Un método simple de filtración de sobremesa para aislar pequeñas vesículas extracelulares de células madre mesenquimales humanas

Resumen

Este protocolo demuestra cómo aislar pequeñas vesículas extracelulares de células madre mesenquimales derivadas del cordón umbilical humano (hUC-MSC-sEV) con un entorno de laboratorio simple. La distribución del tamaño, la concentración de proteínas, los marcadores de sEV y la morfología de los hUC-MSC-sEV aislados se caracterizan por el análisis de seguimiento de nanopartículas, el ensayo de proteínas BCA, el western blot y el microscopio electrónico de transmisión, respectivamente.

Resumen

El proceso basado en la ultracentrifugación se considera el método común para el aislamiento de pequeñas vesículas extracelulares (sEV). Sin embargo, el rendimiento de este método de aislamiento es relativamente menor, y estos métodos son ineficientes para separar los subtipos de sEV. Este estudio demuestra un método simple de filtración de sobremesa para aislar pequeñas vesículas extracelulares MSC derivadas del cordón umbilical humano (hUC-MSC-sEVs), separadas con éxito por ultrafiltración del medio condicionado de hUC-MSCs. La distribución del tamaño, la concentración de proteínas, los marcadores exosomales (CD9, CD81, TSG101) y la morfología de los hUC-MSC-sEV aislados se caracterizaron con análisis de seguimiento de nanopartículas, ensayo de proteína BCA, western blot y microscopio electrónico de transmisión, respectivamente. El tamaño de los hUC-MSC-sEVs aislados fue de 30-200 nm, con una concentración de partículas de 7,75 × 10 10 partículas/ml y una concentración de proteínas de⁸⁰ μg/mL. Se observaron bandas positivas para los marcadores exosomales CD9, CD81 y TSG101. Este estudio mostró que los hUC-MSC-sEV se aislaron con éxito del medio condicionado hUC-MSC, y la caracterización mostró que el producto aislado cumplía con los criterios mencionados por Información mínima para estudios de vesículas extracelulares 2018 (MISEV 2018).

Introducción

Según MISEV 2018, los sEV son partículas de bicapa lipídica no replicantes sin núcleo funcional presente, con un tamaño de 30-200 nm¹. Los sEV derivados de MSC contienen importantes moléculas de señalización que desempeñan un papel importante en la regeneración de tejidos, como microARN, citoquinas o proteínas. Se han convertido cada vez más en un "punto caliente" de investigación en medicina regenerativa y terapia libre de células. Muchos estudios han demostrado que los sEV derivados de MSC son tan efectivos como las MSC en el tratamiento de diferentes afecciones, como la inmunomodulación 2,3,4,5, la mejora de la osteogénesis ⁶, la diabetes mellitus^7,8 o la regeneración vascular ^9,10. A medida que avanzan los ensayos de fase temprana, se han destacado tres cuestiones clave principales en relación con la traducción clínica de las MSC-EV: el rendimiento de las EV, la pureza de las EV (libres de desechos celulares y otros contaminantes biológicos como proteínas y citoquinas) y la integridad de la membrana bicapa de fosfolípidos de las EV después del aislamiento.

Se han desarrollado varios métodos para aislar sEVs, explotando la densidad, forma, tamaño y proteína de superficie de los sEVs¹¹. Los dos métodos más comunes en los aislamientos de sEV son las técnicas basadas en la ultracentrifugación y las basadas en la ultrafiltración.

Los métodos basados en la ultracentrifugación se consideran métodos estándar de oro en el aislamiento de sEV. Dos tipos de técnicas de ultracentrifugación que se emplean generalmente son la ultracentrifugación diferencial y la ultracentrifugación por gradiente de densidad. Sin embargo, los métodos de ultracentrifugación a menudo resultan en un bajo rendimiento y requieren equipos costosos para la ultracentrífuga de alta velocidad (100,000-200,000 × g)¹¹. Además, las técnicas de ultracentrifugación por sí solas son ineficientes para separar los subtipos de EV (sEV y EV grandes), lo que resulta en una capa de sedimento impuro¹¹. Por último, la ultracentrifugación por gradiente de densidad también podría llevar mucho tiempo y requerir medidas de precaución adicionales, como la adición de tampón de sacarosa, para inhibir el daño del gradiente durante los pasos de aceleración y desaceleración¹². Por lo tanto, la ultracentrifugación generalmente conduce a un rendimiento relativamente bajo y no es capaz de discriminar entre diferentes poblaciones de EV¹³, lo que limita su aplicación para la preparación de EV a gran escala¹¹.

