Siyah Ayaklı Kene Gen Düzenleme için Embriyo Enjeksiyon Tekniği, Ixodes scapularis

Özet

Mevcut protokol, kene embriyolarının enjekte edilmesi için bir yöntemi açıklamaktadır. Embriyo enjeksiyonu, transgenik çizgiler oluşturmak için genetik manipülasyon için tercih edilen tekniktir.

Özet

Keneler çeşitli viral, bakteriyel ve protozoan patojenleri iletebilir ve bu nedenle tıbbi ve veterinerlik açısından önemli vektörler olarak kabul edilir. Kene kaynaklı hastalıkların artan yüküne rağmen, keneler üzerindeki araştırmalar, fonksiyonel çalışmalar için genetik dönüşüm araçlarının kenelerin benzersiz biyolojisine uygulanmasındaki zorluklar nedeniyle böcek hastalığı vektörlerinin gerisinde kalmıştır. Genetik müdahaleler sivrisinek kaynaklı hastalıkları azaltmak için dikkat çekmektedir. Bununla birlikte, bu tür müdahalelerin gelişimi, embriyoların enjekte edilmesiyle stabil germline transformasyonu gerektirir. Böyle bir embriyo enjeksiyon tekniği, keneler de dahil olmak üzere şeliseratlar için eksiktir. Kene embriyoları üzerinde harici kalın balmumu tabakası, sert koryon ve yüksek oval içi basınç gibi çeşitli faktörler, daha önce kenelerde embriyo enjeksiyon protokolü gelişimini engelleyen bazı engellerdir. Mevcut çalışma bu engellerin üstesinden gelmiştir ve siyah bacaklı kene için bir embriyo enjeksiyon tekniği olan Ixodes skapularis burada anlatılmaktadır. Bu teknik, kararlı germ hattı dönüşümleri için CRISPR/Cas9 gibi bileşenler sunmak için kullanılabilir.

Giriş

Keneler, çeşitli viral, bakteriyel, protozoan patojenleri ve nematodları ^1,2 iletebilen tıbbi ve veterinerlik açısından önemli vektörlerdir. Doğu Amerika Birleşik Devletleri'nde, siyah bacaklı kene, Ixodes scapularis, Lyme hastalığı (LD) patojeni olan spiroket Borrelia burgdorferi'nin önemli bir vektörüdür. Amerika Birleşik Devletleri'nde her yıl 400.000'den fazla LD vakası bildirilmektedir ve bu da onu ABD'deki en iyi vektör kaynaklı bulaşıcı hastalık haline getirmektedir¹. B. burgdorferi'ye ek olarak, dört bakteri (Anaplasma phagocytophilum, B. mayonii, B. miyamotoi ve Ehrlichia muris eauclarensis), bir protozoan parazit (Babesia microti) ve bir virüs (Powassan virüsü) dahil olmak üzere altı mikroorganizma daha I. skapularisis tarafından bulaşır, bu da bu kene türünü önemli bir halk sağlığı sorunu haline getirir³ . Kene kaynaklı hastalıklar son yıllarda daha yaygın hale gelirken, keneler üzerine yapılan araştırmalar, kenelerin benzersiz biyolojisi ve genetik ve fonksiyonel genomik araçların uygulanmasıyla ilgili zorluklar nedeniyle sivrisinekler gibi diğer eklembacaklı vektörlerin gerisinde kalmıştır ^4,5.

