurs mois à ce stade dans du PBS + 0,1% d’azoture de sodium à 4 °C.

2. Imagerie de la structure cérébrale globale basée sur l’IRM avec crâne intact et analyse

REMARQUE: Le cerveau doit être perfusé et incubé dans le gadolinium comme décrit ci-dessus sans être retiré du crâne. Toute IRM se produit avant l’ablation du cerveau du crâne pour éviter la perte tissulaire involontaire pendant la dissection. L’imagerie avec un crâne intact fournit également un soutien au cerveau dans le porte-échantillon (c.-à-d. seringue) pendant la préparation et l’imagerie de l’échantillon.

1. Préparation des échantillons
   REMARQUE: Les étapes suivantes sont optimisées pour les échantillons de cerveau de souris P4 et P14. La taille de la seringue nécessaire dépendra de la taille physique de l’échantillon.
   1. Si vous effectuez une IRM sur l’échantillon, retirer la peau du crâne et incuber dans PBS + 3% de gadolinium pendant 23 jours à 4 °C avant l’imagerie¹⁴. Après 23 jours, rincer rapidement les échantillons dans PBS.
   2. Utilisez des seringues de 5 mL pour créer un porte-échantillon pour l’IRM, en utilisant des pistons de seringue pour fermer chaque extrémité du support fabriqué avec la seringue²⁰. Utilisez des morceaux de plastique pour maintenir le crâne bien en place dans le support (figure 2A). Enlevez les marques sur la seringue avec de l’éthanol pour éviter les artefacts lors de l’imagerie.
   3. Placez solidement le crâne dans le porte-échantillon et remplissez-le avec une solution d’immersion compatible avec l’IRM (voir le tableau des matériaux). Fermez le support et retirez toutes les bulles d’air à l’aide d’une seringue.
      REMARQUE: Point de pause: Le crâne peut être stocké dans la solution d’immersion pendant plusieurs mois avant l’imagerie.
2. Imagerie de la structure cérébrale globale (IRM)
   1. Imagez les échantillons avec un système d’IRM animale à alésage horizontal de 9,4 T/30 cm à l’aide d’une bobine de volume de 15 mm et d’une séquence basée sur l’écho de spin avec les paramètres suivants : Résolution spatiale : 60 μm x 60 μm x 60 μm ; Temps total d’analyse: 7 h 12 min; temps d’écho (TE): 6,83 ms; temps de répétition (TR): 40 ms; angles de retournement d’excitation/recentrage : 90/180 degrés ; Taille de l’image: 166 x 168 x 209 voxels; Champ de vision (FOV) : 9,9 mm x 10,1 mm x 12,4 mm ; bande passante : 100 000 kHz.
3. Analyse computationnelle de la structure cérébrale globale
   1. Retirez le crâne environnant des images IRM brutes en traçant manuellement le cerveau de la souris à l’aide d’un logiciel de segmentation. Ensuite, appliquez l’opération de multiplication au niveau du voxel entre l’image du masque et l’image IRM brute pour générer l’image IRM cérébrale dénudée du crâne.
      REMARQUE: La sortie est une image de masque binaire où l’intensité pour les voxels cérébraux est définie sur 1 et 0 autrement.
   2. Appliquer l’enregistrement d’image rigide (estimation uniquement de la translation et de la rotation) en utilisant « flirt » dans le paquet FSL^21,22 pour aligner l’image IRM dénudée du crâne (image en mouvement) à l’image de microscopie à feuille de lumière correspondante (image de référence).
   3. Appliquez l’enregistrement non rigide (en utilisant 'SyN' dans le logiciel ANTS²³) pour trouver les correspondances point à point entre l’image IRM alignée rigide à l’étape 2.3.2 et l’image de feuille de lumière (même image de référence à l’étape 2.3.2).
      REMARQUE: La sortie inclut l’image IRM déformée et le champ de déformation associé aux changements de volume de l’IRM aux images de feuille de lumière.
   4. Calculer le déterminant jacobien sur le champ de déformation généré à l’étape 2.3.3, qui quantifie le changement de volume dans un voisinage local de 3 x 3 x 3 voxels.
   5. Alignez les images dénudées du crâne sur l’Atlas du cerveau de souris Allen Developmental à l’aide de l’enregistrement d’images déformables.
      REMARQUE : La correspondance spatiale point à point établie permet l’annotation automatique des régions cérébrales d’intérêt dans la nouvelle image de la souris (Figure 2C-H).

