טכניקת הזרקת עוברים לעריכת גנים בקרצייה שחורת הרגליים, Ixodes scapularis

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה להזרקת עוברי קרציות. הזרקת עובר היא הטכניקה המועדפת למניפולציה גנטית ליצירת קווים מהונדסים.

Abstract

קרציות יכולות להעביר פתוגנים ויראליים, חיידקיים ופרוטוזואניים שונים ולכן נחשבות לווקטורים בעלי חשיבות רפואית ווטרינרית. למרות הנטל הגובר של מחלות המועברות על ידי קרציות, המחקר על קרציות פיגר אחרי וקטורים של מחלות חרקים בשל אתגרים ביישום כלי טרנספורמציה גנטית למחקרים פונקציונליים לביולוגיה הייחודית של הקרציות. התערבויות גנטיות צוברות תשומת לב כדי להפחית מחלות המועברות על ידי יתושים. עם זאת, פיתוח של התערבויות כאלה דורש טרנספורמציה יציבה germline על ידי הזרקת עוברים. טכניקת הזרקת עוברים כזו חסרה לכליצרטים, כולל קרציות. מספר גורמים, כגון שכבת שעווה עבה חיצונית על עוברי קרציות, כוריון קשה ולחץ תוך-סגלגל גבוה, הם כמה מכשולים שמנעו בעבר התפתחות פרוטוקול הזרקת עוברים בקרציות. העבודה הנוכחית התגברה על מכשולים אלה, וטכניקת הזרקת עוברים עבור הקרצייה שחורת הרגליים, Ixodes scapularis, מתוארת כאן. ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לספק רכיבים, כגון CRISPR/Cas9, לטרנספורמציות נבט יציבות.

Introduction

קרציות הן וקטורים בעלי חשיבות רפואית ווטרינרית, המסוגלים להעביר מגוון של פתוגנים ויראליים, חיידקיים, פרוטוזואניים ונמטודות ^1,2. במזרח ארצות הברית, הקרצייה שחורת הרגליים, Ixodes scapularis, היא וקטור חשוב של פתוגן מחלת ליים (LD), spirochete Borrelia burgdorferi. מעל 400,000 מקרים של LD מדווחים מדי שנה בארצות הברית, מה שהופך אותה למחלה הזיהומית המובילה המועברת על ידי וקטורים בארה"ב¹. בנוסף ל- B. burgdorferi, שישה מיקרואורגניזמים אחרים מועברים על ידי I. scapularis - כולל ארבעה חיידקים (Anaplasma phagocytophilum, B. mayonii, B. miyamotoi, ו- Ehrlichia muris eauclarensis), טפיל פרוטוזואני אחד (Babesia microti) ונגיף אחד (וירוס Powassan), מה שהופך את מין הקרציות הזה לדאגה מרכזית לבריאות הציבור³ . בעוד שמחלות המועברות על ידי קרציות הפכו נפוצות יותר בשנים האחרונות, המחקר על קרציות השתרך מאחורי וקטורים אחרים של פרוקי רגליים, כגון יתושים, בשל הביולוגיה הייחודית של הקרציות והאתגרים הקשורים ליישום כלים גנומיים גנטיים ותפקודיים ^4,5.

טכניקות לעריכת גנים, במיוחד CRISPR/Cas9, הפכו כעת מחקרי גנומיקה פונקציונליים לאפשריים באורגניזמים שאינם מודלים. ליצירת מוטציות תורשתיות באורגניזם, הזרקת עוברים נותרה השיטה המועדפת להעברת מבנים לשינוי הנבט ^6,7,8,9. עם זאת, עד לאחרונה⁴, ביצי קרציות נחשבו קשות מדי או אפילו בלתי אפשריות להזרקה מבלי להרוג את העובר^10,11. שכבת שעווה עבה על ביציות, כוריון קשה ולחץ תוך-סגלגל גבוה היו חלק מהמכשולים העיקריים שמנעו הזרקת עוברים בקרציות. 1. scapularis בוגרים, הניזונים מדם, מפקידים מצמד יחיד של עד 2,000 ביצים¹² במשך 3-4 שבועות (כ-100 ביצים ביום). ביצים מוטלות בנפרד, וכל ביצה מצופה בשעווה המופרשת על ידי בליטות או "קרניים" של איבר ג'נה הבלוטתי^13,14,15 של האם. שעווה זו מגנה על הביצים מפני ייבוש ומכילה תרכובות אנטי מיקרוביאליות¹⁵. כדי להזריק בהצלחה ביצי קרציות, חשוב להסיר את שכבת השעווה, לרכך את הכוריון, ולייבש את הביצים כדי להקטין את הלחץ התוך-אובלי, כך שההזרקה לא תפגע באופן בלתי הפיך בביצית. מתוך הבנת החשיבות הקריטית של הזרקות עוברים לטרנספורמציה מוצלחת של חיידקים, פותח פרוטוקול עבור I. scapularis, אשר ניתן להשתמש בו כדי לספק מבנה CRISPR/Cas9 וליצור מוטציות נבט יציבות⁴. בנוסף לתרומתו למחקר I. scapularis, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם גם למיני קרציות אחרים.

