Técnica de inyección de embriones para la edición de genes en la garrapata de patas negras, Ixodes scapularis

Resumen

El presente protocolo describe un método para inyectar embriones de garrapata. La inyección de embriones es la técnica preferida para la manipulación genética para generar líneas transgénicas.

Resumen

Las garrapatas pueden transmitir varios patógenos virales, bacterianos y protozoarios y, por lo tanto, se consideran vectores de importancia médica y veterinaria. A pesar de la creciente carga de enfermedades transmitidas por garrapatas, la investigación sobre garrapatas se ha quedado atrás de los vectores de enfermedades de insectos debido a los desafíos en la aplicación de herramientas de transformación genética para estudios funcionales a la biología única de las garrapatas. Las intervenciones genéticas han ido ganando atención para reducir las enfermedades transmitidas por mosquitos. Sin embargo, el desarrollo de tales intervenciones requiere una transformación estable de la línea germinal mediante la inyección de embriones. Tal técnica de inyección de embriones es deficiente para los quelicerados, incluidas las garrapatas. Varios factores, como una capa externa de cera gruesa en embriones de garrapatas, corion duro y alta presión intraovalada, son algunos obstáculos que anteriormente impedían el desarrollo del protocolo de inyección de embriones en garrapatas. El presente trabajo ha superado estos obstáculos, y aquí se describe una técnica de inyección de embriones para la garrapata de patas negras, Ixodes scapularis . Esta técnica se puede utilizar para administrar componentes, como CRISPR / Cas9, para transformaciones estables de la línea germinal.

Introducción

Las garrapatas son vectores de importancia médica y veterinaria, capaces de transmitir una variedad de patógenos virales, bacterianos, protozoarios y nematodos ^1,2. En el este de los Estados Unidos, la garrapata de patas negras, Ixodes scapularis, es un vector importante del patógeno de la enfermedad de Lyme (LD), la espiroqueta Borrelia burgdorferi. Más de 400,000 casos de LD se reportan cada año en los Estados Unidos, lo que la convierte en la principal enfermedad infecciosa transmitida por vectores en los Estados Unidos¹. Además de B. burgdorferi, otros seis microorganismos son transmitidos por I. scapularis, incluidas cuatro bacterias (Anaplasma phagocytophilum, B. mayonii, B. miyamoto y Ehrlichia muris eauclarensis), un parásito protozoario (Babesia microti) y un virus (virus Powassan), lo que hace que esta especie de garrapata sea un importante problema de salud pública³ . Mientras que las enfermedades transmitidas por garrapatas se han vuelto más prevalentes en los últimos años, la investigación sobre garrapatas se ha quedado atrás de otros artrópodos vectores, como los mosquitos, debido a la biología única de las garrapatas y los desafíos asociados con la aplicación de herramientas genómicas genéticas y funcionales ^4,5.

Las técnicas de edición de genes, particularmente CRISPR / Cas9, ahora han hecho factibles los estudios de genómica funcional en organismos no modelo. Para crear mutaciones hereditarias en un organismo, la inyección de embriones sigue siendo el método preferido para entregar constructos para alterar la línea germinal 6,7,8,9. Sin embargo, hasta hace poco⁴, los huevos de garrapatas se consideraban demasiado difíciles o incluso imposibles de inyectar sin matar el embrión^10,11. Una gruesa capa de cera en los huevos, corion duro y alta presión intraovalada fueron algunos de los principales obstáculos que impidieron la inyección de embriones en garrapatas. I. scapularis adulto, alimentado con sangre, deposita una sola nidada de hasta 2.000 huevos¹² durante 3-4 semanas (aproximadamente 100 huevos/día). Los huevos se ponen individualmente, y cada huevo está cubierto con cera que es secretada por protuberancias o "cuernos" del órgano glandular de Gené^13,14,15 de la madre. Esta cera protege los huevos de la desecación y contiene compuestos antimicrobianos¹⁵. Para inyectar con éxito los huevos de garrapata, es importante quitar la capa de cera, ablandar el corion y desecar los huevos para disminuir la presión intraovalada para que la inyección no dañe irreversiblemente el huevo. Entendiendo la importancia crítica de las inyecciones de embriones para una transformación exitosa de la línea germinal, se desarrolla un protocolo para I. scapularis, que se puede utilizar para administrar una construcción CRISPR / Cas9 y generar mutaciones estables de la línea germinal⁴. Además de su contribución a la investigación de I. scapularis, este protocolo también podría optimizarse para otras especies de garrapatas.

Protocolo

Los adultos de Ixodes scapularis fueron comprados en la Universidad Estatal de Oklahoma (OSU) o criados en la Universidad de Nevada, Reno (UNR) (protocolo IACUC # 21-001-1118).