El segundo método de aislamiento EV es a través de ultrafiltración, que se basa en la filtración de tamaño. La ultrafiltración es relativamente rentable y rentable en comparación con la ultracentrifugación, ya que no implica equipos costosos ni largos tiempos de procesamiento¹⁴. Por lo tanto, la ultrafiltración parece ser una técnica de aislamiento más efectiva que los dos métodos de ultracentrifugación antes mencionados. Los productos aislados pueden ser más específicos en función del tamaño de los poros y el mayor rendimiento¹⁵. Sin embargo, la fuerza adicional incurrida durante el proceso de filtración puede resultar en la deformación o erupción de los EV¹⁶.

El documento actual propuso un protocolo de sobremesa rentable y rentable para aislar los sEV derivados de MSC para análisis posteriores y fines terapéuticos. El método descrito en este documento combinó un método de filtración simple con centrifugación de sobremesa para aislar EV de alto rendimiento y buena calidad de hUC-MSC para análisis aguas abajo, incluido el análisis de tamaño de partícula, ensayo de biomarcadores e imágenes microscópicas electrónicas.

Protocolo

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los materiales, equipos y software utilizados en este protocolo.

1. Células madre mesenquimales del cordón umbilical humano y cultivo

1. Cultivar las hUC-MSCs a una densidad de siembra de 5 × 10³/^cm2 en DMEM, suplementado con 8% de lisado de plaquetas humanas y 1% de pen-estreptococo. Incubar las células a 37 °C en_CO2 al 5%. Reemplace el medio de cultivo celular cada 3 días para asegurar un crecimiento celular adecuado.
2. Expandir las celdas al paso 5 en matraces T175 para el aislamiento de sEV.
   NOTA: Se necesitan muchos matraces para cosechar un alto rendimiento de sEV (el rendimiento aumenta con el número de células).

2. Aislamiento de vesículas extracelulares pequeñas de hUC - MSCs

1. Reemplace el medio de cultivo con DMEM fresco libre de rojo fenol suplementado con Pen-Strep [medio acondicionado (CM)] al 1% cuando el cultivo alcance una confluencia del 70% -80% en el paso 5.
   PRECAUCIÓN: Utilice sólo medios basales; evitar FBS y suplemento de lisado de plaquetas humanas para evitar la contaminación por sEV externos.
2. Después de 24 h, centrifugar el CM a 200 × g durante 5 min a 4 °C para eliminar los restos celulares. Recoja y filtre el sobrenadante a través de un filtro de 0,22 μm para eliminar partículas mayores de 220 nm.
3. Llene la unidad de filtro centrífugo con 30 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) filtrada a través de un filtro de 0,2 μm. Centrifugar la unidad de filtro centrífugo a 3.500 × g durante 5 min a 4 °C.
4. Llene el CM filtrado en la unidad de filtro centrífugo (el volumen máximo de cada unidad es de 70 ml). Centrifugar el CM a 3.500 × g a 4 °C.
   NOTA: La duración de la centrifugación debe controlarse de vez en cuando hasta que la solución haya alcanzado la superficie del filtro.
5. Deseche la solución en el vaso de solución de filtrado. Centrifugar inversamente el recipiente filtrante de muestra con un vaso de recogida de concentrado a 1.000 x g a 4 °C durante 2 min.
6. Transfiera el CM concentrado de nuevo a la unidad de filtro centrífugo. Añadir 30 ml de PBS filtrado en la unidad de filtro centrífugo y centrifugar la unidad a 3.500 × g a 4 °C.
7. Deseche la solución en el vaso de solución de filtrado. Instale una taza de recolección de concentrado en la unidad de filtro y una centrífuga inversa a 1.000 × g durante 2 min a 4 °C para obtener los sEV purificados.
8. Filtrar los sEV a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm.
9. Transfiera las muestras a nuevos tubos y almacénelas a -80 °C para su posterior análisis.

