שיטת סינון פשוטה לבידוד בועיות חוץ-תאיות קטנות מתאי גזע מזנכימליים אנושיים

Summary

פרוטוקול זה מדגים כיצד לבודד שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות של תאי גזע מזנכימליים שמקורם בחבל הטבור האנושי (hUC-MSC-sEVs) באמצעות הגדרה פשוטה בקנה מידה של מעבדה. התפלגות הגודל, ריכוז החלבונים, סמני sEVs והמורפולוגיה של hUC-MSC-sEV מבודדים מאופיינים בניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים, בדיקת חלבון BCA, כתם מערבי ומיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת, בהתאמה.

Abstract

התהליך מבוסס האולטרה-צנטריפוגה נחשב לשיטה הנפוצה לבידוד שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות (sEVs). עם זאת, התשואה משיטת בידוד זו נמוכה יחסית, ושיטות אלה אינן יעילות בהפרדת תת-סוגים של sEV. מחקר זה מדגים שיטת סינון פשוטה לבידוד שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות מסוג MSC (hUC-MSC-sEVs) שמקורן בחבל הטבור האנושי, המופרדות בהצלחה על-ידי אולטרה-סינון מהמדיום המותנה של hUC-MSCs. התפלגות הגודל, ריכוז החלבונים, הסמנים האקזוזומליים (CD9, CD81, TSG101) והמורפולוגיה של hUC-MSC-sEV המבודדים אופיינו בניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים, בדיקת חלבון BCA, כתם מערבי ומיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת, בהתאמה. גודלם של ה-hUC-MSC-sEV המבודדים היה 30-200 ננומטר, עם ריכוז חלקיקים של 7.75 ×-10 10 חלקיקים/מ"ל וריכוז חלבון של⁸⁰ מק"ג/מ"ל. נצפו פסים חיוביים לסמנים אקסוזומליים CD9, CD81 ו-TSG101. מחקר זה הראה כי hUC-MSC-sEV בודדו בהצלחה מתווך מותנה hUC-MSCs, ואפיון הראה כי המוצר המבודד עמד בקריטריונים שהוזכרו על ידי מידע מינימלי למחקרים של שלפוחיות חוץ-תאיות 2018 (MISEV 2018).

Introduction

על פי MISEV 2018, sEVs הם חלקיקים דו-שכבתיים ליפידים שאינם משכפלים ללא גרעין פונקציונלי, בגודל של 30-200 ננומטר¹. sEV שמקורם ב-MSC מכיל מולקולות איתות חשובות הממלאות תפקידים חשובים בהתחדשות רקמות, כגון מיקרו-רנ"א, ציטוקינים או חלבונים. הם הפכו יותר ויותר ל"נקודה חמה" מחקרית ברפואה רגנרטיבית ובטיפול ללא תאים. מחקרים רבים הראו כי sEV שמקורו ב-MSC יעיל כמו MSC בטיפול במצבים שונים, כגון אימונומודולציה 2,3,4,5, שיפור אוסטאוגנזה ⁶, סוכרת^7,8 או התחדשות כלי דם ^9,10. עם התקדמות ניסויי השלב המוקדם, הודגשו שלוש סוגיות מפתח עיקריות ביחס לתרגום הקליני של MSCs-EVs: תפוקת כלי הרכב החשמליים, טוהר כלי הרכב החשמליים (נקיים מפסולת תאים ומזהמים ביולוגיים אחרים כגון חלבון וציטוקינים), ושלמות הממברנה הדו-שכבתית הפוספוליפידית של כלי הרכב החשמליים לאחר בידוד.

שיטות שונות פותחו כדי לבודד sEVs, תוך ניצול הצפיפות, הצורה, הגודל וחלבון פני השטח של sEVs¹¹. שתי השיטות הנפוצות ביותר בבידודים של כלי רכב חשמליים הן טכניקות מבוססות אולטרה-צנטריפוגה ואולטרה-סינון.

שיטות מבוססות אולטרה-צנטריפוגה נחשבות לשיטות תקן זהב בבידוד כלי רכב חשמליים. שני סוגים של טכניקות אולטרה-צנטריפוגות המשמשות בדרך כלל הן אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית ואולטרה-צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות. עם זאת, שיטות אולטרה-צנטריפוגות גורמות לעתים קרובות לתפוקה נמוכה ודורשות ציוד יקר עבור אולטרה-צנטריפוגות במהירות גבוהה (100,000-200,000 × גרם)¹¹. יתר על כן, טכניקות אולטרה-צנטריפוגה לבדן אינן יעילות בהפרדת תת-סוגים של כלי רכב חשמליים (sEV ורכבים חשמליים גדולים), וכתוצאה מכך נוצרת שכבת משקעים לא טהורה¹¹. לבסוף, אולטרה-צנטריפוגה של שיפוע צפיפות עשויה גם היא לגזול זמן רב ולדרוש צעדי זהירות נוספים כגון תוספת חיץ סוכרוז כדי לעכב את נזקי השיפוע במהלך שלבי האצה והאטה¹². לפיכך, אולטרה-צנטריפוגה מובילה בדרך כלל לתנובה נמוכה יחסית ואינה מסוגלת להפלות בין אוכלוסיות שונות של כלי רכב חשמליים¹³, מה שמגביל את יישומה להכנת רכב חשמלי בקנה מידה גדול¹¹.