1. Preparación de garrapatas hembras para la recolección de embriones

NOTA: Para recolectar huevos de edad apropiada, es importante sincronizar la puesta de huevos. Aunque las señales de puesta de huevos en las garrapatas siguen sin estar claras, bajo las condiciones insectarias estándar (temperatura de 27 ° C y >90% de humedad relativa (HR)), las hembras de I. scapularis comienzan a poner huevos aproximadamente 8 días después del desprendimiento del huésped. Esta línea de tiempo se puede alargar almacenando hembras repletas a 4 ° C. Hemos almacenado hembras alimentadas con sangre a 4 °C hasta 8 semanas sin ningún efecto negativo en la puesta de huevos. Es posible que sea necesario modificar estas condiciones para cada insectario.

1. Almacene todas las hembras repletas a 4 °C con >90% HR en una caja de plástico de 6 cuartos forrada con papel de filtro húmedo hasta que se use para microinyecciones.
2. Una semana antes de las inyecciones, transfiera las hembras de 4 °C a una incubadora a 27 °C para el inicio de la puesta de huevos.
3. Cuando las hembras comiencen a poner huevos (3-4 días después de moverlos a 27 °C), retire los huevos con un pincel de punta fina y prepare a las hembras para la ablación de órganos (glándula de cera) de Gené.
   NOTA: El órgano de Gené se extiende desde el área entre el escuto y el capítulo (base dorsal de las piezas bucales), las piezas bucales se doblan sobre la superficie ventral del cuerpo (paralelas a la superficie) y el órgano extendido del gen recubre los huevos tan pronto como se ponen los huevos (Figura 1). Los huevos puestos antes de la extracción de órganos del Gené o el vaciado de cera tendrán un recubrimiento de cera y no son adecuados para inyecciones y deben desecharse.
4. Para extraer o vaciar el órgano del Gené, use arcilla para colocar a la hembra hinchada en un portaobjetos de vidrio bajo un microscopio orientado de modo que las piezas bucales sean visibles tanto en el lado ventral como en el dorsal (Figura 1B, C).
   1. Empuje cuidadosamente el área exactamente entre el escuto y las piezas bucales usando pinzas finas y agujas de tungsteno hechas en el laboratorio con alambre de tungsteno siguiendo un protocolo¹⁶ previamente publicado (las agujas también se pueden comprar comercialmente y adjuntar a una sonda de micro disección, consulte la Tabla de materiales).
   2. Trabajando el camino hacia adentro con la aguja de tungsteno, tire de la glándula de cera hacia afuera (Figura 1D, E). Puede tomar varios minutos para extirpar la glándula. Limpie cualquier secreción de cera líquida con toallitas de laboratorio.
      NOTA: La glándula también se puede extirpar del lado ventral justo debajo de las piezas bucales; Alcanzando la espalda hacia Scutum con una aguja y fórceps. La aplicación de pegamento de silicona alrededor de las piezas bucales también bloquea la eversión de órganos de Gene y se puede usar en lugar de eliminar o vaciar la cera (comunicación personal con el Dr. Ladislav Simo, INRAE, Francia). Las garrapatas hinchadas no permanecerán en la cinta de doble cara. Usar arcilla para "envolver" la garrapata ayuda a mantenerla en su lugar durante la manipulación. Use fórceps para sostener la garrapata y la aguja de tungsteno para la disección. La parte ventral es más fácil de perforar con una aguja y preferida por los autores.
5. Para vaciar la glándula, coloque la garrapata grávida como se menciona en el paso 1.4. Perfore cuidadosamente el área detrás de las piezas bucales en el lado dorsal y aplique presión en el lado ventral con fórceps.
   NOTA: Alternativamente, no es necesario extirpar la glándula de cera; Vaciar la glándula de cera durará varios días. Las hembras ponedoras de huevos tienen un área blanca alrededor de las partes de la boca que indica la ubicación de la glándula de cera y se puede usar como referencia.
   1. Coloque el borde de una toallita de laboratorio sin pelusa y retire la cera líquida que sale del sitio de punción. Asegúrese de evitar la secreción de hemolinfa, que es un líquido transparente en comparación con la cera viscosa ligeramente amarillenta. Puede tomar de 5 a 10 minutos hasta que se elimine la mayor parte de la cera.
6. Después de la manipulación, coloque a las hembras en una incubadora a 27 ° C (>90% HR) y déjelas recuperarse durante 1-2 días.
   NOTA: Las hembras tratadas generalmente tardan 1-2 días en recuperarse y comenzar a poner huevos nuevamente.
7. Cuando las hembras comiencen a poner huevos nuevamente, use un pincel fino para recolectar los huevos recién depositados (0-18 h después de la puesta de huevos) y colóquelos en un tubo de microcentrífuga de 1.5 ml.
   NOTA: Si se usan huevos de la misma hembra a lo largo del tiempo, este procedimiento debe repetirse después de 4-5 días de puesta de huevos si no se extirparon las glándulas.

