Eine einfache Tischfiltrationsmethode zur Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel aus humanen mesenchymalen Stammzellen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll demonstriert, wie die kleinen extrazellulären Vesikel (hUC-MSC-sEVs) von humanen Nabelschnurstammzellen (hUC-MSC-sEVs) mit einer einfachen Laborumgebung isoliert werden können. Die Größenverteilung, Proteinkonzentration, sEVs-Marker und Morphologie isolierter hUC-MSC-sEVs werden durch Nanopartikel-Tracking-Analyse, BCA-Protein-Assay, Western Blot bzw. Transmissionselektronenmikroskop charakterisiert.

Zusammenfassung

Das auf Ultrazentrifugation basierende Verfahren gilt als die gängigste Methode zur Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel (sEVs). Die Ausbeute dieser Isolationsmethode ist jedoch relativ gering, und diese Methoden sind ineffizient bei der Trennung von sEV-Subtypen. Diese Studie demonstriert eine einfache Benchtop-Filtrationsmethode zur Isolierung von aus humanen Nabelschnur gewonnenen kleinen extrazellulären MSC-Vesikeln (hUC-MSC-sEVs), die erfolgreich durch Ultrafiltration aus dem konditionierten Medium von hUC-MSCs getrennt wurden. Die Größenverteilung, die Proteinkonzentration, die exosomalen Marker (CD9, CD81, TSG101) und die Morphologie der isolierten hUC-MSC-sEVs wurden mittels Nanopartikel-Tracking-Analyse, BCA-Protein-Assay, Western Blot bzw. Transmissionselektronenmikroskop charakterisiert. Die Größe der isolierten hUC-MSC-sEVs betrug 30-200 nm, mit einer Partikelkonzentration von 7,75 × 10 10 Partikeln/ml und einer Proteinkonzentration von⁸⁰ μg/ml. Es wurden positive Banden für die exosomalen Marker CD9, CD81 und TSG101 beobachtet. Diese Studie zeigte, dass hUC-MSC-sEVs erfolgreich aus hUC-MSCs konditioniertem Medium isoliert wurden, und die Charakterisierung zeigte, dass das isolierte Produkt die in Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV 2018) genannten Kriterien erfüllte.

Einleitung

Laut MISEV 2018 handelt es sich bei sEVs um nicht-replizierende Lipiddoppelschichtpartikel ohne funktionellen Zellkern mit einer Größe von 30-200^nm1. MSC-abgeleitete sEVs enthalten wichtige Signalmoleküle, die eine wichtige Rolle bei der Geweberegeneration spielen, wie z. B. microRNA, Zytokine oder Proteine. Sie haben sich zunehmend zu einem Forschungs-"Hotspot" in der regenerativen Medizin und der zellfreien Therapie entwickelt. Viele Studien haben gezeigt, dass MSC-abgeleitete sEVs bei der Behandlung verschiedener Erkrankungen genauso wirksam sind wie MSCs, wie z. B. Immunmodulation 2,3,4,5, Verbesserung der Osteogenese ⁶, Diabetes mellitus^7,8 oder vaskuläre Regeneration ^9,10. Im Laufe der frühen Phase der Studien wurden drei Hauptprobleme in Bezug auf die klinische Translation von MSCs-EVs hervorgehoben: die Ausbeute der EVs, die Reinheit der EVs (frei von Zelltrümmern und anderen biologischen Verunreinigungen wie Proteinen und Zytokinen) und die Integrität der Phospholipid-Doppelschichtmembran der EVs nach der Isolierung.

Es wurden verschiedene Methoden entwickelt, um sEVs zu isolieren, wobei die Dichte, Form, Größe und das Oberflächenprotein der sEVs ausgenutzt werden¹¹. Die beiden gebräuchlichsten Methoden bei der Isolierung von sEVs sind ultrazentrifugationsbasierte und ultrafiltrationsbasierte Techniken.

