Embryo-Injektionstechnik zur Gen-Editierung bei der Schwarzbeinigen Zecke (Ixodes scapularis)

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Injektion von Zeckenembryonen. Die Embryoinjektion ist die bevorzugte Technik zur genetischen Manipulation, um transgene Linien zu erzeugen.

Zusammenfassung

Zecken können verschiedene virale, bakterielle und Protozoen-Erreger übertragen und gelten daher als Vektoren von medizinischer und veterinärmedizinischer Bedeutung. Trotz der wachsenden Belastung durch durch Zecken übertragene Krankheiten ist die Forschung an Zecken aufgrund von Herausforderungen bei der Anwendung genetischer Transformationswerkzeuge für funktionelle Studien auf die einzigartige Biologie von Zecken hinter Insektenkrankheitsvektoren zurückgeblieben. Genetische Interventionen haben Aufmerksamkeit erregt, um durch Moskitos übertragene Krankheiten zu reduzieren. Die Entwicklung solcher Interventionen erfordert jedoch eine stabile Keimbahntransformation durch Injektion von Embryonen. Eine solche Embryo-Injektionstechnik fehlt für Chelicerate, einschließlich Zecken. Mehrere Faktoren, wie eine äußere dicke Wachsschicht auf Zeckenembryonen, hartes Chorion und hoher intraovaler Druck, sind einige Hindernisse, die zuvor die Entwicklung des Embryoinjektionsprotokolls bei Zecken verhindert haben. Die vorliegende Arbeit hat diese Hindernisse überwunden, und eine Embryo-Injektionstechnik für die schwarzbeinige Zecke, Ixodes scapularis, wird hier beschrieben. Diese Technik kann verwendet werden, um Komponenten wie CRISPR / Cas9 für stabile Keimbahntransformationen zu liefern.

Einleitung

Zecken sind Vektoren von medizinischer und veterinärmedizinischer Bedeutung, die in der Lage sind, eine Vielzahl von viralen, bakteriellen, Protozoenpathogenen und Nematoden zu übertragen ^1,2. Im Osten der USA ist die schwarzbeinige Zecke Ixodes scapularis ein wichtiger Überträger des Erregers der Lyme-Borreliose (LD), der Spirochäte Borrelia burgdorferi. Über 400.000 Fälle von LD werden jedes Jahr in den Vereinigten Staaten gemeldet, was sie zur führenden vektorübertragenen Infektionskrankheit in den USA macht¹. Neben B. burgdorferi werden sechs weitere Mikroorganismen durch I. scapularis übertragen, darunter vier Bakterien (Anaplasma phagocytophilum, B. mayonii, B. miyamotoi und Ehrlichia muris eauclarensis), ein Protozoenparasit (Babesia microti) und ein Virus (Powassan-Virus), was diese Zeckenart zu einem großen Problem für die öffentliche Gesundheit macht³ . Während durch Zecken übertragene Krankheiten in den letzten Jahren häufiger geworden sind, ist die Forschung an Zecken aufgrund der einzigartigen Biologie der Zecken und der Herausforderungen im Zusammenhang mit der Anwendung genetischer und funktioneller genomischer Werkzeuge hinter andere Arthropodenvektoren wie Moskitos zurückgefallen ^4,5.

Gen-Editing-Techniken, insbesondere CRISPR/Cas9, haben nun funktionelle Genomstudien an Nicht-Modellorganismen möglich gemacht. Um vererbbare Mutationen in einem Organismus zu erzeugen, bleibt die Embryoinjektion die bevorzugte Methode, um Konstrukte zur Veränderung der Keimbahn 6,7,8,9 zu liefern. Bis vor kurzem⁴ galten Zeckeneier jedoch als zu schwierig oder sogar unmöglich, sie zu injizieren, ohne den Embryo zu töten^10,11. Eine dicke Wachsschicht auf Eiern, hartes Chorion und hoher intraovaler Druck waren einige der Haupthindernisse, die die Embryoinjektion in Zecken verhinderten. Erwachsene, blutgefütterte I. scapularis legen ein einzelnes Gelege von bis zu 2.000 Eiern¹² über 3-4 Wochen ab (ca. 100 Eier / Tag). Die Eier werden einzeln gelegt, und jedes Ei ist mit Wachs überzogen, das durch Vorsprünge oder "Hörner" des Drüsenorgans^{Gené 13,14,15} der Mutter abgesondert wird. Dieses Wachs schützt die Eier vor Austrocknung und enthält antimikrobielle Verbindungen¹⁵. Um Zeckeneier erfolgreich zu injizieren, ist es wichtig, die Wachsschicht zu entfernen, das Chorion zu erweichen und die Eier auszutrocknen, um den intraovalen Druck zu verringern, damit die Injektion das Ei nicht irreversibel beschädigt. Um die entscheidende Bedeutung von Embryoinjektionen für eine erfolgreiche Keimbahntransformation zu verstehen, wird ein Protokoll für I. scapularis entwickelt, das verwendet werden kann, um ein CRISPR/Cas9-Konstrukt zu liefern und stabile Keimbahnmutationen zu erzeugen⁴. Neben seinem Beitrag zur I. scapularis-Forschung könnte dieses Protokoll auch für andere Zeckenarten optimiert werden.