Gen düzenleme teknikleri, özellikle CRISPR / Cas9, artık fonksiyonel genomik çalışmaları model olmayan organizmalarda uygulanabilir hale getirmiştir. Bir organizmada kalıtsal mutasyonlar oluşturmak için, embriyo enjeksiyonu, germ çizgisi 6,7,8,9'u değiştirmek için yapılar sunmak için tercih edilen yöntem olmaya devam etmektedir. Bununla birlikte, yakın zamana kadar⁴, kene yumurtalarının embriyoyu öldürmeden enjekte edilmesinin çok zor veya hatta imkansız olduğu düşünülüyordu^10,11. Yumurtalar üzerinde kalın bir balmumu tabakası, sert koryon ve yüksek oval içi basınç, kenelerde embriyo enjeksiyonunu engelleyen ana engellerden bazılarıydı. Yetişkin, kanla beslenen I. skapularis, 3-4 hafta boyunca 12 yumurtaya kadar (yaklaşık¹⁰⁰ yumurta / gün) 2.000 yumurtadan oluşan tek bir kavrama biriktirir. Yumurtalar tek tek serilir ve her yumurta, glandüler Gené'nin organının çıkıntıları veya "boynuzları" tarafından salgılanan balmumu ile kaplanır^13,14,15 annenin. Bu balmumu yumurtaları kurumaya karşı korur ve antimikrobiyal bileşikler içerir¹⁵. Kene yumurtalarını başarılı bir şekilde enjekte etmek için, balmumu tabakasını çıkarmak, koryonu yumuşatmak ve enjeksiyonun yumurtaya geri dönüşümsüz olarak zarar vermemesi için oval içi basıncı azaltmak için yumurtaları kurutmak önemlidir. Başarılı germline transformasyonu için embriyo enjeksiyonlarının kritik önemini anlayarak, bir CRISPR / Cas9 yapısı sunmak ve kararlı germline mutasyonları üretmek için kullanılabilecek I. scapularis için bir protokol geliştirilmiştir⁴. I. scapularis araştırmasına katkısına ek olarak, bu protokol diğer kene türleri için de optimize edilebilir.

Protokol

Ixodes scapularis yetişkinleri ya Oklahoma Eyalet Üniversitesi'nden (OSU) satın alındı ya da Nevada Üniversitesi, Reno'da (UNR) yetiştirildi (IACUC protokolü #21-001-1118).

1. Embriyo toplama için dişi kenelerin hazırlanması

NOT: Uygun yaştaki yumurtaları toplamak için, yumurtlamayı senkronize etmek önemlidir. Kenelerde yumurtlama ipuçları belirsizliğini korusa da, standart böcek koşulları altında (27 ° C sıcaklık ve% >90 bağıl nem (RH)), I. scapularis dişileri, konakçı ayrılmasından yaklaşık 8 gün sonra yumurta bırakmaya başlar. Bu zaman çizelgesi, dolu dişileri 4 ° C'de depolayarak uzatılabilir. Kanla beslenen dişileri 4 ° C'de 8 haftaya kadar yumurtlama üzerinde herhangi bir olumsuz etkisi olmadan sakladık. Bu koşulların her böcek için değiştirilmesi gerekebilir.