3. Dissection cérébrale du crâne

1. Faites une incision médiane le long du haut du crâne, du cou au nez pour exposer le crâne.
2. Exposez la base du crâne en coupant le muscle du cou restant et tout autre muscle résiduel.
3. À l’aide de ciseaux chirurgicaux tranchants, coupez soigneusement le long de la surface interne du crâne, en prenant soin de ne pas endommager le cerveau en maintenant une légère pression ascendante tout en coupant avec l’équipement chirurgical tranchant.
4. Utilisez une pince à épiler pour décoller les deux moitiés coupées du crâne loin du cerveau et couper soigneusement l’excès de graisse attaché au cerveau.
5. Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour couper toute dure-mère qui relie le cerveau au crâne, puis utilisez une spatule pour retirer doucement le cerveau de la tête.
6. Retirer le cerveau, laver avec du PBS, puis passer au PBS avec de l’azoture de sodium à 0,1% et conserver à 4 °C pour un stockage à long terme.

4. Nettoyage des tissus

REMARQUE: Ce protocole est adapté du protocole iDISCO + pour les souris P4⁶, avec des modifications mineures. Certains détails peuvent changer pour différents points temporels / espèces / expériences). ATTENTION : Le méthanol, le dichlorométhane (DCM) et l’éther dibenzylique (DBE) sont des produits chimiques dangereux. Ces étapes de nettoyage des tissus sont effectuées dans une hotte chimique.

1. Validation des anticorps
   REMARQUE: La compatibilité au méthanol des anticorps non testés doit être vérifiée car ils peuvent être affectés négativement par les lavages sévères au méthanol requis dans le protocole iDISCO +. Pour une liste des anticorps qui ont fait leurs preuves dans iDISCO+, consultez le site Web²⁴.
   1. Prélever des sections congelées de 10 μm du tissu d’intérêt fixé au PFA sur des lames stéréologiques.
   2. Incuber les sections dans du méthanol à 100% pendant 3 h à température ambiante.
   3. Réhydratez-vous dans PBS avant de procéder aux protocoles d’immunohistochimie standard pour déterminer si l’anticorps présente le modèle de fluorescence attendu après le lavage au méthanol. Pour un contrôle positif, utilisez une lame non traitée au méthanol.
2. Préparation du tampon
   1. Préparez les tampons selon le protocole officiel iDISCO. Voir le tableau des matériaux pour la composition des tampons et autres solutions utilisées dans ce protocole.
3. Prétraitement
   1. Déshydrater l’échantillon avec la série méthanol/PBS : 20 %, 40 %, 60 %, 80 %, 100 %; 1 h chacun à température ambiante.
      REMARQUE: L’utilisation de PBS pendant la déshydratation aide à prévenir la fissuration des échantillons lors des lavages au méthanol.
   2. Laver l’échantillon dans du méthanol à 100 % pendant 1 h, puis refroidir à 4 °C pendant 1 h avant d’incuber pendant une nuit en agitant dans du méthanol à 66 % de DCM/33 % à température ambiante.
   3. Lavez l’échantillon 2x dans du méthanol à 100% à température ambiante, puis refroidissez-le à 4 °C.
   4. Utiliser du méthanol frais à 5 %_H2O2dans du méthanol pour blanchir l’échantillon pendant une nuit à 4 °C.
   5. Réhydrater l’échantillon avec la série méthanol/PBS : 80 %, 60 %, 40 %, 20 %, PBS; 1 h chacun à température ambiante et laver 2x pendant 1 h dans PTx.2 à température ambiante.
   6. Incuber l’échantillon dans 1x PBS/0,2 % TritonX-100/20 % de DMSO à 37 °C pendant la nuit.
   7. Incuber l’échantillon dans 1x PBS/0,1 % Tween-20/0,1 % TritonX-100/0,1 % de désoxycholate/0,1 % NP40/20 % de DMSO à 37 °C pendant la nuit.
   8. Laver deux fois au PTx.2 à température ambiante pendant 1 h.
4. Immunomarquage
   1. Incuber les échantillons dans une solution de perméabilisation à 37 °C pendant 2 jours (~48 h).
   2. Bloquer les échantillons dans la solution de blocage à 37 °C pendant 2 jours (~48 h).
   3. Incuber les échantillons avec des anticorps primaires dans le sérum PTwH / 5 % DMSO / 3 % à 37 °C pendant 4 jours (~96 h) (p. ex. anticorps monoclonal Brn2/POU3F2 (1:100) et anticorps anti-Ctip2 rat(Rt) (1:400) (tableau des matériaux).
   4. Lavez 3 x 1 h dans PTwH. Laver encore 2 h dans PTwH. Laisser dans la solution de lavage toute la nuit à température ambiante.
   5. Incuber les échantillons avec un anticorps secondaire et un colorant nucléaire, tel que TO-PRO-3, dans du sérum PTwH / 3% à 37 °C pendant 4 jours (~96 h; par exemple, anti-Rb de chèvre (1:50) et (anti-Rt de chèvre (1:200)) (Tableau des matériaux).
   6. Laver 3 x 1 h dans PTwH Laver pendant encore 2 h dans PTwH. Laisser dans la solution de lavage toute la nuit à température ambiante.
5. Clairière
   1. Déshydrater dans la série méthanol/PBS - 20%, 40%, 60%, 80%, 100%-1 h chacun à température ambiante. Incuber pendant 3 h, en agitant, dans 66% DCM / 33% méthanol à température ambiante.
      NOTE: L’échantillon peut être laissé toute la nuit à température ambiante immédiatement après la déshydratation dans du méthanol à 100%.
   2. Incuber à 100% DCM pendant 15 min deux fois à température ambiante (avec agitation) pour laver le MeOH.
   3. Incuber dans l’éther dibenzylique (DBE) sans agiter à température ambiante. Assurez-vous que le tube est rempli presque complètement de DBE pour éviter l’oxydation de l’échantillon. Terminez de mélanger la solution en l’inversant plusieurs fois avant l’imagerie.

