Küçük Hücre Dışı Vezikülleri İnsan Mezenkimal Kök Hücrelerinden İzole Etmek için Basit Bir Tezgah Üstü Filtrasyon Yöntemi

Özet

Bu protokol, insan göbek kordonu kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin küçük hücre dışı veziküllerinin (hUC-MSC-sEV'ler) basit bir laboratuvar ölçeğinde tezgah üstü ayar ile nasıl izole edileceğini göstermektedir. İzole hUC-MSC-sEV'lerin boyut dağılımı, protein konsantrasyonu, sEVs belirteçleri ve morfolojisi, sırasıyla nanopartikül izleme analizi, BCA protein testi, batı lekesi ve iletim elektron mikroskobu ile karakterize edilir.

Özet

Ultra santrifüjleme bazlı işlem, küçük hücre dışı veziküller (sEV'ler) izolasyonu için yaygın bir yöntem olarak kabul edilir. Bununla birlikte, bu izolasyon yönteminden elde edilen verim nispeten daha düşüktür ve bu yöntemler sEV alt tiplerini ayırmada verimsizdir. Bu çalışma, hUC-MSC'lerin şartlandırılmış ortamından ultrafiltrasyon ile başarıyla ayrılan insan göbek kordonu kaynaklı MSC küçük hücre dışı vezikülleri (hUC-MSC-sEV'ler) izole etmek için basit bir tezgah üstü filtrasyon yöntemini göstermektedir. İzole edilmiş hUC-MSC-sEV'lerin boyut dağılımı, protein konsantrasyonu, ekzozomal belirteçleri (CD9, CD81, TSG101) ve morfolojisi sırasıyla nanopartikül izleme analizi, BCA protein testi, batı lekesi ve iletim elektron mikroskobu ile karakterize edildi. İzole edilmiş hUC-MSC-sEV'lerin boyutu, 7.75 × 10 10 parçacık / mL'lik bir parçacık konsantrasyonu ve 80 μg / mL'lik bir protein konsantrasyonu ile 30-200 nm idi. Ekzozomal belirteçler CD9, CD81 ve TSG101 için pozitif bantlar gözlendi. Bu çalışma, hUC-MSC-sEV'lerin hUC-MSC'lerin şartlandırılmış ortamından başarıyla izole edildiğini ve karakterizasyonun, izole edilen ürünün Hücre Dışı Vezikül Çalışmaları için Minimal Bilgi 2018 (MISEV 2018) tarafından belirtilen kriterleri karşıladığını göstermiştir.

Giriş

MISEV 2018'e göre, sEV'ler, fonksiyonel çekirdeği olmayan, 30-200 nm¹ büyüklüğünde, replikasyon yapmayan lipit çift katmanlı parçacıklardır. MSC türevi sEV'ler, mikroRNA, sitokinler veya proteinler gibi doku rejenerasyonunda önemli rol oynayan önemli sinyal molekülleri içerir. Rejeneratif tıpta ve hücresiz tedavide giderek daha fazla araştırma "sıcak noktası" haline geldiler. Birçok çalışma, MSC kaynaklı sEV'lerin, immünomodülasyon ^2,3,4,5, osteogenezi arttırma ⁶, diabetes mellitus^7,8 veya vasküler rejenerasyon ^9,10 gibi farklı durumların tedavisinde MSC'ler kadar etkili olduğunu göstermiştir. Erken faz denemeleri ilerledikçe, MSC'ler-EV'lerin klinik çevirisi ile ilgili üç ana anahtar konu vurgulanmıştır: EV'lerin verimi, EV'lerin saflığı (hücre kalıntılarından ve protein ve sitokinler gibi diğer biyolojik kirleticilerden arındırılmış) ve izolasyondan sonra EV'lerin fosfolipid çift katmanlı zarının bütünlüğü.

sEV'leri izole etmek için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir, sEV'lerin^11'in yoğunluğundan, şeklinden, boyutundan ve yüzey proteininden yararlanılmıştır. EV izolasyonlarında en yaygın iki yöntem ultrasantrifüjleme tabanlı ve ultrafiltrasyon bazlı tekniklerdir.