2. Tratamiento embrionario para microinyecciones

1. Agregue ~ 200 μL (o volumen suficiente para cubrir los huevos, dependiendo del número de huevos) de cloruro de benzalconio al 5% (peso / volumen) / agua (consulte la Tabla de materiales) en el tubo que contiene huevos de 0 a 18 h de edad. Agite suavemente los huevos con el pincel durante 5 minutos para evitar que los huevos se depositen en el fondo del tubo (para más detalles, consulte Sharma et ^al.4). Retire el sobrenadante con una micropipeta, dejando los huevos en tubo.
   PRECAUCIÓN: El cloruro de benzalconio es corrosivo para la piel y los ojos, use guantes y protección para los ojos.
2. Agregue ~ 200 μL de agua destilada (DI) al tubo que contiene huevos, agite con un pincel y retire el agua del tubo de microcentrífuga con una micropipeta. Repita el lavado con agua DI una vez más.
3. Después de lavar con agua DI, agregue ~ 200 μL de cloruro de sodio (NaCl) al 5% (p/v) y agite suavemente con un pincel durante 5 minutos. Retire la solución del tubo después de 5 minutos y lave los huevos dos veces con agua DI.
4. Añadir ~100 μL de solución de NaCl al 1% (p/v) en el tubo de microcentrífuga que contiene los huevos. Mantenga los huevos en solución de NaCl al 1% (p/v) hasta que se usen para inyecciones.
5. Comience las microinyecciones después de aproximadamente una hora. Esta línea de tiempo ayuda en la desecación adecuada de los huevos y evita que estallen.
   NOTA: Los huevos se pueden mantener en solución de NaCl al 1% (p/v) durante 7-8 h sin afectar significativamente la supervivencia. Si los óvulos son difíciles de inyectar o reventar, entonces los huevos no se desecan lo suficiente y pueden tratarse con NaCl al 5% (p/v) durante 5 minutos adicionales.

3. Preparación de agujas de inyección

1. Inserte un vidrio capilar de aluminosilicato (con filamento, consulte la Tabla de materiales) en el extractor de agujas siguiendo las instrucciones del fabricante.
2. Ajuste el extractor de agujas a los siguientes ajustes: calor: 575, tracción: 20, velocidad: 50, tiempo: 200 y presión: 700.
3. Active la función de tracción del extractor de agujas y repita el proceso para agujas adicionales.
4. Guarde las agujas tiradas clavándolas en líneas de arcilla de modelador en una placa de Petri limpia.
5. Cargue la aguja con la mezcla de inyección utilizando una punta de microcargador (consulte la Tabla de materiales).
   NOTA: La comparación de las agujas utilizadas para la inyección de embriones de garrapatas y mosquitos se muestra en la Figura 2.

4. Configuración de diapositivas para las microinyecciones

1. Usando cinta adhesiva de doble cara, adhiera dos portaobjetos de microscopio de vidrio juntos, dejando un espacio de aproximadamente 0,5 cm para apoyar la alineación de los huevos y evitar que se volteen durante las inyecciones (Figura 3A).
2. Aplique un trozo de apósito de película transparente (consulte la Tabla de materiales) sobre la cinta de doble cara en el espacio entre las diapositivas. Asegúrese de alinear el aderezo de la película perfectamente con el espacio.

5. Microinyecciones embrionarias

1. Alinee 8-10 huevos a la vez en la configuración de la diapositiva (arriba) con un pincel de un solo pelo.
   NOTA: Los huevos alineados con el eje más largo perpendicular (Figura 3B) al borde deslizante son más fáciles de inyectar que los huevos cuyo eje longitudinal está alineado paralelo al borde (Figura 3C). Los huevos en la orientación perpendicular (Figura 3B) pueden soportar mejor la inyección, lo que resulta en una mayor supervivencia.
2. Coloque el portaobjetos con huevos alineados en el escenario de un microscopio compuesto. Use un trozo de toallita sin pelusa para eliminar la solución de NaCl al 1% en la que se almacenan.
3. Conecte la aguja de inyección llena a un microinyector conectado a un micromanipulador (consulte la Tabla de materiales).
4. Abra la aguja frotándola suavemente contra la superficie del huevo utilizando un ajuste de alta presión en el microinyector (>5,000 hPa).
5. Después de abrir la aguja, reduzca la presión (1,000-2,500 hPa) del microinyector dependiendo de la abertura de la aguja.
   NOTA: Una abertura pequeña requerirá una presión comparativamente más alta, mientras que una abertura más grande requerirá una presión más baja. Esto es para controlar el volumen de la construcción inyectada. Dependiendo del tamaño de la abertura de la aguja, el volumen de inyección variará de 1 a 5 pL.
6. Inyecte todos los huevos en el portaobjetos en un ángulo de 10°-15° lo más rápido posible e inmediatamente mueva el portaobjetos a condiciones de alta humedad en una placa de Petri forrada con papel húmedo. Tan pronto como se inyectan los huevos, comienzan a desecarse.
   NOTA: La inyección de una pequeña cantidad de óvulos a la vez aumenta el éxito de la inyección y la probabilidad de supervivencia. Las agujas se obstruyen por el reflujo embrionario. Si la punta aún está afilada, para despejar las agujas obstruidas, mueva la aguja en una pequeña gota de NaCl al 1% agregada al borde del portaobjetos. La acción capilar desalojará la pequeña obstrucción. Si la aguja ya está roma, cámbiela.