5. Imagerie par feuille de lumière

REMARQUE: Les cerveaux nettoyés par les tissus iDISCO ont été imagés avec un microscope à feuille de lumière, équipé d’un objectif 2X / 0,5 NA, d’une caméra semi-conductrice complémentaire à oxyde métallique et d’un logiciel de fonctionnement et d’acquisition d’images à 0,75 x 0,75 x 4 μm / voxel pour le point de temps P4, car cela permettait une résolution unicellulaire dans le cortex (Figure 3A, B).

1. Montage de l’échantillon
   1. Montez soigneusement l’échantillon dans le porte-échantillon approprié de manière à ce que l’échantillon soit orienté avec une profondeur maximale de 5,2 mm de dimension z en raison de la distance de travail nominale du microscope à feuille de lumière (5,7 mm moins marge de sécurité de 0,5 mm)²⁵.
   2. Placer le support dans le socle d’échantillon avec la vis du support à un angle de 45° par rapport aux supports du berceau (figure 1B). Positionner le berceau de manière à ce que le trajet de la lumière soit perpendiculaire à l’échantillon (figure 1C).
2. Paramètres d’imagerie
   1. Réglez le corps du zoom sur le microscope sur un grossissement 4x ou supérieur pour obtenir 0,75 μm/pixel.
      REMARQUE: Les analyses informatiques à cellule unique sur des images de feuille de lumière P4 peuvent être effectuées avec n’importe quel microscope à feuille de lumière disponible dans le commerce qui permet une résolution de 0,75 x 0,75 x 4 μm / voxel ou plus. Une résolution plus faible est suffisante pour les cerveaux à des moments ultérieurs dans lesquels les noyaux sont plus peu distribués.
   2. Dans le logiciel d’acquisition d’images, sélectionnez une seule feuille de lumière avec un NA = ~0,08 (épaisseur 9 μm/pas de 4 μm z).
      REMARQUE: Ce réglage combiné à la focalisation dynamique horizontale permet l’imagerie du cerveau entier à une résolution unicellulaire du cerveau d’une souris dans un délai raisonnable. Pour un cerveau postnatal du jour 4 (P4), le temps d’acquisition d’images est estimé à 11-15 h pour trois canaux en fonction de la taille du cerveau.
   3. Pour vous assurer que la résolution axiale est maintenue sur toute la largeur de l’image, sélectionnez Mise au point dynamique horizontale et appliquez le nombre d’étapes recommandé en fonction de la longueur d’onde laser. Pour un cerveau de souris P4 entier, réglez la mise au point dynamique horizontale sur 11. Ajustez Fine Focus pour chaque canal par rapport au canal d’enregistrement.
      REMARQUE: Ici, le canal TO-PRO-3 (647 nm) est enregistré dans l’Atlas du cerveau de souris Allen Developmental car il marque tous les noyaux.
   4. Ajustez la puissance laser par canal par rapport aux propriétés du canal.
      REMARQUE: Les longueurs d’onde plus longues nécessitent une puissance laser plus élevée par rapport aux longueurs d’onde plus courtes. Par exemple, le 780 nm doit être imagé à une puissance laser élevée (70% - 75%) et une faible exposition (50 ms), tandis que le canal 647 nm nécessite une puissance laser moyenne (40% - 45%) et une faible exposition (50 ms).
   5. Ajustez la largeur de la feuille de lumière à ~50 % pour vous assurer que la puissance de la feuille est répartie de manière optimale dans la dimension y pour cette taille d’échantillon.
      REMARQUE: En combinaison avec la mise au point dynamique horizontale, une largeur de feuille de 50% fournit une répartition moyenne de la puissance sur l’image avec un risque réduit de photoblanchiment²⁵.
   6. Définissez le nombre de tuiles par rapport à la taille de l’échantillon avec un chevauchement recommandé de 15 % entre les tuiles, et capturez des images pour chaque canal séquentiellement pour chaque pile à une position de tuile donnée.

