Un semplice metodo di filtrazione da banco per isolare piccole vescicole extracellulari da cellule staminali mesenchimali umane

Riepilogo

Questo protocollo dimostra come isolare le piccole vescicole extracellulari derivate dal cordone ombelicale umano (hUC-MSC-sEV) con una semplice impostazione da banco su scala di laboratorio. La distribuzione dimensionale, la concentrazione proteica, i marcatori sEVs e la morfologia degli hUC-MSC-sEV isolati sono caratterizzati rispettivamente dall'analisi del tracciamento delle nanoparticelle, dal saggio della proteina BCA, dal western blot e dal microscopio elettronico a trasmissione.

Abstract

Il processo basato sull'ultracentrifugazione è considerato il metodo comune per l'isolamento di piccole vescicole extracellulari (sEV). Tuttavia, la resa di questo metodo di isolamento è relativamente inferiore e questi metodi sono inefficienti nel separare i sottotipi sEV. Questo studio dimostra un semplice metodo di filtrazione da banco per isolare le piccole vescicole extracellulari MSC derivate dal cordone ombelicale umano (hUC-MSC-sEVs), separate con successo mediante ultrafiltrazione dal mezzo condizionato di hUC-MSC. La distribuzione dimensionale, la concentrazione proteica, i marcatori esosomici (CD9, CD81, TSG101) e la morfologia degli hUC-MSC-sEV isolati sono stati caratterizzati rispettivamente con analisi di tracciamento delle nanoparticelle, saggio della proteina BCA, western blot e microscopio elettronico a trasmissione. La dimensione degli hUC-MSC-sEV isolati era di 30-200 nm, con una concentrazione di particelle di 7,75 × 10 10 particelle/ml e una concentrazione proteica di⁸⁰ μg/mL. Sono state osservate bande positive per i marcatori esosomici CD9, CD81 e TSG101. Questo studio ha dimostrato che gli hUC-MSC-sEV sono stati isolati con successo dal mezzo condizionato da hUC-MSCs e la caratterizzazione ha mostrato che il prodotto isolato soddisfaceva i criteri menzionati da Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV 2018).

Introduzione

Secondo MISEV 2018, le sEV sono particelle lipidiche a doppio strato non replicanti senza nucleo funzionale presente, con una dimensione di 30-200 nm¹. Le sEV derivate da MSC contengono importanti molecole di segnalazione che svolgono un ruolo importante nella rigenerazione dei tessuti, come microRNA, citochine o proteine. Sono diventati sempre più un "hotspot" di ricerca nella medicina rigenerativa e nella terapia cell-free. Molti studi hanno dimostrato che le sEV derivate da MSC sono efficaci quanto le MSC nel trattamento di diverse condizioni, come l'immunomodulazione 2,3,4,5, il miglioramento dell'osteogenesi ⁶, il diabete mellito^7,8 o la rigenerazione vascolare ^9,10. Con il progredire degli studi di fase iniziale, sono state evidenziate tre questioni chiave principali in relazione alla traduzione clinica delle MSC-EV: la resa delle EV, la purezza delle EV (esenti da detriti cellulari e altri contaminanti biologici come proteine e citochine) e l'integrità della membrana fosfolipidica a doppio strato delle EV dopo l'isolamento.

Sono stati sviluppati vari metodi per isolare i sEV, sfruttando la densità, la forma, le dimensioni e le proteine di superficie dei sEV¹¹. I due metodi più comuni nell'isolamento dei veicoli elettrici sono tecniche basate sull'ultracentrifugazione e sull'ultrafiltrazione.

I metodi basati sull'ultracentrifugazione sono considerati metodi gold standard nell'isolamento dei sEV. Due tipi di tecniche di ultracentrifugazione che vengono solitamente impiegate sono l'ultracentrifugazione differenziale e l'ultracentrifugazione a gradiente di densità. Tuttavia, i metodi di ultracentrifugazione spesso comportano una bassa resa e richiedono costose attrezzature per l'ultracentrifuga ad alta velocità (100.000-200.000 × g)¹¹. Inoltre, le tecniche di ultracentrifugazione da sole sono inefficienti nel separare i sottotipi di EV (sEV e grandi EV), risultando in uno strato di sedimenti impuri¹¹. Infine, l'ultracentrifugazione del gradiente di densità potrebbe anche richiedere molto tempo e richiedere ulteriori misure precauzionali come l'aggiunta di tampone di saccarosio per inibire il danno del gradiente durante le fasi di accelerazione e decelerazione¹². Pertanto, l'ultracentrifugazione di solito porta a una resa relativamente bassa e non è in grado di discriminare tra diverse popolazioni di EV¹³, il che limita la sua applicazione per la preparazione di EV su larga scala¹¹.