השיטה השנייה לבידוד רכב חשמלי היא באמצעות אולטרה-פילטרציה, המבוססת על סינון גודל. אולטרה-סינון הוא חסכוני יחסית בזמן ובהשוואה לאולטרה-צנטריפוגה, מכיוון שהוא אינו כרוך בציוד יקר או בזמני עיבוד ארוכים¹⁴. לפיכך, אולטרה-סינון נראה כטכניקת בידוד יעילה יותר משתי שיטות האולטרה-צנטריפוגה שהוזכרו לעיל. המוצרים המבודדים יכולים להיות ספציפיים יותר בהתבסס על גודל הנקבוביות ותפוקה גבוהה יותר¹⁵. עם זאת, הכוח הנוסף המופעל בתהליך הסינון עלול לגרום לעיוות או התפרצות של כלי הרכב החשמליים¹⁶.

המאמר הנוכחי הציע פרוטוקול benchtop חסכוני וזמן לבידוד sEV הנגזרים מ- MSC לצורך ניתוח במורד הזרם ולמטרות טיפוליות. השיטה המתוארת במאמר זה שילבה שיטת סינון פשוטה עם צנטריפוגה עליונה כדי לבודד כלי רכב חשמליים בעלי תפוקה גבוהה ובאיכות טובה מ- hUC-MSCs לצורך ניתוח במורד הזרם, כולל ניתוח גודל חלקיקים, בדיקת סמנים ביולוגיים והדמיה מיקרוסקופית אלקטרונים.

Protocol

הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים אודות כל החומרים, הציוד והתוכנות המשמשים בפרוטוקול זה.

1. תאי גזע מזנכימליים של חבל הטבור האנושי ותרבית

1. תרבית את hUC-MSCs בצפיפות זריעה של 5 × 10³/cm² ב- DMEM, בתוספת 8% טסיות דם אנושיות ו- 1% Pen-Strep. לדגור על התאים ב 37 ° C ב 5% CO₂. החלף את מדיום תרבית התאים כל 3 ימים כדי להבטיח צמיחה תקינה של תאים.
2. הרחיבו את התאים למעבר 5 בצלוחיות T175 לבידוד sEV.
   הערה: יש צורך בצלוחיות רבות כדי לקצור יבול גבוה של sEV (היבול עולה עם מספר התאים).

2. בידוד שלפוחית חוץ-תאית קטנה מ-hUC - MSCs

1. החלף את מדיום התרבית ב- DMEM טרי ללא פנול אדום בתוספת 1% Pen-Strep [מדיום מותנה (CM)] כאשר התרבית מגיעה למפגש של 70%-80% במעבר 5.
   אזהרה: יש להשתמש במדיה בסיסית בלבד; הימנע FBS ותוסף טסיות דם אנושיות כדי למנוע זיהום על ידי sEV חיצוניים.
2. לאחר 24 שעות, צנטריפוגה CM ב 200 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C כדי להסיר פסולת התא. אספו וסננו את הסופרנאטנט דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר כדי להסיר חלקיקים הגדולים מ-220 ננומטר.
3. מלא את יחידת המסנן הצנטריפוגלי ב- 30 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS) המסונן דרך מסנן 0.2 מיקרומטר. צנטריפוגה את יחידת המסנן הצנטריפוגלי ב 3,500 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
4. מלאו את ה-CM המסונן ביחידת הסינון הצנטריפוגלית (הנפח המרבי של כל יחידה הוא 70 מ"ל). צנטריפוגה CM ב 3,500 × גרם ב 4 ° C.
   הערה: יש לעקוב אחר משך הצנטריפוגה מעת לעת עד שהפתרון מגיע לפני השטח של המסנן.
5. יש להשליך את התמיסה לכוס תמיסת התסנין. צנטריפוגה הפוכה את מסנן הדגימה עם איסוף תרכיז ב 1,000 x גרם ב 4 ° C למשך 2 דקות.
6. מעבירים את ה-CM המרוכז בחזרה ליחידת המסנן הצנטריפוגלי. הוסף 30 מ"ל של PBS מסונן ליחידת המסנן הצנטריפוגלי וצנטריפוגה את היחידה ב 3,500 × גרם ב 4 ° C.
7. יש להשליך את התמיסה לכוס תמיסת התסנין. התקינו איסוף מרוכזת על יחידת המסנן וצנטריפוגה הפוכה ב-1,000 × גרם למשך 2 דקות ב-4°C כדי לקבל את ה-sEV המטוהרים.
8. סנן את כלי הרכב החשמליים דרך מסנן מזרקים בגודל 0.22 מיקרומטר.
9. העבר את הדגימות לצינורות חדשים ואחסן אותן ב -80 ° C לניתוח נוסף.