Protokoll

Ixodes scapularis Erwachsene wurden entweder von der Oklahoma State University (OSU) gekauft oder an der University of Nevada, Reno (UNR) aufgezogen (IACUC-Protokoll #21-001-1118).

1. Vorbereitung weiblicher Zecken für die Embryonenentnahme

HINWEIS: Um Eier in angemessenem Alter zu sammeln, ist es wichtig, die Eiablage zu synchronisieren. Obwohl die Hinweise auf die Eiablage bei Zecken unklar bleiben, beginnen I. scapularis-Weibchen unter den Standard-Insektenbedingungen (27 ° C Temperatur und >90% relative Luftfeuchtigkeit (RH)) etwa 8 Tage nach der Ablösung des Wirts mit der Eiablösung. Diese Zeitspanne kann verlängert werden, indem gefüllte Weibchen bei 4 °C gelagert werden. Wir haben blutgefütterte Weibchen bei 4 °C bis zu 8 Wochen gelagert, ohne negative Auswirkungen auf die Eiablage. Diese Bedingungen müssen möglicherweise für jedes Insektarium geändert werden.

1. Lagern Sie alle gefüllten Weibchen bei 4 °C mit >90% rF in einer 6-Quart-Kunststoffbox, die mit feuchtem Filterpapier ausgelegt ist, bis sie für Mikroinjektionen verwendet werden.
2. Eine Woche vor der Injektion die Weibchen von 4 °C in einen 27 °C Inkubator überführen, um die Eiablage einzuleiten.
3. Wenn die Weibchen mit der Eiablage beginnen (3-4 Tage nach dem Umsetzen auf 27 °C), entfernen Sie alle Eier mit einem feinspitzen Pinsel und bereiten Sie die Weibchen auf die Ablation des Gené-Organs (Wachsdrüse) vor.
   HINWEIS: Das Gené-Organ erstreckt sich vom Bereich zwischen Scutum und Capitulum (dorsale Basis der Mundwerkzeuge), Mundwerkzeuge biegen sich über die ventrale Körperoberfläche (parallel zur Oberfläche) und das verlängerte Gen-Organ bedeckt Eier, sobald die Eier gelegt werden (Abbildung 1). Eier, die vor der Organentnahme oder Wachsentleerung des Genés gelegt werden, haben eine Wachsbeschichtung und sind nicht für Injektionen geeignet und müssen verworfen werden.
4. Um das Gené-Organ entweder zu entfernen oder zu entleeren, verwenden Sie Ton, um das verstopfte Weibchen auf einem Glasobjektträger unter einem Mikroskop zu positionieren, das so ausgerichtet ist, dass Mundwerkzeuge sowohl auf der ventralen als auch auf der dorsalen Seite sichtbar sind (Abbildung 1B, C).
   1. Stechen Sie vorsichtig genau in den Bereich zwischen Scutum und Mundwerkzeugen mit feinen Pinzetten und Wolframnadeln, die im Labor mit Wolframdraht nach einem zuvor veröffentlichten Protokoll¹⁶ hergestellt wurden (Nadeln können auch kommerziell erworben und an einer Mikroseziersonde befestigt werden, siehe Materialtabelle).
   2. Arbeiten Sie den Weg nach innen mit der Wolframnadel und ziehen Sie die Wachsdrüse heraus (Abbildung 1D, E). Es kann einige Minuten dauern, bis die Drüse entfernt ist. Wischen Sie flüssiges Wachsekret mit Labortüchern ab.
      HINWEIS: Die Drüse kann auch von der ventralen Seite direkt unter den Mundwerkzeugen entfernt werden; indem man mit Nadel und Pinzette nach hinten in Richtung Scutum greift. Das Auftragen von Silikonkleber um die Mundwerkzeuge blockiert auch die Organeversion von Gene und kann anstelle des Entfernens oder Entleerens des Wachses verwendet werden (persönliche Kommunikation mit Dr. Ladislav Simo, INRAE, Frankreich). Verstopfte Zecken bleiben nicht auf doppelseitigem Klebeband. Die Verwendung von Ton zum "Wickeln" der Zecke hilft, sie während der Manipulation an Ort und Stelle zu halten. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Zecke und die Wolframnadel zur Dissektion zu halten. Der ventrale Teil ist leichter mit einer Nadel zu durchstechen und wird von den Autoren bevorzugt.
5. Um die Drüse zu entleeren, ordnen Sie die gravidische Zecke wie in Schritt 1.4 beschrieben an. Durchstechen Sie vorsichtig den Bereich hinter den Mundwerkzeugen auf der dorsalen Seite und üben Sie Druck auf die ventrale Seite mit einer Pinzette aus.
   HINWEIS: Alternativ ist es nicht notwendig, die Wachsdrüse zu entfernen; Das Entleeren der Wachsdrüse dauert mehrere Tage. Eiablegende Weibchen haben einen weißen Bereich um die Mundteile, der die Lage der Wachsdrüse anzeigt und als Referenz verwendet werden kann.
   1. Legen Sie den Rand eines fusselfreien Labortuchs und entfernen Sie das flüssige Wachs, das aus der Einstichstelle kommt. Achten Sie darauf, Hämolymphsekretion zu vermeiden, die im Vergleich zu leicht gelblichem viskosem Wachs eine klare Flüssigkeit ist. Es kann 5-10 Minuten dauern, bis der größte Teil des Wachses entfernt ist.
6. Nach der Manipulation die Weibchen bei 27 °C (>90% rF) in einen Inkubator legen und 1-2 Tage erholen lassen.
   HINWEIS: Behandelte Weibchen brauchen normalerweise 1-2 Tage, um sich zu erholen und wieder Eier zu legen.
7. Wenn die Weibchen wieder Eier legen, sammeln Sie mit einem feinen Pinsel frisch abgelegte Eier (0-18 h nach der Eiablage) und legen Sie sie in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
   HINWEIS: Wenn im Laufe der Zeit Eier desselben Weibchens verwendet werden, muss dieser Vorgang nach 4-5 Tagen der Eiablage wiederholt werden, wenn die Drüsen nicht entfernt wurden.