Ultra santrifüjleme bazlı yöntemler, sEV'lerin izolasyonunda altın standart yöntemler olarak kabul edilir. Genellikle kullanılan iki tip ultrasantrifüjleme tekniği, diferansiyel ultrasantrifüjleme ve yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjlemedir. Bununla birlikte, ultrasantrifüjleme yöntemleri genellikle düşük verimle sonuçlanır ve yüksek hızlı ultra santrifüj (100.000-200.000 × g) için pahalı ekipman ^gerektirir11. Ayrıca, ultrasantrifüjleme teknikleri tek başına EV alt tiplerinin (sEV'ler ve büyük EV'ler) ayrılmasında verimsizdir ve saf olmayan bir tortu tabakası¹¹ ile sonuçlanır. Son olarak, yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjleme de zaman alıcı olabilir ve hızlanma ve yavaşlama adımları¹² sırasında gradyan hasarını önlemek için sakkaroz tampon ilavesi gibi ek önlem adımları gerektirebilir. Bu nedenle, ultrasantrifüjleme genellikle nispeten düşük bir verime yol açar ve farklı EVs¹³ popülasyonları arasında ayrım yapamaz, bu da büyük ölçekli EV hazırlığı¹¹ için uygulamasını sınırlar.

İkinci EV izolasyon yöntemi, boyut filtrasyonuna dayanan ultrafiltrasyon yoluyladır. Ultrafiltrasyon, pahalı ekipman veya uzun işleme süreleri içermediğinden ultrasantrifüjlemeye kıyasla nispeten zaman ve maliyet etkindir¹⁴. Bu nedenle, ultrafiltrasyon, yukarıda belirtilen her iki ultrasantrifüjleme yönteminden daha etkili bir izolasyon tekniği gibi görünmektedir. İzole edilen ürünler, gözenek boyutlarına ve daha yüksek verime bağlı olarak daha spesifik olabilir¹⁵. Bununla birlikte, filtreleme işlemi sırasında ortaya çıkan ek kuvvet, EV'lerin^16'sının deformasyonuna veya patlamasına neden olabilir.

Mevcut makale, MSC'den türetilmiş sEV'leri aşağı akış analizi ve terapötik amaçlar için izole etmek için maliyet ve zaman açısından etkili bir tezgah üstü protokol önermiştir. Bu makalede açıklanan yöntem, partikül boyutu analizi, biyobelirteç testi ve elektron mikroskobik görüntüleme dahil olmak üzere aşağı akış analizi için yüksek verimli ve kaliteli EV'leri hUC-MSC'lerden izole etmek için basit bir filtreleme yöntemini tezgah üstü santrifüjleme ile birleştirdi.

Protokol

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, ekipmanlar ve yazılımlar hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.

1. İnsan göbek kordonu mezenkimal kök hücreler ve kültür

1. DMEM'de 5 × 10³/^cm2'lik bir tohumlama yoğunluğunda hUC-MSC'leri kültürleyin,% 8 İnsan Trombosit Lizatı ve% 1 Pen-Strep ile desteklenmiştir. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO_2'de inkübe edin. Uygun hücre büyümesini sağlamak için hücre kültürü ortamını her 3 günde bir değiştirin.
2. sEV izolasyonu için hücreleri T175 şişelerinde 5. pasaja genişletin.
   NOT: Yüksek miktarda sEV toplamak için birçok şişeye ihtiyaç vardır (verim, hücre sayısıyla birlikte artar).

2. hUC'den küçük hücre dışı vezikül izolasyonu - MSC'ler

1. Kültür ortamını, 5. pasajda kültür %70-%80 akıcılığa ulaştığında %1 Pen-Strep [Şartlandırılmış ortam (CM)] ile desteklenmiş taze fenol-kırmızı serbest DMEM ile değiştirin.
   DİKKAT: Yalnızca bazal medya kullanın; Harici sEV'lerin kontaminasyonunu önlemek için FBS ve insan trombosit lizat takviyesinden kaçının.
2. 24 saat sonra, hücre kalıntılarını gidermek için CM'yi 200 × g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin. 220 nm'den büyük parçacıkları çıkarmak için süpernatantı 0,22 μm'lik bir filtreden toplayın ve filtreleyin.
3. Santrifüjlü filtre ünitesini, 0,2 μm'lik bir filtreden süzülmüş 30 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile doldurun. Santrifüj filtre ünitesini 3.500 × g'da 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
4. Filtrelenmiş CM'yi santrifüj filtre ünitesine doldurun (her ünitenin maksimum hacmi 70 mL'dir). CM'yi 4 °C'de 3.500 × g'da santrifüjleyin.
   NOT: Santrifüjleme süresi, çözelti filtrenin yüzeyine ulaşana kadar zaman zaman izlenmelidir.
5. Çözeltiyi filtrat çözelti kabına atın. Numune filtre kabını, konsantre toplama kabı ile 4 °C'de 4 °C'de 2 dakika boyunca ters santrifüjleyin.
6. Konsantre CM'yi tekrar santrifüj filtre ünitesine aktarın. Santrifüj filtre ünitesine 30 mL filtrelenmiş PBS ekleyin ve üniteyi 4 °C'de 3.500 × g'da santrifüj edin.
7. Çözeltiyi filtrat çözelti kabına atın. Filtre ünitesine bir konsantre toplama kabı takın ve saflaştırılmış sEV'leri elde etmek için 4 ° C'de 2 dakika boyunca 1.000 × g'da ters santrifüj yapın.
8. sEV'leri 0,22 μm şırınga filtresinden geçirin.
9. Numuneleri yeni tüplere aktarın ve daha fazla analiz için -80 ° C'de saklayın.