3. Caracterización de hUC-MSC-sEVs

1. Análisis de seguimiento de nanopartículas
   1. Diluir los hUC-MSC-sEV aislados en PBS filtrado a 20-100 partículas/fotograma.
   2. Introducir 1 ml de la muestra diluida en la cámara NTA utilizando jeringas desechables de 1 ml.
   3. Establezca los ajustes de medición en consecuencia: ajuste el nivel de la cámara al nivel 14, determine el umbral de detección para incluir tantas partículas como sea posible con la restricción de que se cuenten 10-100 cruces rojas y el recuento de cruces azules se limite a cinco.
   4. Para cada medición, grabe cinco videos de 1 minuto y analícelos utilizando el software NanoSight con un umbral de detección de cinco.
   5. Tome medidas por triplicado para cada muestra.
2. Análisis Western blotting
   1. Lise los hUC-MSC-sEV con tampón de lisis del ensayo de radioinmunoprecipitación helada (RIPA), incubar durante 30 min a 4 °C y centrifugar a 200 × g durante 5 min a 4 °C. Recoge el sobrenadante.
   2. Cuantifique la proteína utilizando un kit de ensayo de proteínas de ácido bicinchonínico (BCA). Ensamble el conjunto de electroforesis en gel en consecuencia y realice la electroforesis en gel a 90 V hasta que la proteína llegue al final del gel de apilamiento. Cambie el voltaje a 200 V para separar las proteínas hasta el final del gel de resolución.
   3. Realizar transferencia semiseca para transferir las proteínas del gel a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) a 15 V durante 1 h.
   4. Bloquear la membrana de PVDF con albúmina sérica bovina (BSA)/solución salina tamponada con Tris-0,1% v/v Tween 20 (TBS-T) al 3% durante 1 h en un agitador a temperatura ambiente. Incubar la membrana de PVDF con anticuerpos primarios de la siguiente manera: anticuerpo monoclonal anti-CD 9 de ratón (1:500), anticuerpo monoclonal anti-CD 81 de ratón (1:500), anticuerpo monoclonal anti-TSG 101 de ratón anti-GRP 94 de ratón (1:500) a 4 °C durante la noche con agitación constante.
   5. Al día siguiente, lavar la membrana de PVDF 5 x 5 min con TBS-T e incubar con un anticuerpo secundario: proteína de unión a IgG kappa de ratón conjugada con peroxidasa de rábano picante (m-IgGκ BP-HRP) (1:5.000) durante 1 h con agitación a temperatura ambiente.
   6. Una vez más, lave la membrana de PVDF con TBS-T cinco veces y visualice la membrana en un generador de imágenes de carga acoplada (CCD) utilizando un reactivo de detección de quimioluminiscencia. Analizar el nivel de expresión de las proteínas utilizando el software ImageJ. Primero, abra el archivo de imagen en ImageJ (Archivo | Abierto...). Mejorar la calidad de la imagen ajustando el brillo y el contraste (Imagen | Ajustar | Brillo/Contraste). Ajuste la imagen hasta que las manchas sean claramente visibles, haga clic en el botón Aplicar y luego guarde las imágenes en formato TIFF (Archivo | Guardar como | TIFF...).
3. Microscopio electrónico de transmisión
   1. Diluir una parte de la muestra hUC-MSC-sEVs con cuatro partes de PBS filtrado hasta un volumen total de 10 μL e incubar en una rejilla de cobre recubierta de carbono durante 15 min.
   2. Retire el exceso de muestra con una toallita de laboratorio y deje que se seque al aire durante 3 minutos.
   3. Incubar 10 μL de solución de ácido fosfotúngstico (PTA) al 1% para teñir la muestra durante 3 min.
   4. Retire el exceso de solución de PTA al 1% con una toallita de laboratorio y deje que se seque al aire durante 3 minutos.
   5. Utilice la muestra para obtener imágenes de microscopio electrónico de transmisión.
      NOTA: Consulte la Figura 1 para ver los pasos resumidos del experimento esquemático.