3. אפיון hUC-MSC-sEVs

1. ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים
   1. דללו את hUC-MSC-sEV המבודדים ב-PBS מסונן ל-20-100 חלקיקים/מסגרת.
   2. הכניסו 1 מ"ל של הדגימה המדוללת לתא נת"ע באמצעות מזרקים חד פעמיים של 1 מ"ל.
   3. קבעו את הגדרות המדידה בהתאם: התאימו את רמת המצלמה לרמה 14, קבעו את סף הגילוי כך שיכלול כמה שיותר חלקיקים עם הגבלה שסופרים 10-100 צלבים אדומים , וספירת הצלב הכחול מוגבלת לחמישה.
   4. עבור כל מדידה, הקליטו חמישה סרטונים בני דקה ונתחו אותם באמצעות תוכנת NanoSight עם סף זיהוי של חמישה.
   5. בצע מדידות בשלשה עבור כל דגימה.
2. ניתוח כתמים מערביים
   1. Lyse, hUC-MSC-sEVs עם בדיקת משקעים רדיואימונוגרפיים קרים כקרח (RIPA) lysis buffer, לדגור במשך 30 דקות ב 4 °C, ו צנטריפוגה ב 200 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. לאסוף את supernatant.
   2. כמת את החלבון באמצעות ערכת בדיקת חלבון של חומצה ביצינכונינית (BCA). הרכיבו את אלקטרופורזה הג'ל בהתאם ובצעו אלקטרופורזה בג'ל במתח של 90 וולט עד שהחלבון מגיע לקצה ג'ל הערימה. שנה את המתח ל 200 V כדי להפריד את החלבונים עד סוף ג'ל הפתרון.
   3. בצע העברה חצי יבשה כדי להעביר את החלבונים מהג'ל לקרום פוליווינילידן דיפלואוריד (PVDF) ב 15 V למשך 1 שעות.
   4. חסום את קרום PVDF עם 3% אלבומין בסרום בקר (BSA)/Tris-buffered מלוחים-0.1% v/v Tween 20 (TBS-T) למשך שעה אחת על שייקר בטמפרטורת החדר. יש לדגור על קרום PVDF עם נוגדנים ראשוניים באופן הבא: נוגדן חד-שבטי נגד CD 9 של עכבר (1:500), נוגדן חד-שבטי נגד CD 81 של עכבר (1:500), נוגדן חד-שבטי של עכבר נגד GRP 94 נגד TSG 101 נוגדן חד-שבטי (1:500) ב-4°C למשך הלילה עם טלטול מתמיד.
   5. למחרת, שטפו את קרום PVDF 5 x 5 דקות עם TBS-T והמשיכו לדגור עם נוגדן משני: עכבר מצומד חזרת חלבון קושר מסוג IgG kappa (m-IgGκ BP-HRP) (1:5,000) למשך שעה אחת עם תסיסה בטמפרטורת החדר.
   6. שוב, שטפו את קרום PVDF עם TBS-T חמש פעמים, ודמיינו את הממברנה במצלמת CCD (charge-coupled imager) באמצעות מגיב זיהוי כימילומינסנציה. נתח את רמת הביטוי של החלבונים באמצעות תוכנת ImageJ. ראשית, פתח את קובץ התמונה ב- ImageJ (קובץ | פתוח...). שפר את איכות התמונה על-ידי התאמת הבהירות והניגודיות (תמונה | התאמה | בהירות/ניגודיות). התאם את התמונה עד שהכתמים נראים בבירור, לחץ על כפתור החל ולאחר מכן שמור את התמונות בפורמט TIFF (קובץ | שמירה בשם | טיף...).
3. מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת
   1. דללו חלק אחד של דגימת hUC-MSC-sEV בארבעה חלקים של PBS מסונן לנפח כולל של 10 μL ודגרו על רשת נחושת מצופה פחמן למשך 15 דקות.
   2. יש להסיר את עודפי הדגימה באמצעות מגבון מעבדה ולאפשר לה להתייבש באוויר למשך 3 דקות.
   3. יש לדגור על 10 μL של תמיסת 1% חומצה פוספוטונגסטית (PTA) כדי להכתים את הדגימה למשך 3 דקות.
   4. יש להסיר את עודפי תמיסת ה-PTA 1% באמצעות מגבון מעבדה ולאפשר לה להתייבש באוויר למשך 3 דקות.
   5. השתמש בדגימה להדמיית מיקרוסקופ אלקטרונים שידור.
      הערה: עיין באיור 1 לקבלת שלבי הניסוי הסכמטיים המסוכמים.