3. hUC-MSC-sEV'lerin karakterizasyonu

1. Nanopartikül izleme analizi
   1. Filtrelenmiş PBS'deki izole edilmiş hUC-MSC-sEV'leri 20-100 parçacık/çerçeveye seyreltin.
   2. 1 mL tek kullanımlık şırıngalar kullanarak seyreltilmiş numunenin 1 mL'sini NTA odasına yerleştirin.
   3. Ölçüm ayarlarını buna göre ayarlayın: kamera seviyesini seviye 14'e ayarlayın, 10-100 kırmızı çarpı işaretinin sayılması kısıtlamasıyla mümkün olduğunca çok parçacık içerecek şekilde algılama eşiğini belirleyin ve mavi çarpı sayısı beş ile sınırlıdır.
   4. Her ölçüm için beş adet 1 dakikalık video kaydedin ve bunları beş algılama eşiğine sahip NanoSight Yazılımını kullanarak analiz edin.
   5. Her numune için üçlü olarak ölçümler yapın.
2. Batı lekelenme analizi
   1. hUC-MSC-sEV'leri buz gibi soğuk radyoimmünopresipitasyon testi (RIPA) lizis tamponu ile lize edin, 4 ° C'de 30 dakika inkübe edin ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüj yapın. Supernatan'ı topla.
   2. Bir Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay Kiti kullanarak proteini sayısallaştırın. Jel elektroforez setini buna göre monte edin ve protein istifleme jelinin sonuna ulaşana kadar 90 V'ta jel elektroforezi gerçekleştirin. Çözücü jelin sonuna kadar proteinleri ayırmak için voltajı 200 V olarak değiştirin.
   3. Proteinleri jelden 1 saat boyunca 15 V'ta bir poliviniliden diflorür (PVDF) membranına aktarmak için yarı kuru transfer gerçekleştirin.
   4. PVDF membranını oda sıcaklığında bir çalkalayıcıda 1 saat boyunca %3 sığır serum albümini (BSA)/Tris tamponlu salin-%0,1 v/v Tween 20 (TBS-T) ile bloke edin. PVDF membranını birincil antikorlarla aşağıdaki gibi inkübe edin: fare anti-CD 9 monoklonal antikoru (1:500), fare anti-CD 81 monoklonal antikoru (1:500), fare anti-CTP 94 monoklonal fare anti-TSG 101 monoklonal antikoru (1:500) gece boyunca sürekli sallanarak.
   5. Ertesi gün, PVDF zarını TBS-T ile 5 x 5 dakika yıkayın ve ikincil bir antikor ile daha fazla inkübe edin: yaban turpu peroksidaz konjuge fare IgG kappa bağlayıcı protein (m-IgGκ BP-HRP) (1:5,000) oda sıcaklığında ajitasyonla 1 saat boyunca.
   6. Yine, PVDF membranını TBS-T ile beş kez yıkayın ve membranı bir kemilüminesans algılama reaktifi kullanarak şarj bağlantılı (CCD) bir görüntüleyicide görselleştirin. ImageJ yazılımını kullanarak proteinlerin ekspresyon seviyesini analiz edin. İlk olarak, görüntü dosyasını ImageJ (Dosya | Açık...). Parlaklığı ve kontrastı ayarlayarak görüntünün kalitesini artırın (Resim | Ayarlama | Parlaklık/Kontrast). Lekeler açıkça görünene kadar görüntüyü ayarlayın, Uygula düğmesine tıklayın ve ardından görüntüleri TIFF biçiminde kaydedin (Dosya | Farklı Kaydet | TIFF...).
3. İletim elektron mikroskobu
   1. hUC-MSC-sEVs numunesinin bir kısmını dört parça filtrelenmiş PBS ile toplam 10 μL hacme kadar seyreltin ve karbon kaplı bakır ızgarada 15 dakika boyunca inkübe edin.
   2. Fazla numuneyi bir laboratuvar mendili kullanarak çıkarın ve 3 dakika boyunca hava ile kurumasını bekleyin.
   3. Numuneyi 3 dakika boyamak için 10 μL% 1 fosfotungstik asit (PTA) çözeltisini inkübe edin.
   4. Fazla %1 PTA çözeltisini bir laboratuvar mendili kullanarak çıkarın ve 3 dakika boyunca hava ile kurumasını bekleyin.
   5. İletim elektron mikroskobu görüntülemesi için numuneyi kullanın.
      NOT: Özetlenen şematik deneme adımları için Şekil 1'e bakın.