2. Behandlung von Embryonen für Mikroinjektionen

1. Fügen Sie ~200 μL (oder ausreichend Volumen, um die Eier zu bedecken, abhängig von der Anzahl der Eier) von 5% (Gewicht/Volumen) Benzalkoniumchlorid/Wasser (siehe Materialtabelle) in das Röhrchen mit 0-18 h alten Eiern hinzu. Schwenken Sie die Eier vorsichtig mit dem Pinsel für 5 Minuten, um zu vermeiden, dass sich die Eier im Boden der Röhre absetzen (für Details siehe Sharma et ^al.4). Entfernen Sie den Überstand mit einer Mikropipette und lassen Sie die Eier im Röhrchen zurück.
   ACHTUNG: Benzalkoniumchlorid ist ätzend für Haut und Augen, tragen Sie Handschuhe und Augenschutz.
2. Fügen Sie ~ 200 μL destilliertes (DI) Wasser in das Röhrchen mit Eiern hinzu, schwenken Sie es mit einem Pinsel und entfernen Sie das Wasser aus dem Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Mikropipette. Wiederholen Sie das Waschen mit DI-Wasser noch einmal.
3. Nach dem Waschen mit DI-Wasser ~200 μL 5% (w/v) Natriumchlorid (NaCl) hinzufügen und 5 min vorsichtig mit einem Pinsel schwenken. Entfernen Sie die Lösung nach 5 min aus dem Röhrchen und waschen Sie die Eier zweimal mit DI-Wasser.
4. Fügen Sie ~100 μL 1% (w/v) NaCl-Lösung in das Mikrozentrifugenröhrchen mit Eiern hinzu. Bewahren Sie die Eier in 1% (w / v) NaCl-Lösung auf, bis sie für Injektionen verwendet werden.
5. Starten Sie die Mikroinjektionen nach etwa einer Stunde. Diese Zeitleiste hilft bei der richtigen Austrocknung der Eier und verhindert, dass sie platzen.
   HINWEIS: Eier können in 1% (w/v) NaCl-Lösung für 7-8 h aufbewahrt werden, ohne das Überleben signifikant zu beeinträchtigen. Wenn die Eier schwer zu injizieren oder zu platzen sind, werden die Eier nicht ausreichend getrocknet und können für weitere 5 Minuten mit 5% (w/v) NaCl weiter behandelt werden.