Ultrazentrifugationsbasierte Methoden gelten als Goldstandardmethoden bei der Isolierung von sEVs. Zwei Arten von Ultrazentrifugationstechniken, die normalerweise verwendet werden, sind die differentielle Ultrazentrifugation und die Dichtegradienten-Ultrazentrifugation. Ultrazentrifugationsmethoden führen jedoch oft zu einer geringen Ausbeute und erfordern teure Geräte für Hochgeschwindigkeits-Ultrazentrifugen (100.000-200.000 × g)¹¹. Darüber hinaus sind Ultrazentrifugationstechniken allein ineffizient bei der Trennung von EV-Subtypen (sEVs und große EVs), was zu einer unreinen Sedimentschicht^{führt 11}. Schließlich könnte die Dichtegradienten-Ultrazentrifugation auch zeitaufwändig sein und zusätzliche Vorsichtsmaßnahmen erfordern, wie z. B. die Zugabe von Saccharosepuffer, um die Gradientenschädigung während der Beschleunigungs- und Verzögerungsschritte¹² zu verhindern. Daher führt die Ultrazentrifugation in der Regel zu einer relativ geringen Ausbeute und ist nicht in der Lage, zwischen verschiedenen Populationen von EVs¹³ zu unterscheiden, was ihre Anwendung für die großtechnische EV-Präparation¹¹ einschränkt.

Die zweite Methode der EV-Isolierung ist die Ultrafiltration, die auf der Größenfiltration basiert. Die Ultrafiltration ist im Vergleich zur Ultrazentrifugation relativ zeit- und kosteneffizient, da sie keine teuren Geräte oder langen Verarbeitungszeiten erfordert¹⁴. Daher scheint die Ultrafiltration eine effektivere Isolationstechnik zu sein als die beiden oben genannten Ultrazentrifugationsmethoden. Die isolierten Produkte können je nach Porengröße und höherer Ausbeute spezifischer sein¹⁵. Die zusätzliche Kraft, die während des Filtrationsprozesses entsteht, kann jedoch zur Verformung oder zum Ausbruch der EVs¹⁶ führen.

In der vorliegenden Arbeit wird ein kosten- und zeiteffizientes Benchtop-Protokoll zur Isolierung von MSC-abgeleiteten sEVs für nachgelagerte Analysen und therapeutische Zwecke vorgeschlagen. Die in diesem Artikel beschriebene Methode kombinierte eine einfache Filtrationsmethode mit einer Tischzentrifugation, um ertragreiche und qualitativ hochwertige EVs aus hUC-MSCs für die nachgelagerte Analyse zu isolieren, einschließlich Partikelgrößenanalyse, Biomarker-Assay und elektronenmikroskopischer Bildgebung.

Protokoll

HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Geräten und Software, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Mesenchymale Stammzellen und Kultur der menschlichen Nabelschnur

1. Kultivieren Sie die hUC-MSCs bei einer Aussaatdichte von 5 × 10³/^cm2 in DMEM, ergänzt mit 8 % humanem Thrombozytenlysat und 1 % Pen-Streptokokken. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in 5% CO₂. Tauschen Sie das Zellkulturmedium alle 3 Tage aus, um ein ordnungsgemäßes Zellwachstum zu gewährleisten.
2. Erweitern Sie die Zellen auf Passage 5 in T175-Kolben zur sEV-Isolierung.
   HINWEIS: Es werden viele Kolben benötigt, um eine hohe Ausbeute an sEVs zu erzielen (die Ausbeute steigt mit der Anzahl der Zellen).

2. Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel aus hUC - MSCs

1. Ersetzen Sie das Nährmedium durch frisches, phenolrotfreies DMEM, das mit 1 % Pen-Streptokokken [konditioniertes Medium (CM)] ergänzt wird, wenn die Kultur bei Passage 5 eine Konfluenz von 70 % bis 80 % erreicht.
   VORSICHT: Verwenden Sie nur Basalmedien; Vermeiden Sie FBS und humane Thrombozytenlysat-Ergänzung, um eine Kontamination durch externe sEVs zu vermeiden.
2. Nach 24 h zentrifugieren Sie den CM bei 200 × g für 5 min bei 4 °C, um Zellreste zu entfernen. Sammeln und filtern Sie den Überstand durch einen 0,22-μm-Filter, um Partikel zu entfernen, die größer als 220 nm sind.
3. Füllen Sie die Zentrifugalfiltereinheit mit 30 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), die durch einen 0,2-μm-Filter gefiltert wird. Zentrifugieren Sie die Zentrifugalfiltereinheit bei 3.500 × g für 5 min bei 4 °C.
4. Füllen Sie das gefilterte CM in die Zentrifugalfiltereinheit (das maximale Volumen jeder Einheit beträgt 70 ml). Zentrifugieren Sie den CM bei 3.500 × g bei 4 °C.
   Anmerkungen: Die Dauer der Zentrifugation sollte von Zeit zu Zeit überwacht werden, bis die Lösung die Oberfläche des Filters erreicht hat.
5. Entsorgen Sie die Lösung im Filtratlösungsbecher. Den Probenfilterbecher mit dem Konzentratauffangbecher bei 1.000 x g bei 4 °C für 2 min rückwärts zentrifugieren.
6. Übertragen Sie das konzentrierte CM zurück in die Zentrifugalfiltereinheit. Geben Sie 30 ml filtriertes PBS in die Zentrifugalfiltereinheit und zentrifugieren Sie das Gerät bei 3.500 × g bei 4 °C.
7. Entsorgen Sie die Lösung im Filtratlösungsbecher. Installieren Sie einen Konzentratsammelbecher auf der Filtereinheit und zentrifugieren Sie 2 Minuten lang bei 4 °C bei 1.000 × g zurück, um die gereinigten sEVs zu erhalten.
8. Filtern Sie die sEVs durch einen 0,22 μm Spritzenvorsatzfilter.
9. Übertragen Sie die Proben in neue Röhrchen und lagern Sie sie zur weiteren Analyse bei -80 °C.

