Простой метод настольной фильтрации для выделения небольших внеклеточных везикул из мезенхимальных стволовых клеток человека

Резюме

Этот протокол демонстрирует, как изолировать небольшие внеклеточные везикулы мезенхимальных стволовых клеток, полученных из пуповины человека (hUC-MSC-sEVs), с помощью простой лабораторной настольной настройки. Распределение по размерам, концентрация белка, маркеры sEVs и морфология изолированных hUC-MSC-sEV характеризуются анализом отслеживания наночастиц, анализом белка BCA, вестерн-блоттингом и просвечивающим электронным микроскопом соответственно.

Аннотация

Процесс, основанный на ультрацентрифугировании, считается распространенным методом выделения малых внеклеточных везикул (sEV). Однако выход от этого метода изоляции относительно ниже, и эти методы неэффективны при разделении подтипов sEV. Это исследование демонстрирует простой метод настольной фильтрации для выделения малых внеклеточных везикул МСК, полученных из пуповины человека (hUC-MSC-sEVs), успешно отделенных ультрафильтрацией от кондиционированной среды hUC-MSCs. Распределение по размерам, концентрация белка, экзосомальные маркеры (CD9, CD81, TSG101) и морфология выделенных hUC-MSC-sEV были охарактеризованы с помощью анализа отслеживания наночастиц, анализа белка BCA, вестерн-блоттинга и просвечивающего электронного микроскопа соответственно. Размер изолированных hUC-MSC-sEV составлял 30-200 нм, с концентрацией частиц 7,75 × 10 частиц /^мл и концентрацией белка 80 мкг / мл. Наблюдались положительные полосы для экзосомальных маркеров CD9, CD81 и TSG101. Это исследование показало, что hUC-MSC-sEV были успешно выделены из кондиционированной среды hUC-MSCs, а характеристика показала, что выделенный продукт соответствует критериям, указанным в Минимальная информация для исследований внеклеточных везикул 2018 (MISEV 2018).

Введение

Согласно MISEV 2018, sEV представляют собой нереплицирующиеся липидные бислойные частицы без функционального ядра размером 30-200^{нм 1}. sEV, полученные из MSC, содержат важные сигнальные молекулы, которые играют важную роль в регенерации тканей, такие как микроРНК, цитокины или белки. Они все чаще становятся исследовательской «горячей точкой» в области регенеративной медицины и бесклеточной терапии. Многие исследования показали, что sEV, полученные из МСК, так же эффективны, как и МСК, при лечении различных состояний, таких как иммуномодуляция 2,3,4,5, усиление остеогенеза ⁶, сахарный диабет ^7,8 или регенерация сосудов ^9,10. По мере продвижения исследований на ранней стадии были выделены три основных ключевых вопроса, связанных с клинической трансляцией МСК-ЭВ: выход ВВ, чистота ВВ (свободные от клеточного мусора и других биологических загрязнителей, таких как белок и цитокины) и целостность фосфолипидной двухслойной мембраны ВВ после выделения.

Были разработаны различные методы выделения sEV с использованием плотности, формы, размера и поверхностного белка sEVs¹¹. Двумя наиболее распространенными методами изоляции электромобилей являются методы на основе ультрацентрифугирования и ультрафильтрации.

Методы, основанные на ультрацентрифугировании, считаются золотым стандартом при выделении электромобилей. Два типа методов ультрацентрифугирования, которые обычно используются, - это дифференциальное ультрацентрифугирование и ультрацентрифугирование с градиентом плотности. Однако методы ультрацентрифугирования часто приводят к низкому выходу и требуют дорогостоящего оборудования для высокоскоростной ультрацентрифуги (100 000-200 000 × г)¹¹. Кроме того, методы ультрацентрифугирования сами по себе неэффективны при разделении подтипов EV (sEV и больших EV), что приводит к образованию нечистого слоя^{осадка 11}. Наконец, ультрацентрифугирование градиента плотности также может занимать много времени и требовать дополнительных мер предосторожности, таких как добавление буфера сахарозы, чтобы предотвратить повреждение градиента на этапах¹² ускорения и замедления. Следовательно, ультрацентрифугирование обычно приводит к относительно низкому выходу и не способно различать различные популяции ЭВ¹³, что ограничивает его применение для крупномасштабной подготовки^{ЭВ 11}.