Sonuçlar

Şekil 2 , hUC-MSC-sEV'lerin 53 nm'de bir parçacık boyutu moduna sahip olduğunu, partikül boyutunun diğer önemli zirvelerinin ise 96 ve 115 nm olduğunu göstermektedir. NTA tarafından ölçülen hUC-MSC-sEV'lerin konsantrasyonu 7.75 ×^{10 10} parçacık / mL idi. BCA testi ile ölçülen hUC-MSC-sEV'lerin protein konsantrasyonu yaklaşık 80 μg / mL idi.

Batı lekeleme analizinde, hUC-MSC-sEV'ler CD9, CD81 ve TSG101 eksozomal belirteçleri için ...

Tartışmalar

EV'ler, normal ve patolojik süreçler sırasında çok önemli bir rol oynayan MSC'lerdeki sekretomun önemli alt kümelerinden biridir. Bununla birlikte, 30 ila 200 nm arasında bir boyut aralığına sahip olan sEV'ler, son on yılda hücresiz tedavi için potansiyel bir araç olarak artmıştır. sEV'leri MSC'lerden izole etmek için çeşitli teknikler geliştirilmiştir. Bununla birlikte, diferansiyel ultrasantrifüjleme, ultrafiltrasyon, polimer bazlı çökeltme, immünoaffinite yakalama ve mikroakışkan bazlı ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
40% acrylamide	Nacalai Tesque	06121-95	Western blot
95% ethanol	Nacalai Tesque	14710-25	Disinfectants
Absolute Methanol	Chemiz	45081	To activate PVDF membrane (Western blot)
Accutase	STEMCELL Technologies	7920	Cell dissociation enzyme
ammonium persulfate	Chemiz	14475	catalyse the gel polymerisation (Gel electrophoresis
anti-CD 81 (B-11)	Santa Cruz Biotechnology	sc-166029	Antibody for sEVs marker
anti-TSG 101 (C-2)	Santa Cruz Biotechnology	sc-7964	Antibody for sEVs marker
Bovine serum albumin	Nacalai Tesque	00653-31	PVDF membrane blocking
bromophenol blue	Nacalai Tesque	05808-61	electrophoretic color marker
Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL)	Millipore	UFC710008	sEVs isolation
ChemiLumi One L	Nacalai Tesque	7880	chemiluminescence detection reagent
CryoStor Freezing Media	Sigma-Aldrich	C3124-100ML	Cell cryopreserve
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Nacalai Tesque	08458-45	Cell culture media
ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein Marker	SMOBIO	PM2610	Protein molecular weight markers
Extra thick blotting paper	ATTO		buffer reservior (Western blot)
Glycerol	Merck	G5516	Chemicals for western blot
Glycine	1st Base	BIO-2085-500g	Chemicals for buffer (Western Blot)
horseradish peroxidase-conjugated mouse IgG kappa binding protein (m-IgGκBP-HRP)	Santa Cruz Biotechnology	sc-516102	Secondary antibody (Western Blot)
Human Wharton’s Jelly derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs)	Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Faculty of Medicine, The National University Malaysia
mouse antibodies anti-CD 9 (C-4)	Santa Cruz Biotechnology	sc-13118	Antibody for sEVs marker
Nanosight NS300 equipped with a CMOS camera, a 20 × objective lens, a blue laser module (488 nm), and NTA software v3.2	Malvern Panalytical, UK
paraformaldehyde	Nacalai Tesque	02890-45	Sample Fixation during TEM
penicillin–streptomycin	Nacalai Tesque	26253-84	Antibiotic for media
phenylmethylsulfonyl fluoride	Nacalai Tesque	27327-81	Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer
phosphate-buffered saline	Gibco	10010023	Washing, sample dilution
polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane with 0.45 mm pore size	ATTO		To hold protein during protein transfer (Western blot)
protease inhibitor cocktail	Nacalai Tesque	25955-11	Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer
Protein Assay Bicinchoninate Kit	Nacalai Tesque	06385-00	Protein measurement
sample buffer solution with 2-ME	Nacalai Tesque	30566-22	Reducing agent for western blot
sodium chloride	Nacalai Tesque	15266-64	Chemicals for western blot
sodium dodecyl sulfate	Nacalai Tesque	31606-62	ionic surfactant during gel electrophoresis
Tecnai G2 F20 S-TWIN transmission electron microscope	FEI, USA
tetramethylethylenediamine	Nacalai Tesque	33401-72	chemicals to prepare gel
tris-base	1st Base	BIO-1400-500g	Chemicals for buffer (Western Blot)
Tween 20	GeneTex	GTX30962	Chemicals for western blot
UVP (Ultra Vision Product) CCD imager			CCD imager for western blot signal detection