6. Traitement d’images à l’aide de NuMorph

REMARQUE : Le pipeline NuMorph comporte trois parties principales pour l’analyse d’images 3D : prétraitement, analyse et évaluation. Ces parties ont été organisées en NMp_template heures, NMa_template heures et NMe_template heures, respectivement, qui sont examinées ci-dessous. De plus, NM_setup.m est ajouté pour télécharger et installer les packages logiciels nécessaires au bon fonctionnement de NuMorph. NM_samples.m fournit également un modèle pour saisir des informations d’acquisition d’images.

1. Configuration de NuMorph
   1. Téléchargez et installez conda environment manager pour Linux²⁶. Téléchargez et installez les outils de traitement d’image NuMorph¹⁹ .
   2. Sur la ligne de commande, exécutez Matlab. Exécutez NM_setup.m à partir de NuMorph pour télécharger et installer les logiciels d’analyse d’images nécessaires aux analyses.
      REMARQUE: Cette étape garantit que l’environnement conda est correctement configuré et que tous les outils et modules complémentaires nécessaires à Matlab pour exécuter chacun des trois pipelines sont téléchargés et installés correctement. Les plus remarquables ici sont Elastix pour l’enregistrement en cours d’exécution et 3D-Unet pour la détection et le comptage des cellules.
2. Spécifiez les noms d’échantillons, les répertoires d’entrée et de sortie, les informations sur les canaux et les paramètres d’imagerie de feuille de lumière en modifiant le fichier NM_samples.m.
   REMARQUE: Ici, il est recommandé de vérifier pour s’assurer que les bonnes informations, en particulier le répertoire d’entrée d’image, sont spécifiées correctement. Les erreurs ne sont généralement pas appelées ici avant l’exécution des étapes suivantes.
3. Prétraitement d’image
   1. Ajustement de l’intensité
      1. Dans le NMp_template, réglez le réglage de l’intensité = vrai.
         REMARQUE : Définissez sur true si un réglage de l’intensité est nécessaire. Si ce n’est pas le cas, réglez le réglage de l’intensité = false. Il existe également une option permettant d’utiliser 'update' pour écraser les paramètres de réglage précédents.
      2. Définir utiliser les images traitées = false lorsque vous travaillez avec un nouvel ensemble d’images. Sinon, indiquez tous les jeux de données d’images précédemment enregistrés dans le répertoire de sortie (par exemple, « aligné », « assemblé ») à utiliser pour les étapes de traitement suivantes.
         REMARQUE: Cette option est fournie dans le cas où les images d’entrée ont déjà été prétraitées. Dans ce cas, les images prétraitées seront utilisées comme images d’entrée et l’option sera définie sur le nom du sous-répertoire dans le répertoire de sortie.
      3. Définir enregistrer les images = true.
         REMARQUE: L’utilisation de cette option garantit que les images traitées sont enregistrées dans le répertoire de sortie; Sinon, seuls les paramètres seront calculés et enregistrés.
      4. Définir les échantillons de sauvegarde = true.
         Remarque : Cette option garantit que les résultats des exemples sont enregistrés pour chaque étape principale.
      5. Réglez l’ombrage des carreaux = basique pour appliquer la correction de l’ombrage à l’aide de l’algorithme BaSiC²⁷ ou manuel pour appliquer la correction de l’ombrage des carreaux à l’aide des mesures du microscope à feuille de lumière à des largeurs de feuille de lumière spécifiques.
         REMARQUE: Cette option corrige l’éclairage inégal le long de la dimension y causé par la forme de la taille de la feuille.
   2. Alignement du canal d’image
      1. Dans NMp_template, définissez alignement des canaux = true. Définissez cette option sur true si l’alignement des canaux est requis. Si ce n’est pas le cas, définissez sur false. Définissez la méthode d’alignement des canaux sur translation (rigide) ou elastix (non rigide).
         REMARQUE: La méthode de translation utilise des approches d’enregistrement 2D rigides pour aligner plusieurs canaux tandis que la méthode elastix utilise des B-splines non rigides²⁸ pour corriger la dérive de rotation, qui peut se produire lors de l’acquisition d’images longues¹⁹.