6. Cuidados post-inyección de embriones

1. Coloque el portaobjetos que contiene embriones inyectados en una placa de Petri grande forrada con papel de filtro húmedo.
   NOTA: Es fundamental no molestar los huevos durante al menos 5-6 h. Esto permite que la herida de inyección se selle correctamente. La herida de la inyección puede abrirse cuando se agita, y el citoplasma puede comenzar a supurar, lo que resulta en la mortalidad del huevo.
2. Después de 5-6 h, agregue una pequeña gota de agua DI al apósito de película transparente con embriones inyectados adjuntos. Con un pincel, desplaza suavemente los huevos. Transfiera los huevos a una pequeña placa de Petri (10 cm) y sumérjalos en agua DI.
   NOTA: El apósito de película permite una fácil extracción de los huevos después de las inyecciones. En el momento en que se agrega una gota de agua al aderezo de la película, los huevos comenzarán a moverse junto con el agua.
3. Mantenga los huevos sumergidos en agua y coloque la placa de Petri en una caja de plástico de 6 cuartos en una incubadora a 27 °C y >90% HR.
4. Revise los huevos regularmente, diariamente durante los primeros días, y luego cada 3-4 días hasta que las larvas comiencen a eclosionar.
   NOTA: Si se daña una gran cantidad de huevos durante las microinyecciones, drenar suavemente el agua DI después de una semana evitará el crecimiento de hongos en los huevos muertos.
5. Cuando las larvas comiencen a eclosionar de los embriones inyectados (21-25 días después de la inyección para la configuración actual del laboratorio), verifíquelos diariamente y transfiera las larvas eclosionadas a viales de vidrio con una pantalla en la parte superior. Las larvas pueden eclosionar bajo el agua y sobrevivir durante ~ 1-2 semanas.
6. Examinar las larvas⁴ si los huevos fueron inyectados con una construcción que puede resultar en un fenotipo visible.

Resultados

En este artículo se describe un protocolo exitoso de inyección de embriones para I. scapularis. Las hembras ponedoras de huevos se mantuvieron a alta humedad para evitar la desecación de los huevos parcialmente encerados. La capa de cera se eliminó para inyectar embriones de garrapatas mediante la ablación del órgano del gen (glándula de cera) de la hembra grávida (Figura 1A-E). Se utilizaron agujas de vidrio de aluminosilicato con un cuello...

Discusión

Este es el primer protocolo desarrollado para inyectar embriones tempranos de garrapatas con éxito. Se ha logrado una tasa de supervivencia de ~4%-8%, que es comparable a la inyección de embriones en otros modelos de insectos bien establecidos⁵.

Como este es el protocolo inicial, se anticipa que este protocolo se perfeccionará y especializará aún más para las especies individuales de garrapatas. En particular, el momento de la inyección variará de una especie a ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum silicate capillaries, with filament	Sutter instruments	AF100-64-10	Embryo injection
Benzalkonium chloride 50% in water, 25 g	TCI-America	B0414	Embryo treatment, 25 g is approximately 25 mL
Filter paper	Whatman	1001-090	Post-injection care
Forceps	Thomas Scientific	300-101	Gene`s organ manipulation
Lab Wipes	Genesee Scientific	88-115
Microloader tips	Eppendorf	930001007	Loading the pulled needles
Micromanipulator	Sutter instruments	ROE-200	Embryo injection
Microscopic slides- plain, ground edges	Genesee Scientific	29-100	Embryo alignment, ground edges are preferred, beveled edges could obscure the eggs from view
NaCl	Research Products International	S23020-500.0	Embryo treatment
Needle Puller	Sutter Instruments	P-1000
Permanent Double sided tape	Scotch	34-8716-3417-5	Embryo alignment
Petri plates	Genesee Scientific	32-107G	Post-injection care
Tegaderm/ Transparent film dressing	3M Healthcare	1628	Embryo alignment
Tungsten needles	Fine Science Tools	10130-10	Gene`s organ manipulation
Tungsten Wire	Amazon	B08DNT7ZK3	Gene`s organ manipulation
XenoWorks Digital Microinjector	Sutter instruments	MPC-200	Embryo injection