תוצאות

איור 2 מראה של-hUC-MSC-sEV יש מצב גודל חלקיקים של 53 ננומטר, בעוד ששיאים משמעותיים אחרים של גודל חלקיקים היו 96 ו-115 ננומטר. ריכוז hUC-MSC-sEV שנמדד על ידי נת"ע היה 7.75 ×^{10 10} חלקיקים למ"ל. ריכוז החלבונים של hUC-MSC-sEV שנמדד בבדיקת BCA היה כ-80 מיקרוגרם/מ"ל.

בניתוח כתמים מערביים, hU...

Discussion

כלי רכב חשמליים הם אחת מתת-הקבוצות החשובות של ההפרשה ב-MSCs הממלאים תפקיד מכריע במהלך תהליכים נורמליים ופתולוגיים. עם זאת, sEVs, עם טווח גודל בין 30 ל -200 ננומטר, עלו ככלי פוטנציאלי לטיפול ללא תאים בעשור האחרון. טכניקות שונות פותחו כדי לבודד sEV מ MSCs. עם זאת, אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית, אולטרה-סינ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
40% acrylamide	Nacalai Tesque	06121-95	Western blot
95% ethanol	Nacalai Tesque	14710-25	Disinfectants
Absolute Methanol	Chemiz	45081	To activate PVDF membrane (Western blot)
Accutase	STEMCELL Technologies	7920	Cell dissociation enzyme
ammonium persulfate	Chemiz	14475	catalyse the gel polymerisation (Gel electrophoresis
anti-CD 81 (B-11)	Santa Cruz Biotechnology	sc-166029	Antibody for sEVs marker
anti-TSG 101 (C-2)	Santa Cruz Biotechnology	sc-7964	Antibody for sEVs marker
Bovine serum albumin	Nacalai Tesque	00653-31	PVDF membrane blocking
bromophenol blue	Nacalai Tesque	05808-61	electrophoretic color marker
Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL)	Millipore	UFC710008	sEVs isolation
ChemiLumi One L	Nacalai Tesque	7880	chemiluminescence detection reagent
CryoStor Freezing Media	Sigma-Aldrich	C3124-100ML	Cell cryopreserve
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Nacalai Tesque	08458-45	Cell culture media
ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein Marker	SMOBIO	PM2610	Protein molecular weight markers
Extra thick blotting paper	ATTO		buffer reservior (Western blot)
Glycerol	Merck	G5516	Chemicals for western blot
Glycine	1st Base	BIO-2085-500g	Chemicals for buffer (Western Blot)
horseradish peroxidase-conjugated mouse IgG kappa binding protein (m-IgGκBP-HRP)	Santa Cruz Biotechnology	sc-516102	Secondary antibody (Western Blot)
Human Wharton’s Jelly derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs)	Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Faculty of Medicine, The National University Malaysia
mouse antibodies anti-CD 9 (C-4)	Santa Cruz Biotechnology	sc-13118	Antibody for sEVs marker
Nanosight NS300 equipped with a CMOS camera, a 20 × objective lens, a blue laser module (488 nm), and NTA software v3.2	Malvern Panalytical, UK
paraformaldehyde	Nacalai Tesque	02890-45	Sample Fixation during TEM
penicillin–streptomycin	Nacalai Tesque	26253-84	Antibiotic for media
phenylmethylsulfonyl fluoride	Nacalai Tesque	27327-81	Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer
phosphate-buffered saline	Gibco	10010023	Washing, sample dilution
polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane with 0.45 mm pore size	ATTO		To hold protein during protein transfer (Western blot)
protease inhibitor cocktail	Nacalai Tesque	25955-11	Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer
Protein Assay Bicinchoninate Kit	Nacalai Tesque	06385-00	Protein measurement
sample buffer solution with 2-ME	Nacalai Tesque	30566-22	Reducing agent for western blot
sodium chloride	Nacalai Tesque	15266-64	Chemicals for western blot
sodium dodecyl sulfate	Nacalai Tesque	31606-62	ionic surfactant during gel electrophoresis
Tecnai G2 F20 S-TWIN transmission electron microscope	FEI, USA
tetramethylethylenediamine	Nacalai Tesque	33401-72	chemicals to prepare gel
tris-base	1st Base	BIO-1400-500g	Chemicals for buffer (Western Blot)
Tween 20	GeneTex	GTX30962	Chemicals for western blot
UVP (Ultra Vision Product) CCD imager			CCD imager for western blot signal detection