   3. Assemblage itératif d’images
      1. Dans NMp_template, définissez les images de point = true.
         Remarque : Définissez cette option sur true si l’assemblage est nécessaire.
      2. Définir le raffinement du tamis = true.
         Remarque : Cette option est utilisée pour affiner davantage la traduction dans xy à l’aide de la transformation de fonctionnalité d’invariant d’échelle²⁹.
      3. Définir les paramètres d’alignement de charge = true.
         Remarque : Cette option utilise les translations d’alignement de canal pendant l’assemblage. Cette option est recommandée avec l’imagerie multicanal. Sinon, affectez la valeur false.
      4. Définissez le chevauchement = 0,15 pour faire correspondre les chevauchements de tuiles pendant l’imagerie.
   4. Pour exécuter l’une de ces étapes de prétraitement, exécutez la commande suivante dans Matlab en dehors de NMp_template environnement :
      1. Spécifiez le nom de l’exemple. Set config = NM_config(processus,exemple).
      2. Exécutez l’une des étapes de prétraitement en spécifiant NM_process(config,stage) et spécifiez l’étape à l’aide de l’intensité, de l’alignement ou de l’assemblage de l’un des processus. Vérifiez le répertoire de sortie des fichiers de sortie pour chacune des étapes (Figure 3 et Figure 4).
4. Analyse d’images
   1. Avant NuMorph
      1. Commencez avec une image d’atlas 3D et une image d’annotation associée qui attribue chaque voxel à une structure particulière.
         REMARQUE: L’Atlas du cerveau de souris P4 Allen Developmental Mouse généré à partir du MagellanMapper³⁰ est utilisé ici.
      2. Alignez l’image de l’atlas et le fichier d’annotation pour vous assurer qu’ils correspondent correctement dans la bonne orientation.
   2. Dans NuMorph
      REMARQUE: Maintenant que l’atlas et ses annotations sont correctement alignés, les fichiers doivent être « munged » ou traités dans NuMorph afin qu’ils puissent être enregistrés pour une utilisation ultérieure. Pour ce faire, utilisez la fonction munge_atlas pour spécifier les entrées comme indiqué ci-dessous.
      1. Spécifiez Atlas_file : (chaîne). Indiquez le chemin d’accès complet au fichier atlas.
      2. Spécifiez Annotation_file : (chaîne). Indiquez le chemin d’accès complet aux annotations associées.
      3. Spécifiez la résolution : (1x3 numérique). Spécifiez la résolution de l’atlas y,x,z en micron par pixel.
      4. Spécifiez l’orientation : (1 x 3 caractères). Fournir l’orientation de l’atlas et s’assurer qu’elle correspond à la configuration de l’échantillon dans le berceau (antérieur(a)/postérieur(p),supérieur(s)/inférieur(i),gauche(l)/droite(r)).
      5. Spécifier l’hémisphère : spécifiez quel hémisphère cérébral a été imagé (« gauche », « droite », « les deux », « aucun »).
      6. Spécifiez out_resolution:(int). Spécifiez la résolution isotrope de la sortie de l’atlas en microns. (valeur par défaut : 25).
      7. Exécutez la commande « munge_atlas(atlas_file, annotation_file, résolution, orientation, hémisphère) » pour générer des annotations munged dans /data/annotation_data et une copie de l’image de l’atlas dans /data/atlas.
      8. Lisez la structure Matlab et le fichier atlas pour vérifier que les deux fichiers sont correctement munged dans la bonne orientation.
         REMARQUE: Une étape supplémentaire de classification cellulaire peut être effectuée pour quantifier les types de cellules en fonction de la colocalisation de marqueurs protéiques immunomarqués.
   3. Rééchantillonnage
      1. Dans NMa_template, définissez resample images = true, si vous effectuez un enregistrement d’image pour référencer l’atlas ou pour générer des volumes sous-échantillonnés de jeux de données haute résolution.
         REMARQUE: Le NMa_template.m sera utilisé pour définir les paramètres de rééchantillonnage, d’enregistrement, de détection des noyaux et de comptage des cellules.
      2. Définissez la résolution de rééchantillonnage pour qu’elle corresponde à l’atlas.
         REMARQUE: Ici, une résolution isotrope 3 μm^/ voxel est utilisée car l’atlas de référence est à cette résolution.
      3. Spécifiez le numéro de canal à rééchantillonner à l’aide des canaux de rééchantillonnage = [ ].