Второй метод изоляции электромобилей - это ультрафильтрация, основанная на фильтрации по размеру. Ультрафильтрация относительно эффективна по времени и затратам по сравнению с ультрацентрифугированием, поскольку она не требует дорогостоящего оборудования или длительного времени обработки¹⁴. Следовательно, ультрафильтрация, по-видимому, является более эффективным методом изоляции, чем оба вышеупомянутых метода ультрацентрифугирования. Изолированные продукты могут быть более конкретными в зависимости от размеров пор и более высокого выхода¹⁵. Однако дополнительная сила, возникающая в процессе фильтрации, может привести к деформации или извержению EV¹⁶.

В настоящем документе предложен экономичный и эффективный по времени настольный протокол для выделения sEV, полученных из MSC, для последующего анализа и терапевтических целей. Метод, описанный в этой статье, сочетал в себе простой метод фильтрации с настольным центрифугированием для выделения высокопродуктивных и качественных EV из hUC-MSC для последующего анализа, включая анализ размера частиц, анализ биомаркеров и электронно-микроскопическую визуализацию.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для получения подробной информации обо всех материалах, оборудовании и программном обеспечении, используемых в этом протоколе.

1. Мезенхимальные стволовые клетки пуповины человека и культура

1. Культивируйте hUC-MSCs при плотности высева 5 × 10³/^см2 в DMEM, дополненный 8% лизатом тромбоцитов человека и 1% Pen-стрептококком. Инкубируйте клетки при 37 ° C в 5% CO₂. Заменяйте среду для культивирования клеток каждые 3 дня, чтобы обеспечить правильный рост клеток.
2. Расширьте ячейки до прохода 5 в колбах T175 для изоляции sEV.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения высокого выхода sEV требуется много колб (выход увеличивается с увеличением количества ячеек).

2. Выделение малых внеклеточных везикул из hUC - МСК

1. Замените культуральную среду свежим ДМЭМ, не содержащим фенол-красного, с добавлением 1% Pen-Strep [кондиционированная среда (CM)], когда культура достигнет 70-80% слияния при прохождении 5.
   ВНИМАНИЕ: Используйте только базальные среды; избегайте добавок FBS и лизата тромбоцитов человека, чтобы избежать загрязнения внешними sEV.
2. Через 24 ч центрифугируют КМ при 200 × г в течение 5 мин при 4 °С для удаления клеточного мусора. Соберите и отфильтруйте надосадочную жидкость через фильтр 0,22 мкм для удаления частиц размером более 220 нм.
3. Заполните центробежный фильтрующий блок 30 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS), отфильтрованного через фильтр 0,2 мкм. Центрифугу центробежного фильтрующего блока при 3 500 × г в течение 5 мин при 4 °C.
4. Залейте отфильтрованный CM в центробежный фильтрующий блок (максимальный объем каждого блока составляет 70 мл). Центрифугу КМ при 3 500 × г при 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность центрифугирования следует контролировать время от времени, пока раствор не достигнет поверхности фильтра.
5. Вылейте раствор в чашку с раствором фильтрата. Обратная центрифуга пробоотборника с чашкой для сбора концентрата при 1 000 x g при 4 °C в течение 2 мин.
6. Переведите концентрированный CM обратно в центробежный фильтрующий блок. Добавьте 30 мл отфильтрованного PBS в центробежный фильтрующий блок и центрифугируйте установку при 3,500 × г при 4 °C.
7. Вылейте раствор в чашку с раствором фильтрата. Установите чашку для сбора концентрата на фильтрующий блок и проведите реверсивную центрифугу при 1 000 × г в течение 2 мин при 4 ° C для получения очищенных электромобилей.
8. Отфильтруйте sEV через шприцевой фильтр 0,22 мкм.
9. Переложите образцы в новые пробирки и храните их при температуре -80 °C для дальнейшего анализа.