Protocol

בוגרי Ixodes scapularis נרכשו מאוניברסיטת אוקלהומה סטייט (OSU) או גודלו באוניברסיטת נבאדה, רינו (UNR) (פרוטוקול IACUC #21-001-1118).

1. הכנת קרציות נקבות לאיסוף עוברים

הערה: כדי לאסוף ביצים בגיל המתאים, חשוב לסנכרן את הטלת הביצים. למרות שרמזים להטלת ביצים בקרציות עדיין אינם ברורים, בתנאי החרקים הסטנדרטיים (טמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס ולחות יחסית של >90% (RH)), נקבות I. scapularis מתחילות להטיל ביצים כ-8 ימים לאחר ניתוק הפונדקאי. ניתן להאריך ציר זמן זה על ידי אחסון נקבות גדושות ב -4 מעלות צלזיוס. אחסנו נקבות שניזונו מדם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד 8 שבועות ללא כל השפעה שלילית על הטלת הביצים. ייתכן שיהיה צורך לשנות תנאים אלה עבור כל חרק.

1. יש לאחסן את כל הנקבות הגדושות בטמפרטורה של 4°C עם >90% RH בקופסת פלסטיק של 6 ליטר מרופדת בנייר סינון לח עד לשימוש במיקרו-הזרקות.
2. שבוע לפני הזריקות, מעבירים את הנקבות מ-4 מעלות צלזיוס לאינקובטור של 27 מעלות צלזיוס להתחלת הטלת ביצים.
3. כאשר הנקבות מתחילות להטיל ביצים (3-4 ימים לאחר העברתן ל-27 מעלות צלזיוס), הסירו את כל הביצים באמצעות מכחול דק והכינו את הנקבות לאבלציה של איבריה (בלוטת השעווה) של ג'נה.
   הערה: האיבר של הג'נה משתרע מהאזור שבין החרטום לקפיטולום (הבסיס הגבי של חלקי הפה), חלקי הפה מתכופפים על פני השטח של הגוף הגחוני (במקביל לפני השטח), והאיבר המורחב של הגן מצפה ביצים ברגע שהביצים מוטלות (איור 1). ביצים שהוטלו לפני הסרת איברים של Gené או ריקון של שעווה יהיה ציפוי שעווה והם אינם מתאימים להזרקות ויש להשליך אותם.
4. כדי להסיר או לרוקן את איבר הז'נה, השתמשו בחימר כדי למקם את הנקבה הסגורה על מגלשת זכוכית מתחת למיקרוסקופ המכוון כך שחלקי הפה ייראו הן בצד הגחוני והן בצד הגבי (איור 1B,C).
   1. יש לתקוע בזהירות את האזור בדיוק בין החרטום לחלקי הפה באמצעות מלקחיים עדינים ומחטי טונגסטן המיוצרים במעבדה באמצעות חוט טונגסטן בעקבות פרוטוקול¹⁶ שפורסם בעבר (ניתן לרכוש מחטים גם באופן מסחרי, ולחבר אותן לבדיקה מיקרו-ניתונית, ראו טבלת חומרים).
   2. אם תעבדו את הדרך פנימה עם מחט הטונגסטן, משכו את בלוטת השעווה החוצה (איור 1D,E). זה עשוי לקחת כמה דקות כדי להסיר את הבלוטה. נגבו כל הפרשת שעווה נוזלית באמצעות מגבוני מעבדה.
      הערה: ניתן להסיר את הבלוטה גם מהצד הגחוני ממש מתחת לחלקי הפה; על ידי הושטת יד מאחור לכיוון scutum עם מחט ומלקחיים. מריחת דבק סיליקון סביב חלקי הפה גם חוסמת את אוורור האיברים של ג'ין וניתן להשתמש בה במקום להסיר או לרוקן את השעווה (תקשורת אישית עם ד"ר לדיסלב סימו, INRAE, צרפת). קרציות דחוסות לא יישארו על קלטת דו צדדית. שימוש בחימר כדי "לחטוף" את הקרצייה עוזר לשמור אותם במקומם במהלך מניפולציה. השתמש מלקחיים כדי להחזיק את מחט קרצית טונגסטן עבור דיסקציה. החלק הגחוני קל יותר לנקב עם מחט המועדף על ידי המחברים.
5. כדי לרוקן את הבלוטה, סדרו את קרציית הגרביד כאמור בשלב 1.4. לנקב בזהירות את האזור שמאחורי חלקי הפה בצד הגבי ולהפעיל לחץ על הצד הגחוני באמצעות מלקחיים.
   הערה: לחלופין, אין צורך להסיר את בלוטת השעווה; ריקון בלוטת השעווה יימשך מספר ימים. לנקבות מטילות ביצים יש אזור לבן סביב חלקי הפה המציין את מיקום בלוטת השעווה וניתן להשתמש בו כהפניה.
   1. מניחים את הקצה של מגבון מעבדה ללא מוך ומסירים את השעווה הנוזלית שיוצאת מאתר הניקוב. הקפד למנוע הפרשת המולימפה, שהוא נוזל צלול לעומת שעווה צמיגה צהבהבה מעט. זה עלול לקחת 5-10 דקות עד שרוב השעווה מוסרת.
6. לאחר מניפולציה, מניחים את הנקבות באינקובטור ב 27 מעלות צלזיוס (>90% לחות יחסית) ומאפשרים להן להתאושש במשך 1-2 ימים.
   הערה: לנקבות מטופלות לוקח בדרך כלל 1-2 ימים להתאושש ולהתחיל להטיל ביצים שוב.
7. כאשר הנקבות מתחילות להטיל ביצים שוב, השתמשו במכחול עדין כדי לאסוף ביצים שזה עתה הופקדו (0-18 שעות לאחר הטלת הביצים) והניחו אותן בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
   הערה: אם משתמשים בביציות מאותה נקבה לאורך זמן, יש לחזור על הליך זה לאחר 4-5 ימים של הטלת ביצים אם הבלוטות לא הוסרו.