Resultados

La Figura 2 muestra que los hUC-MSC-sEV tienen un modo de tamaño de partícula a 53 nm, mientras que otros picos significativos de tamaño de partícula fueron 96 y 115 nm. La concentración de hUC-MSC-sEVs medida por NTA fue de 7,75 × 10¹⁰ partículas/mL. La concentración proteica de hUC-MSC-sEVs medida con el ensayo BCA fue de aproximadamente 80 μg/ml.

En el análisis western blotting, los hUC-MSC-sEV demostraron bandas positivas para los marcador...

Discusión

Los EV son uno de los subconjuntos importantes del secretoma en las MSC que desempeñan un papel crucial durante los procesos normales y patológicos. Sin embargo, los sEV, con un rango de tamaño entre 30 y 200 nm, han aumentado como una herramienta potencial para la terapia libre de células en la última década. Se desarrollaron varias técnicas para aislar los sEV de las MSC. Sin embargo, la ultracentrifugación diferencial, la ultrafiltración, la precipitación basada en polímeros, la captura de inmunoafinidad y ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
40% acrylamide	Nacalai Tesque	06121-95	Western blot
95% ethanol	Nacalai Tesque	14710-25	Disinfectants
Absolute Methanol	Chemiz	45081	To activate PVDF membrane (Western blot)
Accutase	STEMCELL Technologies	7920	Cell dissociation enzyme
ammonium persulfate	Chemiz	14475	catalyse the gel polymerisation (Gel electrophoresis
anti-CD 81 (B-11)	Santa Cruz Biotechnology	sc-166029	Antibody for sEVs marker
anti-TSG 101 (C-2)	Santa Cruz Biotechnology	sc-7964	Antibody for sEVs marker
Bovine serum albumin	Nacalai Tesque	00653-31	PVDF membrane blocking
bromophenol blue	Nacalai Tesque	05808-61	electrophoretic color marker
Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL)	Millipore	UFC710008	sEVs isolation
ChemiLumi One L	Nacalai Tesque	7880	chemiluminescence detection reagent
CryoStor Freezing Media	Sigma-Aldrich	C3124-100ML	Cell cryopreserve
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Nacalai Tesque	08458-45	Cell culture media
ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein Marker	SMOBIO	PM2610	Protein molecular weight markers
Extra thick blotting paper	ATTO		buffer reservior (Western blot)
Glycerol	Merck	G5516	Chemicals for western blot
Glycine	1st Base	BIO-2085-500g	Chemicals for buffer (Western Blot)
horseradish peroxidase-conjugated mouse IgG kappa binding protein (m-IgGκBP-HRP)	Santa Cruz Biotechnology	sc-516102	Secondary antibody (Western Blot)
Human Wharton’s Jelly derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs)	Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Faculty of Medicine, The National University Malaysia
mouse antibodies anti-CD 9 (C-4)	Santa Cruz Biotechnology	sc-13118	Antibody for sEVs marker
Nanosight NS300 equipped with a CMOS camera, a 20 × objective lens, a blue laser module (488 nm), and NTA software v3.2	Malvern Panalytical, UK
paraformaldehyde	Nacalai Tesque	02890-45	Sample Fixation during TEM
penicillin–streptomycin	Nacalai Tesque	26253-84	Antibiotic for media
phenylmethylsulfonyl fluoride	Nacalai Tesque	27327-81	Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer
phosphate-buffered saline	Gibco	10010023	Washing, sample dilution
polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane with 0.45 mm pore size	ATTO		To hold protein during protein transfer (Western blot)
protease inhibitor cocktail	Nacalai Tesque	25955-11	Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer
Protein Assay Bicinchoninate Kit	Nacalai Tesque	06385-00	Protein measurement
sample buffer solution with 2-ME	Nacalai Tesque	30566-22	Reducing agent for western blot
sodium chloride	Nacalai Tesque	15266-64	Chemicals for western blot
sodium dodecyl sulfate	Nacalai Tesque	31606-62	ionic surfactant during gel electrophoresis
Tecnai G2 F20 S-TWIN transmission electron microscope	FEI, USA
tetramethylethylenediamine	Nacalai Tesque	33401-72	chemicals to prepare gel
tris-base	1st Base	BIO-1400-500g	Chemicals for buffer (Western Blot)
Tween 20	GeneTex	GTX30962	Chemicals for western blot
UVP (Ultra Vision Product) CCD imager			CCD imager for western blot signal detection