3. Charakterisierung von hUC-MSC-sEVs

1. Nanopartikel-Tracking-Analyse
   1. Verdünnen Sie die isolierten hUC-MSC-sEVs in gefiltertem PBS auf 20-100 Partikel/Frame.
   2. Geben Sie 1 ml der verdünnten Probe mit 1 ml Einwegspritzen in die NTA-Kammer.
   3. Stellen Sie die Messeinstellungen entsprechend ein: Stellen Sie die Kameraebene auf Stufe 14 ein, bestimmen Sie die Erkennungsschwelle , um so viele Partikel wie möglich einzuschließen, mit der Einschränkung, dass 10-100 rote Kreuze gezählt werden und die Anzahl der blauen Kreuze auf fünf begrenzt ist.
   4. Nehmen Sie für jede Messung fünf 1-minütige Videos auf und analysieren Sie sie mit der NanoSight-Software mit einer Nachweisschwelle von fünf.
   5. Nehmen Sie für jede Probe Messungen in dreifacher Ausfertigung vor.
2. Western-Blotting-Analyse
   1. Die hUC-MSC-sEVs werden mit einem RIPA-Lysepuffer (Ice-Cold Radioimmunoprecipitation Assay) lysiert, 30 min bei 4 °C inkubiert und bei 200 × g 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Sammle den Überstand ein.
   2. Quantifizieren Sie das Protein mit einem Bicinchoninsäure (BCA) Protein-Assay-Kit. Stellen Sie das Gelelektrophorese-Set entsprechend zusammen und führen Sie die Gelelektrophorese bei 90 V durch, bis das Protein das Ende des Stapelgels erreicht. Ändern Sie die Spannung auf 200 V, um die Proteine bis zum Ende des auflösenden Gels zu trennen.
   3. Führen Sie einen halbtrockenen Transfer durch, um die Proteine aus dem Gel auf eine Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membran bei 15 V für 1 h zu übertragen.
   4. Blockieren Sie die PVDF-Membran mit 3 % Rinderserumalbumin (BSA)/Tris-gepufferter Kochsalzlösung-0,1 % v/v Tween 20 (TBS-T) für 1 h auf einem Schüttler bei Raumtemperatur. Die PVDF-Membran wird mit Primärantikörpern wie folgt inkubiert: monoklonaler Anti-CD-9-Antikörper der Maus (1:500), monoklonaler Anti-CD-81-Antikörper der Maus (1:500), monoklonaler Anti-TSG 101-Antikörper der Maus (1:500) bei 4 °C über Nacht unter ständigem Schütteln.
   5. Am nächsten Tag wird die PVDF-Membran 5 x 5 min mit TBS-T gewaschen und mit einem sekundären Antikörper, dem Meerrettichperoxidase-konjugierten Maus-IgG-kappa-bindenden Protein (m-IgGκ BP-HRP) (1:5.000), 1 h lang unter Rühren bei Raumtemperatur inkubiert.
   6. Waschen Sie die PVDF-Membran erneut fünfmal mit TBS-T und visualisieren Sie die Membran in einem ladungsgekoppelten (CCD) Imager mit einem Chemilumineszenz-Detektionsreagenz. Analysieren Sie das Expressionsniveau der Proteine mit der ImageJ-Software. Öffnen Sie zunächst die Bilddatei in ImageJ (Datei | Öffnen...). Verbessern Sie die Bildqualität, indem Sie Helligkeit und Kontrast anpassen ("Bild | Anpassen | Helligkeit/Kontrast). Passen Sie das Bild an, bis die Flecken deutlich sichtbar sind, klicken Sie auf die Schaltfläche Übernehmen und speichern Sie die Bilder im TIFF-Format (Datei | Speichern unter | TIFF...).
3. Transmissionselektronenmikroskop
   1. Verdünnen Sie einen Teil der hUC-MSC-sEVs-Probe mit vier Teilen filtriertem PBS auf ein Gesamtvolumen von 10 μl und inkubieren Sie ihn 15 Minuten lang auf einem kohlenstoffbeschichteten Kupfergitter.
   2. Entfernen Sie die überschüssige Probe mit einem Labortuch und lassen Sie sie 3 Minuten lang an der Luft trocknen.
   3. Inkubieren Sie 10 μl 1%ige Phosphowolframsäure (PTA)-Lösung, um die Probe 3 Minuten lang zu färben.
   4. Entfernen Sie die überschüssige 1%ige PTA-Lösung mit einem Labortuch und lassen Sie sie 3 Minuten lang an der Luft trocknen.
   5. Verwenden Sie die Probe für die transmissionselektronenmikroskopische Bildgebung.
      HINWEIS: In Abbildung 1 finden Sie die zusammengefassten schematischen Experimentschritte.

Ergebnisse

Abbildung 2 zeigt, dass hUC-MSC-sEVs einen Partikelgrößenmodus bei 53 nm aufweisen, während andere signifikante Peaks der Partikelgröße bei 96 und 115 nm lagen. Die mit NTA gemessene Konzentration von hUC-MSC-sEVs betrug 7,75 × 10¹⁰ Partikel/ml. Die mit dem BCA-Assay gemessene Proteinkonzentration der hUC-MSC-sEVs betrug ca. 80 μg/ml.

In der Western-Blotting-Analyse zeigten hUC-MSC-sEVs positive Banden für die exosomalen Marker CD9, CD81 und TSG...