3. Herstellung von Injektionsnadeln

1. Führen Sie ein Aluminosilikat-Kapillarglas (mit Filament, siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers in den Nadelzieher ein.
2. Stellen Sie den Nadelzieher auf die folgenden Einstellungen ein: Hitze: 575, Zug: 20, Geschwindigkeit: 50, Zeit: 200 und Druck: 700.
3. Aktivieren Sie die Zugfunktion des Nadelziehers und wiederholen Sie den Vorgang für weitere Nadeln.
4. Lagern Sie die gezogenen Nadeln, indem Sie sie in Linien aus Modelliererton in einer sauberen Petrischale stecken.
5. Belasten Sie die Nadel mit der Injektionsmischung mit einer Mikroladerspitze (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Der Vergleich der Nadeln, die für die Injektion von Zecken- und Mückenembryonen verwendet werden, ist in Abbildung 2 dargestellt.

4. Objektträgeraufbau für die Mikroinjektionen

1. Kleben Sie zwei Glasobjektträger mit doppelseitigem Klebeband zusammen, wobei ein Abstand von etwa 0,5 cm verbleibt, um das Ausrichten der Eier zu stützen und zu verhindern, dass sie während der Injektionen umkippen (Abbildung 3A).
2. Tragen Sie ein Stück transparenten Filmverband (siehe Materialtabelle) auf das doppelseitige Klebeband im Spalt zwischen den Objektträgern auf. Stellen Sie sicher, dass der Filmverband perfekt auf den Spalt ausgerichtet ist.

5. Mikroinjektionen von Embryonen

1. Richten Sie 8-10 Eier gleichzeitig auf der Folie (oben) mit einem einhaarigen Pinsel aus.
   HINWEIS: Eier, die mit der längeren Achse senkrecht (Abbildung 3B) zum Objektträgerrand ausgerichtet sind, lassen sich leichter injizieren als Eier, deren Längsachse parallel zum Rand ausgerichtet ist (Abbildung 3C). Eier in senkrechter Ausrichtung (Abbildung 3B) können der Injektion besser standhalten, was zu einem höheren Überleben führt.
2. Legen Sie den Objektträger mit ausgerichteten Eiern auf den Tisch eines zusammengesetzten Mikroskops. Verwenden Sie ein Stück fusselfreies Tuch, um die 1% ige NaCl-Lösung zu entfernen, in der sie gelagert sind.
3. Befestigen Sie die gefüllte Injektionsnadel an einem Mikroinjektor, der mit einem Mikromanipulator verbunden ist (siehe Materialtabelle).
4. Öffnen Sie die Nadel, indem Sie sie mit einer Hochdruckeinstellung am Mikroinjektor (>5.000 hPa) vorsichtig gegen die Eioberfläche reiben.
5. Nachdem die Nadel geöffnet wurde, reduzieren Sie den Druck (1.000-2.500 hPa) des Mikroinjektors in Abhängigkeit von der Öffnung der Nadel.
   HINWEIS: Eine kleine Öffnung erfordert einen vergleichsweise höheren Druck, während eine größere Öffnung einen niedrigeren Druck erfordert. Dies dient dazu, das Volumen des injizierten Konstrukts zu steuern. Abhängig von der Größe der Nadelöffnung variiert das Injektionsvolumen von 1-5 pL.
6. Injizieren Sie alle Eier auf dem Objektträger so schnell wie möglich in einem Winkel von 10°-15° und bewegen Sie den Objektträger sofort in einer mit feuchtem Papier ausgekleideten Petrischale auf hohe Feuchtigkeitsbedingungen. Sobald die Eier injiziert werden, beginnen sie auszutrocknen.
   HINWEIS: Die gleichzeitige Injektion einer kleinen Anzahl von Eizellen erhöht den Injektionserfolg und die Überlebenswahrscheinlichkeit. Nadeln werden durch Embryo-Reflux verstopft. Wenn die Spitze immer noch scharf ist, um verstopfte Nadeln zu entfernen, bewegen Sie die Nadel in einen kleinen Tropfen mit 1% NaCl, der am Rand des Objektträgers hinzugefügt wird. Die Kapillarwirkung löst die kleine Verstopfung. Wenn die Nadel bereits stumpf ist, wechseln Sie sie.