2. טיפול בעובר עבור microinjections

1. הוסף ~ 200 μL (או נפח מספיק כדי לכסות את הביצים, תלוי במספר הביצים) של 5% (משקל / נפח) benzalkonium כלוריד / מים (ראה טבלת חומרים) בצינור המכיל 0-18 שעות ביצים ישנות. מערבבים בעדינות את הביצים עם המכחול למשך 5 דקות כדי למנוע מהביצים לשקוע בתחתית הצינור (לפרטים ראו שארמה ואחרים ⁴). הסר את supernatant באמצעות micropipette, משאיר את הביצים מאחור בצינור.
   אזהרה: בנזלקוניום כלוריד הוא קורוזיבי לעור ולעיניים, לובש כפפות ומגן על העיניים.
2. הוסף ~ 200 μL של מים מזוקקים (DI) לצינור המכיל ביצים, מערבל עם מכחול, והסר את המים מצינור microcentrifuge באמצעות micropipette. חזרו על הכביסה עם מי DI פעם נוספת.
3. לאחר השטיפה במי DI, יש להוסיף ~200 μL של נתרן כלורי (NaCl) של 5% (w/v) ולסובב בעדינות עם מכחול למשך 5 דקות. הסר את הפתרון מן הצינור לאחר 5 דקות ולשטוף את הביצים פעמיים עם מים DI.
4. הוסף ~ 100 μL של 1% (w / v) תמיסת NaCl בצינור microcentrifuge המכיל ביצים. שמור את הביצים בתמיסת NaCl של 1% (w/v) עד שהן משמשות להזרקות.
5. התחל מיקרו-הזרקות לאחר כשעה. ציר זמן זה מסייע בייבוש תקין של הביצים ומונע מהן להתפוצץ.
   הערה: ניתן לשמור ביצים בתמיסת NaCl של 1% (w/v) למשך 7-8 שעות מבלי להשפיע באופן משמעותי על ההישרדות. אם הביציות קשות להזרקה או להתפוצצות, אז הביציות אינן מיובשות מספיק וניתן לטפל בהן עוד יותר עם 5% (w/v) NaCl למשך 5 דקות נוספות.