Il secondo metodo di isolamento EV è tramite ultrafiltrazione, che si basa sulla filtrazione dimensionale. L'ultrafiltrazione è relativamente efficiente in termini di tempo e costi rispetto all'ultracentrifugazione, in quanto non comporta attrezzature costose o lunghi tempi di lavorazione¹⁴. Quindi, l'ultrafiltrazione sembra essere una tecnica di isolamento più efficace di entrambi i suddetti metodi di ultracentrifugazione. I prodotti isolati possono essere più specifici in base alle dimensioni dei pori e alla maggiore resa¹⁵. Tuttavia, la forza aggiuntiva sostenuta durante il processo di filtrazione può provocare la deformazione o l'eruzione dei veicoli elettrici¹⁶.

Il presente documento ha proposto un protocollo da banco economico e tempestivo per isolare i sEV derivati da MSC per l'analisi a valle e scopi terapeutici. Il metodo descritto in questo documento ha combinato un semplice metodo di filtrazione con centrifugazione da banco per isolare EV ad alto rendimento e di buona qualità da hUC-MSC per l'analisi a valle, compresa l'analisi delle dimensioni delle particelle, il saggio dei biomarcatori e l'imaging al microscopio elettronico.

Protocollo

NOTA: vedere la tabella dei materiali per informazioni dettagliate su tutti i materiali, le attrezzature e il software utilizzati in questo protocollo.

1. Cellule staminali mesenchimali del cordone ombelicale umano e coltura

1. Coltura delle hUC-MSC ad una densità di semina di 5 × 10³/cm² in DMEM, integrata con lisato piastrinico umano all'8% e penna strep all'1%. Incubare le cellule a 37 °C in 5% di CO₂. Sostituire il terreno di coltura cellulare ogni 3 giorni per garantire una corretta crescita cellulare.
2. Espandere le celle fino al passaggio 5 nei palloni T175 per l'isolamento sEV.
   NOTA: Sono necessari molti palloni per raccogliere un'alta resa di sEV (la resa aumenta con il numero di celle).

2. Isolamento di piccole vescicole extracellulari da hUC - MSCs

1. Sostituire il terreno di coltura con DMEM fresco privo di rosso fenolo integrato con 1% Pen-Strep [Terreno condizionato (CM)] quando la coltura raggiunge il 70% -80% di confluenza al passaggio 5.
   ATTENZIONE: Utilizzare solo supporti basali; evitare FBS e integratori di lisato piastrinico umano per evitare la contaminazione da sEV esterni.
2. Dopo 24 ore, centrifugare il CM a 200 × g per 5 minuti a 4 °C per rimuovere i residui cellulari. Raccogliere e filtrare il surnatante attraverso un filtro da 0,22 μm per rimuovere particelle più grandi di 220 nm.
3. Riempire l'unità filtrante centrifuga con 30 ml di soluzione salina tamponata fosfato (PBS) filtrata attraverso un filtro da 0,2 μm. Centrifugare l'unità filtrante centrifuga a 3.500 × g per 5 minuti a 4 °C.
4. Riempire il CM filtrato nell'unità filtrante centrifuga (il volume massimo di ciascuna unità è di 70 ml). Centrifugare il CM a 3.500 × g a 4 °C.
   NOTA: La durata della centrifugazione deve essere monitorata di volta in volta fino a quando la soluzione non ha raggiunto la superficie del filtro.
5. Gettare la soluzione nella tazza della soluzione filtrata. Centrifugare inversamente il bicchiere filtrante del campione con il bicchiere di raccolta del concentrato a 1.000 x g a 4 °C per 2 minuti.
6. Trasferire nuovamente la CM concentrata nell'unità filtrante centrifuga. Aggiungere 30 mL di PBS filtrato nell'unità filtrante centrifuga e centrifugare l'unità a 3.500 × g a 4 °C.
7. Gettare la soluzione nella tazza della soluzione filtrata. Installare un bicchiere di raccolta del concentrato sull'unità filtrante e centrifugare inversamente a 1.000 × g per 2 minuti a 4 °C per ottenere i sEV purificati.
8. Filtrare i sEV attraverso un filtro a siringa da 0,22 μm.
9. Trasferire i campioni in nuove provette e conservarli a -80 °C per ulteriori analisi.