         REMARQUE: Ici, le numéro de canal est défini pour correspondre au canal nucléaire. Si cette option est vide, seul le canal d’enregistrement sera rééchantillonné.
   4. Inscription
      1. Dans NMa_template, définissez les images de registre = true. Affectez la valeur true si l’inscription est requise. Si ce n’est pas le cas, définissez registration = false.
      2. Spécifiez le fichier atlas correspondant au fichier du répertoire atlas.
      3. Définir les paramètres d’enregistrement = valeur par défaut.
         Remarque : Cette option utilise une affine suivie d’une transformation spline B pour estimer la correspondance spatiale. Sinon, définissez un nouvel ensemble de paramètres d’enregistrement via Elastix dans /data/elastix_parameter_files/atlas_registration.
      4. Définir enregistrer les images enregistrées = true.
         REMARQUE: Les fichiers de sortie de l’enregistrement et du rééchantillonnage peuvent être téléchargés et inspectés visuellement dans Matlab ou d’autres outils de visualisation tels que FIJI³¹.
   5. Détection des noyaux, comptage et classification des cellules
      Remarque : les erreurs qui se produisent ici peuvent être dues à ne pas spécifier correctement le fichier d’annotations ou ne pas correspondre à l’âge de l’échantillon avec l’annotation correcte.
      1. Dans NMa_template, définissez à la fois le nombre de noyaux et la classification des cellules = true.
      2. Définir la méthode de comptage = 3dunet.
         REMARQUE: Cette option permet l’utilisation du modèle 3D-Unet¹⁹ entraîné. Sinon, sélectionnez Hessian qui utilise la méthode de détection d’objets blob hessiens.
      3. Définissez min_intensity pour définir un seuil d’intensité minimal pour les objets détectés.
         NOTA: Un seuil approprié est déterminé empiriquement en fonction du rapport signal/bruit de l’étiquetage nucléaire.
      4. Réglez classify_method sur l’un ou l’autre seuil, qui est basé sur une intensité de fluorescence non supervisée aux positions centroïdes ou svm, qui modélise un classificateur SVM (Support Vector Machine) linéaire supervisé.
         REMARQUE: Cette étape classera toutes les cellules détectées en quatre classes principales avec imagerie à 3 canaux. Avec ce protocole, Ctip2+/Brn2-, Ctip2-/Brn2⁺, Ctip2-/Brn2^- et les valeurs aberrantes sont générées.
   6. Étapes de l’analyse
      1. Spécifiez le nom de l’exemple. Set config =NM_config(analyse, échantillon).
      2. Exécutez l’une des étapes d’analyse en spécifiant NM_analyze(config,stage) et spécifiez l’étape à l’aide de resample, register, count ou classify. Vérifiez le répertoire de sortie des fichiers de sortie pour chacune des étapes (Figure 5).
   7. Classification des types de cellules et analyse des groupes
      1. Dans NMe_template, définissez update = true et remplacez toutes les statistiques précédentes calculées.
         REMARQUE: Le NMe_template.m offre la possibilité d’effectuer une analyse de groupe de type cellulaire dans les régions du cerveau du même cerveau analysé.
      2. Définissez compare_structures_by sur l’index pour comparer par toutes les annotations uniques ou sur la table pour comparer les structures en fonction de la table.
      3. Définissez le template_file, qui spécifie tous les index de structure possibles et doit exister dans /annotations.
      4. Définissez structure_table et spécifiez les structures à évaluer.
      5. Spécifiez le comptage et la classification des types de cellules comme décrit dans NMa_template.m.
      6. Définissez compare_groups pour spécifier les groupes à comparer.
      7. Définissez sur true ou false pour effectuer un test t apparié ou un test t à deux échantillons.
   8. Exécutez l’analyse.
      REMARQUE: Pour effectuer cette étape, exécutez ce qui suit dans Matlab en dehors de l’environnement NMe_template.m.
      1. Spécifiez le nom de l’exemple. Set config =NM_config(evaluer,sample).
      2. Exécutez l’étape d’analyse en spécifiant NM_evaluate(config,stage) et spécifiez l’étape. Vérifiez le répertoire de sortie pour les fichiers de sortie pour l’analyse de groupe.