3. הכנת מחטי הזרקה

1. הכנס זכוכית נימי אלומיניום (עם נימה, ראה טבלת חומרים) לתוך מושך המחט בהתאם להוראות היצרן.
2. התאם את מושך המחט להגדרות הבאות: חום: 575, משיכה: 20, מהירות: 50, זמן: 200, ולחץ : 700.
3. הפעל את פונקציית המשיכה של מושך המחט וחזור על התהליך לקבלת מחטים נוספות.
4. אחסנו את המחטים המשוכות על ידי הדבקתן לשורות של חימר דוגמן בצלחת פטרי נקייה.
5. טען את המחט עם תערובת ההזרקה באמצעות קצה מעמיס מיקרו (ראה טבלת חומרים).
   הערה: ההשוואה בין מחטים המשמשות להזרקת עוברי קרציות ויתושים מוצגת באיור 2.

4. הגדרת שקופיות למיקרו-הזרקות

1. באמצעות סרט דו-צדדי, הדביקו שני מיקרוסקופ זכוכית ששקופיות זו לזו, והשאירו מרווח של כ-0.5 ס"מ כדי לתמוך ביישור ביצים ולמנוע את התהפכותן במהלך הזרקות (איור 3A).
2. מרחו חתיכת חבישת סרט שקופה (ראו טבלת חומרים) על הסרט הדו-צדדי ברווח שבין השקופיות. הקפידו ליישר את הלבשת הסרט בצורה מושלמת עם הפער.

5. מיקרו-הזרקות לעוברים

1. יישרו 8-10 ביצים בכל פעם במערך ההחלקה (לעיל) באמצעות מברשת צבע בעלת שיער אחד.
   הערה: ביצים המיושרות עם הציר הארוך יותר הניצב (איור 3B) לקצה המגלשה קלות יותר להזרקה מאשר ביצים שציר האורך שלהן מיושר במקביל לקצה (איור 3C). ביצים בכיוון הניצב (איור 3B) יכולות לעמוד טוב יותר בהזרקה וכתוצאה מכך לשרוד גבוה יותר.
2. מניחים את המגלשה עם ביצים מיושרות על הבמה של מיקרוסקופ מורכב. השתמש בחתיכת מגבון ללא מוך כדי להסיר את תמיסת NaCl 1% שבה הם מאוחסנים.
3. חברו את מחט ההזרקה המלאה למיקרו-אינז'קטור המחובר למיקרומניפולטור (ראו טבלת חומרים).
4. פתח את המחט על ידי שפשוף עדין על משטח הביצה באמצעות הגדרה בלחץ גבוה על המיקרו-אינז'קטור (>5,000 hPa).
5. לאחר פתיחת המחט, הפחיתו את הלחץ (1,000-2,500 hPa) של המיקרו-אינז'קטור, בהתאם לפתח המחט.
   הערה: פתח קטן ידרוש לחץ גבוה יחסית, בעוד שפתח גדול יותר ידרוש לחץ נמוך יותר. זאת כדי לשלוט על עוצמת הקול של המבנה מוזרק. בהתאם לגודל פתח המחט, נפח ההזרקה ישתנה בין 1-5 pL.
6. מזריקים את כל הביצים על המגלשה בזווית של 10°-15° מהר ככל האפשר ומיד מעבירים את המגלשה לתנאי לחות גבוהה בצלחת פטרי מרופדת בנייר לח. ברגע שהביצים מוזרקות, הן מתחילות להתייבש.
   הערה: הזרקת מספר קטן של ביציות בכל פעם מגדילה את הצלחת ההזרקה ואת סיכויי ההישרדות. מחטים אכן נסתמות על ידי רפלוקס עוברי. אם הקצה עדיין חד, כדי לנקות מחטים סתומות, העבירו את המחט לתוך טיפה קטנה של 1% NaCl שנוספה לקצה המגלשה. הפעולה הנימית תנתק את הסתימה הקטנה. אם המחט כבר קהה, שנה אותה.