3. Caratterizzazione degli hUC-MSC-sEVs

1. Analisi di tracciamento delle nanoparticelle
   1. Diluire gli hUC-MSC-sEV isolati in PBS filtrati a 20-100 particelle/frame.
   2. Introdurre 1 mL del campione diluito nella camera NTA utilizzando siringhe monouso da 1 ml.
   3. Impostare le impostazioni di misurazione di conseguenza: regolare il livello della telecamera al livello 14, determinare la soglia di rilevamento per includere il maggior numero possibile di particelle con la limitazione che vengano contate 10-100 croci rosse e il conteggio delle croci blu è limitato a cinque.
   4. Per ogni misurazione, registrare cinque video di 1 minuto e analizzarli utilizzando il software NanoSight con una soglia di rilevamento di cinque.
   5. Effettuare misurazioni in triplice copia per ogni campione.
2. Analisi Western blotting
   1. Lisare gli hUC-MSC-sEV con tampone di lisi RIPA (ice-cold radioimmunoprecipitation assay), incubare per 30 min a 4 °C e centrifugare a 200 × g per 5 min a 4 °C. Raccogli il surnatante.
   2. Quantificare la proteina utilizzando un kit di dosaggio delle proteine dell'acido bicinconinico (BCA). Assemblare il set di elettroforesi su gel di conseguenza ed eseguire l'elettroforesi su gel a 90 V fino a quando la proteina raggiunge l'estremità del gel impilabile. Cambiare la tensione a 200 V per separare le proteine fino alla fine del gel risolutivo.
   3. Eseguire il trasferimento semisecco per trasferire le proteine dal gel a una membrana di polivinilidendifluoruro (PVDF) a 15 V per 1 ora.
   4. Bloccare la membrana PVDF con albumina sierica bovina al 3% (BSA)/soluzione salina tamponata Tris-0,1% v/v Tween 20 (TBS-T) per 1 ora su uno shaker a temperatura ambiente. Incubare la membrana PVDF con anticorpi primari come segue: anticorpo monoclonale anti-CD 9 di topo (1:500), anticorpo monoclonale anti-CD 81 di topo (1:500), anticorpo monoclonale di topo anti-GRP 94 monoclonale di topo anti-TSG 101 (1:500) a 4 °C durante la notte con agitazione costante.
   5. Il giorno successivo, lavare la membrana PVDF 5 x 5 min con TBS-T e incubare ulteriormente con un anticorpo secondario: proteina legante IgG kappa del topo coniugata con perossidasi di rafano (m-IgGκ BP-HRP) (1:5.000) per 1 ora agitazione a temperatura ambiente.
   6. Ancora una volta, lavare la membrana PVDF con TBS-T cinque volte e visualizzare la membrana in un imager ad accoppiamento di carica (CCD) utilizzando un reagente di rilevamento a chemiluminescenza. Analizzare il livello di espressione delle proteine utilizzando il software ImageJ. Innanzitutto, apri il file immagine in ImageJ (File | Aperto...). Migliorare la qualità dell'immagine regolando la luminosità e il contrasto (Immagine | Regola | Luminosità/Contrasto). Regolare l'immagine fino a quando le macchie sono chiaramente visibili, fare clic sul pulsante Applica , quindi salvare le immagini in formato TIFF (File | Salva con nome | TIFF...).
3. Microscopio elettronico a trasmissione
   1. Diluire una parte del campione hUC-MSC-sEVs con quattro parti di PBS filtrato per un volume totale di 10 μL e incubare su una griglia di rame rivestita di carbonio per 15 minuti.
   2. Rimuovere il campione in eccesso con una salvietta da laboratorio e lasciarlo asciugare all'aria per 3 minuti.
   3. Incubare 10 μL di soluzione di acido fosfotungstico (PTA) all'1% per colorare il campione per 3 minuti.
   4. Rimuovere la soluzione di PTA all'1% in eccesso utilizzando una salvietta da laboratorio e lasciarla asciugare all'aria per 3 minuti.
   5. Utilizzare il campione per l'imaging al microscopio elettronico a trasmissione.
      NOTA: fare riferimento alla Figura 1 per i passaggi schematici dell'esperimento riepilogati.