3. Характеристика hUC-MSC-sEV

1. Анализ отслеживания наночастиц
   1. Разбавьте изолированные hUC-MSC-sEV в отфильтрованном PBS до 20-100 частиц в кадре.
   2. Введите 1 мл разбавленного образца в камеру NTA с помощью одноразовых шприцев объемом 1 мл.
   3. Установите соответствующие настройки измерения: отрегулируйте уровень камеры до уровня 14, определите порог обнаружения , чтобы включить как можно больше частиц с ограничением, что подсчитывается 10-100 красных крестов , а количество синих крестиков ограничено пятью.
   4. Для каждого измерения запишите пять видеороликов продолжительностью 1 минута и проанализируйте их с помощью программного обеспечения NanoSight с порогом обнаружения пять.
   5. Сделайте измерения в трех экземплярах для каждого образца.
2. Анализ вестерн-блоттинга
   1. Лизируют hUC-MSC-sEV с помощью ледяного буфера для лизиса методом радиоиммунопреципитации (RIPA), инкубируют в течение 30 мин при 4 °C и центрифугу при 200 × г в течение 5 мин при 4 °C. Соберите надосадочную жидкость.
   2. Количественно определите белок с помощью набора для анализа белка бицинхониновой кислоты (BCA). Соберите набор для гель-электрофореза соответствующим образом и выполняйте гель-электрофорез при 90 В, пока белок не достигнет конца геля для укладки. Измените напряжение на 200 В, чтобы отделить белки до конца рассасывающегося геля.
   3. Выполняйте полусухой перенос для переноса белков из геля в мембрану из поливинилидендифторида (PVDF) при 15 В в течение 1 ч.
   4. Заблокируйте мембрану PVDF 3% бычьим сывороточным альбумином (BSA)/трис-буферным физиологическим раствором-0,1% v/v Tween 20 (TBS-T) в течение 1 ч на шейкере при комнатной температуре. Инкубируют мембрану PVDF с первичными антителами следующим образом: моноклональное антитело мыши против CD 9 (1:500), моноклональное антитело против CD 81 мыши (1:500), моноклональное антитело мыши против GRP 94 моноклональное антитело мыши против TSG 101 (1:500) при 4 ° C в течение ночи с постоянным встряхиванием.
   5. На следующий день мембрану PVDF промывают 5 х 5 мин TBS-T и далее инкубируют с вторичным антителом: конъюгированным с пероксидазой хрена мышиным каппа-белком (m-IgGκ BP-HRP) (1:5000) в течение 1 ч с перемешиванием при комнатной температуре.
   6. Опять же, промойте мембрану PVDF TBS-T пять раз и визуализируйте мембрану в тепловизоре с зарядовой связью (CCD) с помощью реагента для обнаружения хемилюминесценции. Проанализируйте уровень экспрессии белков с помощью программного обеспечения ImageJ. Сначала откройте файл изображения в ImageJ (File | Открыть...). Повысьте качество изображения, отрегулировав яркость и контрастность (Изображение | Отрегулируйте | Яркость/контрастность). Отрегулируйте изображение до тех пор, пока кляксы не станут хорошо видны, нажмите кнопку «Применить », а затем сохраните изображения в формате TIFF (Файл | Сохранить как | ТИФФ...).
3. Просвечивающий электронный микроскоп
   1. Разбавьте одну часть образца hUC-MSC-sEVs четырьмя частями отфильтрованного PBS до общего объема 10 мкл и инкубируйте на медной сетке с углеродным покрытием в течение 15 мин.
   2. Удалите излишки образца с помощью лабораторной салфетки и дайте ему высохнуть на воздухе в течение 3 минут.
   3. Инкубировать 10 мкл 1% раствора фосфовольфрамовой кислоты (ПТА) для окрашивания образца в течение 3 мин.
   4. Удалите излишки 1% раствора PTA с помощью лабораторной салфетки и дайте ему высохнуть на воздухе в течение 3 минут.
   5. Используйте образец для визуализации просвечивающим электронным микроскопом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 приведены обобщенные этапы схематического эксперимента.