6. טיפול בעוברים לאחר הזרקה

1. הניחו את השקופית המכילה עוברים מוזרקים בצלחת פטרי גדולה מרופדת בנייר סינון לח.
   הערה: חשוב מאוד לא להפריע לביצים לפחות 5-6 שעות. זה מאפשר לפצע ההזרקה לאטום כראוי. פצע ההזרקה עלול להיפתח כאשר הוא נסער, וציטופלסמה עלולה להתחיל לטפטף החוצה, וכתוצאה מכך תמותת ביצים.
2. לאחר 5-6 שעות, הוסיפו טיפה קטנה של מי DI להלבשת הסרט השקוף עם עוברים מוזרקים מחוברים. בעזרת מכחול, מזיזים בעדינות את הביצים. מעבירים את הביצים לצלחת פטרי קטנה (10 ס"מ) וטובלים אותן במי DI.
   הערה: חבישת הסרט מאפשרת הסרה קלה של ביצים לאחר הזרקות. ברגע שמוסיפים טיפת מים לרוטב הסרט, הביצים יתחילו לנוע יחד עם המים.
3. השאירו את הביצים שקועות במים והניחו את צלחת הפטרי בקופסת פלסטיק של 6 ליטר באינקובטור בטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס ו->90% לחות יחסית.
4. בדוק את הביצים באופן קבוע, מדי יום במשך הימים הראשונים, ולאחר מכן כל 3-4 ימים עד הזחלים מתחילים לבקוע.
   הערה: אם מספר גדול של ביצים ניזוקו במהלך מיקרו-הזרקות, ניקוז עדין של מי ה-DI לאחר שבוע ימנע צמיחה פטרייתית על הביצים המתות.
5. כאשר הזחלים מתחילים לבקוע מהעוברים המוזרקים (21-25 יום לאחר ההזרקה למערך המעבדה הנוכחי), בדקו אותם מדי יום והעבירו את כל הזחלים שבקעו לבקבוקוני זכוכית עם מסך למעלה. זחלים יכולים לבקוע מתחת למים ולשרוד ~ 1-2 שבועות.
6. מסננים את הזחלים⁴ אם הביצים הוזרקו עם מבנה שעלול לגרום לפנוטיפ נראה לעין.

תוצאות

פרוטוקול הזרקת עובר מוצלח עבור I. scapularis מתואר במאמר זה. נקבות מטילות ביצים הוחזקו בלחות גבוהה כדי למנוע ייבוש של ביצים שעווה חלקית. שכבת השעווה הוסרה כדי להזריק לעוברי קרציות על-ידי השמטת איבר הגן (בלוטת השעווה) של נקבת הגרביד (איור 1A-E). השתמשנו במחטי ז...

Discussion

זהו הפרוטוקול הראשון שפותח כדי להזריק עוברים מוקדמים של קרציות בהצלחה. הושג שיעור הישרדות של ~4%-8%, הדומה להזרקת עוברים במודלים מבוססים אחרים של חרקים⁵.

מכיוון שזהו הפרוטוקול הראשוני, צפוי כי פרוטוקול זה ישוכלל עוד יותר ויתמחה במיני קרציות בודדים. בפרט, תזמון ההז...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum silicate capillaries, with filament	Sutter instruments	AF100-64-10	Embryo injection
Benzalkonium chloride 50% in water, 25 g	TCI-America	B0414	Embryo treatment, 25 g is approximately 25 mL
Filter paper	Whatman	1001-090	Post-injection care
Forceps	Thomas Scientific	300-101	Gene`s organ manipulation
Lab Wipes	Genesee Scientific	88-115
Microloader tips	Eppendorf	930001007	Loading the pulled needles
Micromanipulator	Sutter instruments	ROE-200	Embryo injection
Microscopic slides- plain, ground edges	Genesee Scientific	29-100	Embryo alignment, ground edges are preferred, beveled edges could obscure the eggs from view
NaCl	Research Products International	S23020-500.0	Embryo treatment
Needle Puller	Sutter Instruments	P-1000
Permanent Double sided tape	Scotch	34-8716-3417-5	Embryo alignment
Petri plates	Genesee Scientific	32-107G	Post-injection care
Tegaderm/ Transparent film dressing	3M Healthcare	1628	Embryo alignment
Tungsten needles	Fine Science Tools	10130-10	Gene`s organ manipulation
Tungsten Wire	Amazon	B08DNT7ZK3	Gene`s organ manipulation
XenoWorks Digital Microinjector	Sutter instruments	MPC-200	Embryo injection