Um Método Simples de Filtração de Bancada para Isolar Pequenas Vesículas Extracelulares de Células-Tronco Mesenquimais Humanas

Resumo

Este protocolo demonstra como isolar pequenas vesículas extracelulares de células-tronco mesenquimais derivadas do cordão umbilical humano (hUC-MSC-sEVs) com uma configuração simples de bancada em escala laboratorial. A distribuição de tamanho, concentração de proteínas, marcadores de sEVs e morfologia de hUC-MSC-sEVs isolados são caracterizados por análise de rastreamento de nanopartículas, ensaio de proteína BCA, western blot e microscópio eletrônico de transmissão, respectivamente.

Resumo

O processo baseado em ultracentrifugação é considerado o método comum para o isolamento de pequenas vesículas extracelulares (EVs). No entanto, o rendimento desse método de isolamento é relativamente menor, e esses métodos são ineficientes na separação dos subtipos de sEV. Este estudo demonstra um método simples de filtração de bancada para isolar pequenas vesículas extracelulares de CTM derivadas do cordão umbilical humano (hUC-MSC-sEVs), separadas com sucesso por ultrafiltração do meio condicionado de hUC-MSCs. A distribuição de tamanho, concentração de proteínas, marcadores exossômicos (CD9, CD81, TSG101) e morfologia dos hUC-MSC-sEVs isolados foram caracterizados com análise de rastreamento de nanopartículas, ensaio de proteína BCA, western blot e microscópio eletrônico de transmissão, respectivamente. O tamanho das hUC-MSC-sEVs isoladas foi de 30-200 nm, com concentração de partículas de 7,75 × 10 10 partículas/mL e concentração proteica de⁸⁰ μg/mL. Bandas positivas para os marcadores exossômicos CD9, CD81 e TSG101 foram observadas. Este estudo mostrou que hUC-MSC-sEVs foram isolados com sucesso do meio condicionado hUC-MSCs, e a caracterização mostrou que o produto isolado preencheu os critérios mencionados pelo Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV 2018).

Introdução

De acordo com o MISEV 2018, sEVs são partículas de bicamada lipídica não replicantes sem núcleo funcional presente, com um tamanho de 30-200 nm¹. Os sEVs derivados de CTM contêm moléculas sinalizadoras importantes que desempenham papéis importantes na regeneração tecidual, como microRNA, citocinas ou proteínas. Eles têm se tornado cada vez mais um "hotspot" de pesquisa em medicina regenerativa e terapia livre de células. Muitos estudos têm demonstrado que as EVs derivadas das CTM são tão eficazes quanto as CTMs no tratamento de diferentes condições, como imunomodulação2,3,4,5, potencialização da osteogênese6^, diabetes mellitus7,8^{ou regeneração vascular9,10}. À medida que os ensaios de fase inicial avançam, três questões-chave principais em relação à tradução clínica das CTMs-EVs têm sido destacadas: o rendimento dos EVs, a pureza dos EVs (livres de restos celulares e outros contaminantes biológicos, como proteínas e citocinas) e a integridade da membrana bicamada fosfolipídica dos EVs após o isolamento.

Vários métodos têm sido desenvolvidos para isolar os sEVs, explorando a densidade, forma, tamanho e proteína de superfície dos sEVs¹¹. Os dois métodos mais comuns em isolamentos de sEVs são técnicas baseadas em ultracentrifugação e técnicas baseadas em ultrafiltração.

Métodos baseados em ultracentrifugação são considerados métodos padrão-ouro no isolamento de sEVs. Dois tipos de técnicas de ultracentrifugação que são usualmente empregadas são a ultracentrifugação diferencial e a ultracentrifugação por gradiente de densidade. No entanto, os métodos de ultracentrifugação frequentemente resultam em baixo rendimento e requerem equipamentos caros para ultracentrifugação de alta velocidade (100.000-200.000 × g)¹¹. Além disso, as técnicas de ultracentrifugação isoladamente são ineficientes na separação dos subtipos de EV (sEVs e grandes EVs), resultando em uma camada de sedimento impura¹¹. Por fim, a ultracentrifugação por gradiente de densidade também pode ser demorada e exigir precauções adicionais, como a adição de tampão de sacarose para inibir o dano do gradiente durante as etapas de aceleração e desaceleração¹². Assim, a ultracentrifugação geralmente leva a um rendimento relativamente baixo e não é capaz de discriminar diferentes populações de EVs¹³, o que limita sua aplicação para a preparação em larga escala de EV¹¹.