Diskussion

EVs sind eine der wichtigen Untergruppen des Sekretoms in MSCs, die eine entscheidende Rolle bei normalen und pathologischen Prozessen spielen. Allerdings haben sEVs mit einem Größenbereich zwischen 30 und 200 nm in den letzten zehn Jahren als potenzielles Werkzeug für die zellfreie Therapie zugenommen. Es wurden verschiedene Techniken entwickelt, um sEVs aus MSCs zu isolieren. Differentielle Ultrazentrifugation, Ultrafiltration, polymerbasierte Fällung, Immunaffinitätserfassung und mikrofluidikbasierte Fällung wei...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
40% acrylamide	Nacalai Tesque	06121-95	Western blot
95% ethanol	Nacalai Tesque	14710-25	Disinfectants
Absolute Methanol	Chemiz	45081	To activate PVDF membrane (Western blot)
Accutase	STEMCELL Technologies	7920	Cell dissociation enzyme
ammonium persulfate	Chemiz	14475	catalyse the gel polymerisation (Gel electrophoresis
anti-CD 81 (B-11)	Santa Cruz Biotechnology	sc-166029	Antibody for sEVs marker
anti-TSG 101 (C-2)	Santa Cruz Biotechnology	sc-7964	Antibody for sEVs marker
Bovine serum albumin	Nacalai Tesque	00653-31	PVDF membrane blocking
bromophenol blue	Nacalai Tesque	05808-61	electrophoretic color marker
Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL)	Millipore	UFC710008	sEVs isolation
ChemiLumi One L	Nacalai Tesque	7880	chemiluminescence detection reagent
CryoStor Freezing Media	Sigma-Aldrich	C3124-100ML	Cell cryopreserve
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Nacalai Tesque	08458-45	Cell culture media
ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein Marker	SMOBIO	PM2610	Protein molecular weight markers
Extra thick blotting paper	ATTO		buffer reservior (Western blot)
Glycerol	Merck	G5516	Chemicals for western blot
Glycine	1st Base	BIO-2085-500g	Chemicals for buffer (Western Blot)
horseradish peroxidase-conjugated mouse IgG kappa binding protein (m-IgGκBP-HRP)	Santa Cruz Biotechnology	sc-516102	Secondary antibody (Western Blot)
Human Wharton’s Jelly derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs)	Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Faculty of Medicine, The National University Malaysia
mouse antibodies anti-CD 9 (C-4)	Santa Cruz Biotechnology	sc-13118	Antibody for sEVs marker
Nanosight NS300 equipped with a CMOS camera, a 20 × objective lens, a blue laser module (488 nm), and NTA software v3.2	Malvern Panalytical, UK
paraformaldehyde	Nacalai Tesque	02890-45	Sample Fixation during TEM
penicillin–streptomycin	Nacalai Tesque	26253-84	Antibiotic for media
phenylmethylsulfonyl fluoride	Nacalai Tesque	27327-81	Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer
phosphate-buffered saline	Gibco	10010023	Washing, sample dilution
polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane with 0.45 mm pore size	ATTO		To hold protein during protein transfer (Western blot)
protease inhibitor cocktail	Nacalai Tesque	25955-11	Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer
Protein Assay Bicinchoninate Kit	Nacalai Tesque	06385-00	Protein measurement
sample buffer solution with 2-ME	Nacalai Tesque	30566-22	Reducing agent for western blot
sodium chloride	Nacalai Tesque	15266-64	Chemicals for western blot
sodium dodecyl sulfate	Nacalai Tesque	31606-62	ionic surfactant during gel electrophoresis
Tecnai G2 F20 S-TWIN transmission electron microscope	FEI, USA
tetramethylethylenediamine	Nacalai Tesque	33401-72	chemicals to prepare gel
tris-base	1st Base	BIO-1400-500g	Chemicals for buffer (Western Blot)
Tween 20	GeneTex	GTX30962	Chemicals for western blot
UVP (Ultra Vision Product) CCD imager			CCD imager for western blot signal detection