Результаты

На рисунке 2 показано, что hUC-MSC-sEV имеют режим размера частиц на длине волны 53 нм, в то время как другие значимые пики размера частиц составляли 96 и 115 нм. Концентрация hUC-MSC-sEV, измеренная NTA, составляла 7,75 × 10 частиц /^мл . Концентрация белка hUC-MSC-sEV, измеренная с помощью ан?...

Обсуждение

ЭВ являются одним из важных подмножеств секретома в МСК, которые играют решающую роль во время нормальных и патологических процессов. Тем не менее, в последнее десятилетие sEV с диапазоном размеров от 30 до 200 нм стали потенциальным инструментом для бесклеточной терапии. Были разработаны ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
40% acrylamide	Nacalai Tesque	06121-95	Western blot
95% ethanol	Nacalai Tesque	14710-25	Disinfectants
Absolute Methanol	Chemiz	45081	To activate PVDF membrane (Western blot)
Accutase	STEMCELL Technologies	7920	Cell dissociation enzyme
ammonium persulfate	Chemiz	14475	catalyse the gel polymerisation (Gel electrophoresis
anti-CD 81 (B-11)	Santa Cruz Biotechnology	sc-166029	Antibody for sEVs marker
anti-TSG 101 (C-2)	Santa Cruz Biotechnology	sc-7964	Antibody for sEVs marker
Bovine serum albumin	Nacalai Tesque	00653-31	PVDF membrane blocking
bromophenol blue	Nacalai Tesque	05808-61	electrophoretic color marker
Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL)	Millipore	UFC710008	sEVs isolation
ChemiLumi One L	Nacalai Tesque	7880	chemiluminescence detection reagent
CryoStor Freezing Media	Sigma-Aldrich	C3124-100ML	Cell cryopreserve
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Nacalai Tesque	08458-45	Cell culture media
ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein Marker	SMOBIO	PM2610	Protein molecular weight markers
Extra thick blotting paper	ATTO		buffer reservior (Western blot)
Glycerol	Merck	G5516	Chemicals for western blot
Glycine	1st Base	BIO-2085-500g	Chemicals for buffer (Western Blot)
horseradish peroxidase-conjugated mouse IgG kappa binding protein (m-IgGκBP-HRP)	Santa Cruz Biotechnology	sc-516102	Secondary antibody (Western Blot)
Human Wharton’s Jelly derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs)	Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Faculty of Medicine, The National University Malaysia
mouse antibodies anti-CD 9 (C-4)	Santa Cruz Biotechnology	sc-13118	Antibody for sEVs marker
Nanosight NS300 equipped with a CMOS camera, a 20 × objective lens, a blue laser module (488 nm), and NTA software v3.2	Malvern Panalytical, UK
paraformaldehyde	Nacalai Tesque	02890-45	Sample Fixation during TEM
penicillin–streptomycin	Nacalai Tesque	26253-84	Antibiotic for media
phenylmethylsulfonyl fluoride	Nacalai Tesque	27327-81	Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer
phosphate-buffered saline	Gibco	10010023	Washing, sample dilution
polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane with 0.45 mm pore size	ATTO		To hold protein during protein transfer (Western blot)
protease inhibitor cocktail	Nacalai Tesque	25955-11	Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer
Protein Assay Bicinchoninate Kit	Nacalai Tesque	06385-00	Protein measurement
sample buffer solution with 2-ME	Nacalai Tesque	30566-22	Reducing agent for western blot
sodium chloride	Nacalai Tesque	15266-64	Chemicals for western blot
sodium dodecyl sulfate	Nacalai Tesque	31606-62	ionic surfactant during gel electrophoresis
Tecnai G2 F20 S-TWIN transmission electron microscope	FEI, USA
tetramethylethylenediamine	Nacalai Tesque	33401-72	chemicals to prepare gel
tris-base	1st Base	BIO-1400-500g	Chemicals for buffer (Western Blot)
Tween 20	GeneTex	GTX30962	Chemicals for western blot
UVP (Ultra Vision Product) CCD imager			CCD imager for western blot signal detection