Risultati

La Figura 2 mostra che gli hUC-MSC-sEV hanno una modalità di dimensione delle particelle a 53 nm, mentre altri picchi significativi di dimensione delle particelle erano 96 e 115 nm. La concentrazione di hUC-MSC-sEV misurata da NTA era 7,75 × 10¹⁰ particelle/ml. La concentrazione proteica di hUC-MSC-sEVs misurata con il test BCA era di circa 80 μg/ml.

Nell'analisi western blotting, gli hUC-MSC-sEV hanno dimostrato bande positive per i marcatori esosom...

Discussione

Le EV sono uno dei sottoinsiemi importanti del secretoma nelle MSC che svolgono un ruolo cruciale durante i processi normali e patologici. Tuttavia, le sEV, con un intervallo di dimensioni comprese tra 30 e 200 nm, sono aumentate come potenziale strumento per la terapia senza cellule negli ultimi dieci anni. Sono state sviluppate varie tecniche per isolare i sEV dalle MSC. Tuttavia, l'ultracentrifugazione differenziale, l'ultrafiltrazione, la precipitazione a base di polimeri, la cattura di immunoaffinità e la precipita...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
40% acrylamide	Nacalai Tesque	06121-95	Western blot
95% ethanol	Nacalai Tesque	14710-25	Disinfectants
Absolute Methanol	Chemiz	45081	To activate PVDF membrane (Western blot)
Accutase	STEMCELL Technologies	7920	Cell dissociation enzyme
ammonium persulfate	Chemiz	14475	catalyse the gel polymerisation (Gel electrophoresis
anti-CD 81 (B-11)	Santa Cruz Biotechnology	sc-166029	Antibody for sEVs marker
anti-TSG 101 (C-2)	Santa Cruz Biotechnology	sc-7964	Antibody for sEVs marker
Bovine serum albumin	Nacalai Tesque	00653-31	PVDF membrane blocking
bromophenol blue	Nacalai Tesque	05808-61	electrophoretic color marker
Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL)	Millipore	UFC710008	sEVs isolation
ChemiLumi One L	Nacalai Tesque	7880	chemiluminescence detection reagent
CryoStor Freezing Media	Sigma-Aldrich	C3124-100ML	Cell cryopreserve
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Nacalai Tesque	08458-45	Cell culture media
ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein Marker	SMOBIO	PM2610	Protein molecular weight markers
Extra thick blotting paper	ATTO		buffer reservior (Western blot)
Glycerol	Merck	G5516	Chemicals for western blot
Glycine	1st Base	BIO-2085-500g	Chemicals for buffer (Western Blot)
horseradish peroxidase-conjugated mouse IgG kappa binding protein (m-IgGκBP-HRP)	Santa Cruz Biotechnology	sc-516102	Secondary antibody (Western Blot)
Human Wharton’s Jelly derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs)	Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Faculty of Medicine, The National University Malaysia
mouse antibodies anti-CD 9 (C-4)	Santa Cruz Biotechnology	sc-13118	Antibody for sEVs marker
Nanosight NS300 equipped with a CMOS camera, a 20 × objective lens, a blue laser module (488 nm), and NTA software v3.2	Malvern Panalytical, UK
paraformaldehyde	Nacalai Tesque	02890-45	Sample Fixation during TEM
penicillin–streptomycin	Nacalai Tesque	26253-84	Antibiotic for media
phenylmethylsulfonyl fluoride	Nacalai Tesque	27327-81	Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer
phosphate-buffered saline	Gibco	10010023	Washing, sample dilution
polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane with 0.45 mm pore size	ATTO		To hold protein during protein transfer (Western blot)
protease inhibitor cocktail	Nacalai Tesque	25955-11	Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer
Protein Assay Bicinchoninate Kit	Nacalai Tesque	06385-00	Protein measurement
sample buffer solution with 2-ME	Nacalai Tesque	30566-22	Reducing agent for western blot
sodium chloride	Nacalai Tesque	15266-64	Chemicals for western blot
sodium dodecyl sulfate	Nacalai Tesque	31606-62	ionic surfactant during gel electrophoresis
Tecnai G2 F20 S-TWIN transmission electron microscope	FEI, USA
tetramethylethylenediamine	Nacalai Tesque	33401-72	chemicals to prepare gel
tris-base	1st Base	BIO-1400-500g	Chemicals for buffer (Western Blot)
Tween 20	GeneTex	GTX30962	Chemicals for western blot
UVP (Ultra Vision Product) CCD imager			CCD imager for western blot signal detection