O segundo método de isolamento de EV é via ultrafiltração, que é baseada na filtração de tamanho. A ultrafiltração é relativamente eficaz em termos de tempo e custo em comparação com a ultracentrifugação, pois não envolve equipamentos caros ou longos tempos de processamento¹⁴. Assim, a ultrafiltração parece ser uma técnica de isolamento mais eficaz do que os dois métodos de ultracentrifugação já mencionados. Os produtos isolados podem ser mais específicos com base no tamanho dos poros e maior rendimento¹⁵. No entanto, a força adicional incorrida durante o processo de filtração pode resultar na deformação ou erupção dos EVs¹⁶.

O presente artigo propôs um protocolo de bancada custo-efetivo e tempo-efetivo para isolar sEVs derivadas de CTM para análise a jusante e fins terapêuticos. O método descrito neste artigo combinou um método de filtração simples com centrifugação de bancada para isolar EVs de alto rendimento e boa qualidade de hUC-MSCs para análise a jusante, incluindo análise de tamanho de partículas, ensaio de biomarcadores e imagens por microscopia eletrônica.

Protocolo

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais, equipamentos e software usados neste protocolo.

1. Células-tronco mesenquimais do cordão umbilical humano e cultura

1. Cultivar as CTMs-hUC na densidade de semeadura de 5 × 10³/^cm2 em DMEM, suplementada com 8% de lisado plaquetário humano e 1% de caneta-Strep. Incubar as células a 37 °C em 5% de CO₂. Substitua o meio de cultura celular a cada 3 dias para garantir o crescimento celular adequado.
2. Expandir as células para a passagem 5 em frascos T175 para isolamento de sEV.
   NOTA: Muitos frascos são necessários para colher um alto rendimento de sEVs (o rendimento aumenta com o número de células).

2. Isolamento de pequenas vesículas extracelulares de hUC - CTMs

1. Substituir o meio de cultura por DMEM fresco livre de fenol isento de suplementação com Pen-Strep [meio condicionado (MC)] a 1% quando a cultura atingir 70%-80% de confluência na passagem 5.
   CUIDADO: Use apenas meios basais; evitar FBS e suplemento de lisado de plaquetas humanas para evitar a contaminação por sEVs externos.
2. Após 24 h, centrifugar o CM a 200 × g por 5 min a 4 °C para remover restos celulares. Recolher e filtrar o sobrenadante através de um filtro de 0,22 μm para remover partículas maiores que 220 nm.
3. Encher a unidade filtrante centrífuga com 30 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) filtrada através de um filtro de 0,2 μm. Centrifugar a unidade filtrante centrífuga a 3.500 × g durante 5 min a 4 °C.
4. Encha o CM filtrado na unidade de filtro centrífugo (o volume máximo de cada unidade é de 70 mL). Centrifugar o CM a 3.500 × g a 4 °C.
   NOTA: A duração da centrifugação deve ser monitorizada de tempos a tempos até que a solução tenha atingido a superfície do filtro.
5. Eliminar a solução no copo da solução filtrada. Centrifugar o copo do filtro de amostra com o copo de recolha de concentrado a 1.000 x g a 4 °C durante 2 minutos.
6. Transfira o CM concentrado de volta para a unidade de filtro centrífugo. Adicionar 30 ml de PBS filtrado à unidade filtrante centrífuga e centrifugar a unidade a 3.500 × g a 4 °C.
7. Eliminar a solução no copo da solução filtrada. Instale um copo coletor de concentrado na unidade filtrante e centrífuga reversa a 1.000 × g por 2 min a 4 °C para obter os sEVs purificados.
8. Filtre os sEVs através de um filtro de seringa de 0,22 μm.
9. Transfira as amostras para novos tubos e armazene-as a -80 °C para análise posterior.