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Résultats

Comme le protocole iDISCO+ introduit un rétrécissement tissulaire important, facilement perceptible à l’œil nu (Figure 2B), nous avons ajouté une étape IRM à ce pipeline avant le nettoyage tissulaire pour quantifier le rétrécissement induit par le nettoyage des tissus. Le flux de travail commence par le retrait du tissu non cérébral de l’image IRM (Figure 2C). Ensuite, une transformation rigide (3 angles de translation et 3 angles de rotation) est...

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Discussion

Les méthodes de nettoyage des tissus sont des techniques utiles pour mesurer l’organisation cellulaire 3D du cerveau. Il existe une foule de méthodes de nettoyage des tissus décrites dans la littérature, chacune avec ses avantages et ses limites 6,7,8,9. Les options d’outils informatiques pour analyser les types de cellules dans les images effacées des tissus sont relativement limitée...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bruker 9.4T/30 cm MRI Scanner	Bruker Biospec		Horizontal Bore Animal MRI System
Dibenzyl ether	Sigma-Aldrich	108014-1KG
Dichloromethane (DCM)	Sigma-Aldrich	270997-1L
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher-Scientific	ICN19605590
Donkey serum	Sigma-Aldrich	S30-100ML
EVO 860 4TB external SSD
Fomblin Y	Speciality Fluids Company	YL-VAC-25-6	perfluoropolyether lubricant
gadolinium contrast agent (ProHance)	Bracco Diagnostics	A9576
gadolinium contrast agent(ProHance)	Bracco Diagnostics	0270-1111-03
GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPU	EVGA	08G-P4-6286-KR
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126-500G
Heparin sodium salt	Sigma-Aldrich	H3393-10KU	Dissolved in H2O to 10 mg/mL
Hydrogen peroxide solution, 30%	Sigma-Aldrich	H1009-100ML
ImSpector Pro	LaVision BioTec		Microscope image acquisition software
ITK Snap			segmentation software
Methanol	Fisher-Scientific	A412SK-4
MVPLAPO 2x/0.5 NA Objective	Olympus
Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA)	Sigma-Aldrich	30525-89-4	Dissolved in 1x PBS to 4%
Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)	Corning	46-013-CM	Diluted to 1x in H2O
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	S2002-100G	Dissolved in H2O to 10%
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750-10G
Tergitol type NP-40	Sigma-Aldrich	NP40S-100ML
TritonX-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ML
Tween-20	Fisher-Scientific	BP337 500
Ultramicroscope II Light Sheet Microscope	LaVision BioTec
Xeon Processor E5-2690 v4	Intel	E5-2690
Zyla sCMOS Camera	Andor		Complementary metal oxide semiconductor camera
Antibody			Working concentration
Alexa Fluor Goat 790 Anti-Rabbit	Thermofisher Scientific	A11369	(1:50)
Alexa Fluor Goat 568 Anti-Rat	Thermofisher Scientific	A11077	(1:200)
Rat anti-Ctip2	Abcam	ab18465	(1:400)
Rabbit anti-Brn2	Cell Signaling Technology	12137	(1:100)
To-Pro 3 (TP3)	Thermofisher Scientific	T3605	(1:400)