6. Pflege von Embryonen nach der Injektion

1. Legen Sie den Objektträger mit den injizierten Embryonen in eine große Petrischale, die mit feuchtem Filterpapier ausgekleidet ist.
   HINWEIS: Es ist wichtig, die Eier für mindestens 5-6 h nicht zu stören. Dadurch kann die Injektionswunde richtig abdichten. Die Injektionswunde kann sich öffnen, wenn sie aufgeregt wird, und Zytoplasma kann austreten, was zu Eiersterblichkeit führt.
2. Nach 5-6 h einen kleinen Tropfen DI-Wasser in den transparenten Filmverband mit injizierten Embryonen geben. Verschieben Sie die Eier vorsichtig mit einem Pinsel. Die Eier in eine kleine Petrischale (10 cm) geben und in DI-Wasser tauchen.
   HINWEIS: Der Filmverband ermöglicht eine einfache Entfernung von Eiern nach Injektionen. In dem Moment, in dem ein Wassertropfen zum Filmverband hinzugefügt wird, beginnen sich die Eier mit dem Wasser zu bewegen.
3. Halten Sie die Eier in Wasser und legen Sie die Petrischale in eine 6-Liter-Plastikbox in einen Inkubator bei 27 °C und >90% rF.
4. Überprüfen Sie die Eier regelmäßig, täglich für die ersten Tage und dann alle 3-4 Tage, bis die Larven zu schlüpfen beginnen.
   HINWEIS: Wenn eine große Anzahl von Eiern während der Mikroinjektionen beschädigt wird, verhindert das sanfte Ablassen des DI-Wassers nach einer Woche das Pilzwachstum auf den toten Eiern.
5. Wenn die Larven aus den injizierten Embryonen zu schlüpfen beginnen (21-25 Tage nach der Injektion für den gegenwärtigen Laboraufbau), überprüfen Sie sie täglich und übertragen Sie alle geschlüpften Larven in Glasfläschchen mit einem Sieb oben. Larven können unter Wasser schlüpfen und ~1-2 Wochen überleben.
6. Screenen Sie die Larven⁴ , wenn den Eiern ein Konstrukt injiziert wurde, das zu einem sichtbaren Phänotyp führen kann.

Ergebnisse

Ein erfolgreiches Embryo-Injektionsprotokoll für I. scapularis wird in diesem Artikel beschrieben. Eilegende Weibchen wurden bei hoher Luftfeuchtigkeit gehalten, um das Austrocknen von teilweise gewachsten Eiern zu vermeiden. Die Wachsschicht wurde entfernt, um Zeckenembryonen zu injizieren, indem das Genorgan (Wachsdrüse) des graviden Weibchens abgetragen wurde (Abbildung 1A-E). Wir verwendeten Aluminosilikatglasnadeln mit einem kürzeren Hals (<...

Diskussion

Dies ist das erste Protokoll, das entwickelt wurde, um frühe Zeckenembryonen erfolgreich zu injizieren. Es wurde eine Überlebensrate von ~4%-8% erreicht, was mit der Embryoinjektion in anderen etablierten Insektenmodellen vergleichbar ist⁵.

Da dies das erste Protokoll ist, wird erwartet, dass dieses Protokoll weiter verfeinert und auf einzelne Zeckenarten spezialisiert wird. Insbesondere variiert der Injektionszeitpunkt von Art zu Art, abhängig von der Embryogenese, ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum silicate capillaries, with filament	Sutter instruments	AF100-64-10	Embryo injection
Benzalkonium chloride 50% in water, 25 g	TCI-America	B0414	Embryo treatment, 25 g is approximately 25 mL
Filter paper	Whatman	1001-090	Post-injection care
Forceps	Thomas Scientific	300-101	Gene`s organ manipulation
Lab Wipes	Genesee Scientific	88-115
Microloader tips	Eppendorf	930001007	Loading the pulled needles
Micromanipulator	Sutter instruments	ROE-200	Embryo injection
Microscopic slides- plain, ground edges	Genesee Scientific	29-100	Embryo alignment, ground edges are preferred, beveled edges could obscure the eggs from view
NaCl	Research Products International	S23020-500.0	Embryo treatment
Needle Puller	Sutter Instruments	P-1000
Permanent Double sided tape	Scotch	34-8716-3417-5	Embryo alignment
Petri plates	Genesee Scientific	32-107G	Post-injection care
Tegaderm/ Transparent film dressing	3M Healthcare	1628	Embryo alignment
Tungsten needles	Fine Science Tools	10130-10	Gene`s organ manipulation
Tungsten Wire	Amazon	B08DNT7ZK3	Gene`s organ manipulation
XenoWorks Digital Microinjector	Sutter instruments	MPC-200	Embryo injection