3. Caracterização de hUC-MSC-sEVs

1. Análise de rastreamento de nanopartículas
   1. Diluir os hUC-MSC-sEVs isolados em PBS filtrado para 20-100 partículas/quadro.
   2. Introduzir 1 ml da amostra diluída na câmara NTA utilizando seringas descartáveis de 1 ml.
   3. Defina as configurações de medição de acordo: ajuste o nível da câmera para o nível 14, determine o limite de detecção para incluir o maior número possível de partículas com a restrição de que 10-100 cruzes vermelhas são contadas, e a contagem de cruzes azuis é limitada a cinco.
   4. Para cada medição, grave cinco vídeos de 1 min e analise-os usando o Software NanoSight com um limiar de detecção de cinco.
   5. Fazer medições em triplicata para cada amostra.
2. Análise de Western blotting
   1. Lisar os hUC-MSC-sEVs com tampão de lise de ensaio de radioimunoprecipitação gelado (RIPA), incubar por 30 min a 4 °C e centrifugar a 200 × g por 5 min a 4 °C. Colete o sobrenadante.
   2. Quantifique a proteína usando um Kit de Ensaio de Proteína de Ácido Biconínico (BCA). Monte a eletroforese em gel ajustada de acordo e realize a eletroforese em gel a 90 V até que a proteína atinja o final do gel de empilhamento. Mude a tensão para 200 V para separar as proteínas até o final do gel de resolução.
   3. Realizar transferência semi-seca para transferir as proteínas do gel para uma membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF) a 15 V por 1 h.
   4. Bloquear a membrana de PVDF com albumina de soro bovino a 3% (BSA)/solução salina tamponada com Tris-0,1% v/v Tween 20 (TBS-T) por 1 h em um agitador à temperatura ambiente. Incubar a membrana de PVDF com anticorpos primários da seguinte forma: anticorpo monoclonal anti-CD 9 de camundongo (1:500), anticorpo monoclonal anti-CD 81 de camundongo (1:500), anticorpo monoclonal anti-GRP 94 de camundongo anti-TSG 101 de camundongo (1:500) a 4 °C durante a noite com agitação constante.
   5. No dia seguinte, lavar a membrana de PVDF 5 x 5 min com TBS-T e incubar com um anticorpo secundário: proteína ligadora IgG kappa conjugada à horseradish peroxidase de camundongo (m-IgGκ BP-HRP) (1:5.000) por 1 h com agitação à temperatura ambiente.
   6. Novamente, lave a membrana de PVDF com TBS-T cinco vezes e visualize a membrana em um imageador de carga acoplada (CCD) usando um reagente de detecção por quimioluminescência. Analise o nível de expressão das proteínas utilizando o software ImageJ. Primeiro, abra o arquivo de imagem no ImageJ (Arquivo | Aberto...). Melhorar a qualidade da imagem ajustando o brilho e o contraste (Imagem | Ajustar | Brilho/Contraste). Ajuste a imagem até que as manchas estejam claramente visíveis, clique no botão Aplicar e, em seguida, salve as imagens no formato TIFF (Arquivo | Salvar como | TIFF...).
3. Microscópio eletrônico de transmissão
   1. Diluir uma parte da amostra de hUC-MSC-sEVs com quatro partes de PBS filtrado para um volume total de 10 μL e incubar em uma grade de cobre revestida de carbono por 15 min.
   2. Retire o excesso de amostra usando um lenço de laboratório e deixe secar ao ar por 3 min.
   3. Incubar 10 μL de solução de ácido fosfotúngstico (PTA) a 1% para manchar a amostra durante 3 minutos.
   4. Retire o excesso de solução de PTA a 1% com um lenço de laboratório e deixe secar ao ar por 3 min.
   5. Use a amostra para imagens de microscópio eletrônico de transmissão.
      NOTA: Consulte a Figura 1 para obter as etapas resumidas do experimento esquemático.

Resultados

A Figura 2 mostra que hUC-MSC-sEVs têm um modo de tamanho de partícula em 53 nm, enquanto outros picos significativos de tamanho de partícula foram 96 e 115 nm. A concentração de hUC-MSC-sEVs medida por NTA foi de 7,75 × 10¹⁰ partículas/mL. A concentração proteica de hUC-MSC-sEVs medida com o ensaio de BCA foi de aproximadamente 80 μg/mL.

Na análise de western blotting, hUC-MSC-sEVs demonstraram bandas positivas para os marcadores exossômico...

Discussão

Os EVs são um dos subgrupos importantes do secretoma nas CTMs que desempenham um papel crucial durante processos normais e patológicos. No entanto, os sEVs, com uma faixa de tamanho entre 30 e 200 nm, surgiram como uma ferramenta potencial para terapia livre de células na última década. Várias técnicas foram desenvolvidas para isolar sEVs de CTMs. Entretanto, ultracentrifugação diferencial, ultrafiltração, precipitação à base de polímero, captura de imunoafinidade e precipitação baseada em microfluídica...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
40% acrylamide	Nacalai Tesque	06121-95	Western blot
95% ethanol	Nacalai Tesque	14710-25	Disinfectants
Absolute Methanol	Chemiz	45081	To activate PVDF membrane (Western blot)
Accutase	STEMCELL Technologies	7920	Cell dissociation enzyme
ammonium persulfate	Chemiz	14475	catalyse the gel polymerisation (Gel electrophoresis
anti-CD 81 (B-11)	Santa Cruz Biotechnology	sc-166029	Antibody for sEVs marker
anti-TSG 101 (C-2)	Santa Cruz Biotechnology	sc-7964	Antibody for sEVs marker
Bovine serum albumin	Nacalai Tesque	00653-31	PVDF membrane blocking
bromophenol blue	Nacalai Tesque	05808-61	electrophoretic color marker
Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL)	Millipore	UFC710008	sEVs isolation
ChemiLumi One L	Nacalai Tesque	7880	chemiluminescence detection reagent
CryoStor Freezing Media	Sigma-Aldrich	C3124-100ML	Cell cryopreserve
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Nacalai Tesque	08458-45	Cell culture media
ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein Marker	SMOBIO	PM2610	Protein molecular weight markers
Extra thick blotting paper	ATTO		buffer reservior (Western blot)
Glycerol	Merck	G5516	Chemicals for western blot
Glycine	1st Base	BIO-2085-500g	Chemicals for buffer (Western Blot)
horseradish peroxidase-conjugated mouse IgG kappa binding protein (m-IgGκBP-HRP)	Santa Cruz Biotechnology	sc-516102	Secondary antibody (Western Blot)
Human Wharton’s Jelly derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs)	Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Faculty of Medicine, The National University Malaysia
mouse antibodies anti-CD 9 (C-4)	Santa Cruz Biotechnology	sc-13118	Antibody for sEVs marker
Nanosight NS300 equipped with a CMOS camera, a 20 × objective lens, a blue laser module (488 nm), and NTA software v3.2	Malvern Panalytical, UK
paraformaldehyde	Nacalai Tesque	02890-45	Sample Fixation during TEM
penicillin–streptomycin	Nacalai Tesque	26253-84	Antibiotic for media
phenylmethylsulfonyl fluoride	Nacalai Tesque	27327-81	Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer
phosphate-buffered saline	Gibco	10010023	Washing, sample dilution
polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane with 0.45 mm pore size	ATTO		To hold protein during protein transfer (Western blot)
protease inhibitor cocktail	Nacalai Tesque	25955-11	Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer
Protein Assay Bicinchoninate Kit	Nacalai Tesque	06385-00	Protein measurement
sample buffer solution with 2-ME	Nacalai Tesque	30566-22	Reducing agent for western blot
sodium chloride	Nacalai Tesque	15266-64	Chemicals for western blot
sodium dodecyl sulfate	Nacalai Tesque	31606-62	ionic surfactant during gel electrophoresis
Tecnai G2 F20 S-TWIN transmission electron microscope	FEI, USA
tetramethylethylenediamine	Nacalai Tesque	33401-72	chemicals to prepare gel
tris-base	1st Base	BIO-1400-500g	Chemicals for buffer (Western Blot)
Tween 20	GeneTex	GTX30962	Chemicals for western blot
UVP (Ultra Vision Product) CCD imager			CCD imager for western blot signal detection