1. Tüm dolu dişileri, mikroenjeksiyonlar için kullanılana kadar nemli filtre kağıdı ile kaplanmış 6 litrelik plastik bir kutuda% >90 RH ile 4 ° C'de saklayın.
2. Enjeksiyonlardan bir hafta önce, yumurtlamanın başlatılması için dişileri 4 ° C'den 27 ° C'lik bir inkübatöre aktarın.
3. Dişiler yumurta bırakmaya başladığında (onları 27 ° C'ye taşıdıktan 3-4 gün sonra), ince uçlu bir boya fırçası kullanarak yumurtaları çıkarın ve dişileri Gené'nin organ (balmumu bezi) ablasyonu için hazırlayın.
   NOT: Gené'nin organı, scutum ve capitulum (ağız kısımlarının dorsal tabanı) arasındaki alandan uzanır, ağız kısımları ventral vücut yüzeyi üzerinde bükülür (yüzeye paralel) ve genişletilmiş Gen'in organı, yumurtalar serilir serilmez yumurtaları kaplar (Şekil 1). Gené'nin organının çıkarılmasından veya balmumunun boşaltılmasından önce bırakılan yumurtalar balmumu kaplamasına sahip olacaktır ve enjeksiyonlar için uygun değildir ve atılmalıdır.
4. Gené'nin organını çıkarmak veya boşaltmak için, engorged dişiyi mikroskop altında yönlendirilmiş bir cam slayt üzerine konumlandırmak için kil kullanın, böylece ağız kısımları hem ventral hem de dorsal taraflarda görülebilir (Şekil 1B, C).
   1. Daha önce yayınlanmış bir protokol^16'yı takiben tungsten teli kullanılarak laboratuarda yapılan ince forseps ve tungsten iğneleri kullanarak scutum ve ağız kısımları arasındaki alanı dikkatlice dürtün (iğneler ticari olarak da satın alınabilir ve bir mikro diseksiyon probuna tutturulabilir, bkz.
   2. Tungsten iğnesi ile içeri girmeye çalışarak, balmumu bezini dışarı çekin (Şekil 1D, E). Bezin çıkarılması birkaç dakika sürebilir. Laboratuvar mendilleri kullanarak sıvı balmumu salgılarını silin.
      NOT: Bez, ağız kısımlarının hemen altındaki ventral taraftan da çıkarılabilir; arkadan scutuma doğru bir iğne ve forseps ile uzanarak. Ağız kısımlarının etrafına silikon yapıştırıcı uygulanması da Gene'in organ eversiyonunu engeller ve balmumunu çıkarmak veya boşaltmak yerine kullanılabilir (Dr. Ladislav Simo, INRAE, Fransa ile kişisel iletişim). Engorged keneler çift taraflı bantta kalmayacaktır. Keneyi "kundaklamak" için kil kullanmak, manipülasyon sırasında onları yerinde tutmaya yardımcı olur. Diseksiyon için kene ve tungsten iğnesini tutmak için forseps kullanın. Ventral kısmın iğne ile delinmesi daha kolaydır ve yazarlar tarafından tercih edilir.
5. Bezi boşaltmak için, gravid kenesini adım 1.4'te belirtildiği gibi düzenleyin. Dorsal taraftaki ağız kısımlarının arkasındaki alanı dikkatlice delin ve forseps kullanarak ventral tarafa baskı uygulayın.
   NOT: Alternatif olarak, balmumu bezinin çıkarılması gerekli değildir; balmumu bezinin boşaltılması birkaç gün sürecektir. Yumurtlayan dişiler, ağız kısımlarının etrafında, balmumu bezinin yerini gösteren ve referans olarak kullanılabilecek beyaz bir alana sahiptir.
   1. Tüy bırakmayan bir laboratuvar mendilinin kenarını yerleştirin ve delinme bölgesinden çıkan sıvı balmumunu çıkarın. Hafif sarımsı viskoz balmumu ile karşılaştırıldığında berrak bir sıvı olan hemolenf sekresyonundan kaçındığınızdan emin olun. Balmumunun çoğu çıkarılana kadar 5-10 dakika sürebilir.
6. Manipülasyondan sonra, dişileri 27 ° C'de (% >90 RH) bir inkübatöre yerleştirin ve 1-2 gün boyunca iyileşmelerine izin verin.
   NOT: Tedavi edilen dişilerin iyileşmesi ve tekrar yumurta bırakmaya başlaması genellikle 1-2 gün sürer.
7. Dişiler tekrar yumurta bırakmaya başladığında, taze birikmiş yumurtaları toplamak için ince bir boya fırçası kullanın (yumurtlamadan 0-18 saat sonra) ve bunları 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
   NOT: Zamanla aynı dişiden yumurta kullanılıyorsa, bezler çıkarılmamışsa, bu prosedür yumurtlamadan 4-5 gün sonra tekrarlanmalıdır.

2. Mikroenjeksiyonlar için embriyo tedavisi

1. 0-18 saat eski yumurta içeren tüpe ~ 200 μL (veya yumurta sayısına bağlı olarak yumurtaları örtmek için yeterli hacim) % 5 (ağırlık / hacim) benzalkonyum klorür / su (bkz. Yumurtaların tüpün dibine yerleşmesini önlemek için yumurtaları boya fırçasıyla 5 dakika boyunca yavaşça döndürün (ayrıntılar için Sharma ve ^ark.4'e bakınız). Süpernatantı bir mikropipet kullanarak çıkarın ve yumurtaları tüp içinde geride bırakın.
   DİKKAT: Benzalkonyum klorür cilt ve gözler için aşındırıcıdır, eldiven giyin ve göz koruması kullanın.
2. Yumurta içeren tüpe ~ 200 μL damıtılmış (DI) su ekleyin, bir boya fırçasıyla döndürün ve bir mikropipet kullanarak suyu mikrosantrifüj tüpünden çıkarın. DI su ile yıkamayı bir kez daha tekrarlayın.
3. DI suyu ile yıkadıktan sonra, ~ 200 μL% 5 (w / v) sodyum klorür (NaCl) ekleyin ve 5 dakika boyunca bir boya fırçası ile hafifçe döndürün. Çözeltiyi 5 dakika sonra tüpten çıkarın ve yumurtaları iki kez DI suyuyla yıkayın.
4. Yumurta içeren mikrosantrifüj tüpüne ~100 μL% 1 (w / v) NaCl çözeltisi ekleyin. Yumurtaları enjeksiyonlar için kullanılana kadar% 1 (w / v) NaCl çözeltisinde tutun.
5. Yaklaşık bir saat sonra mikroenjeksiyonlara başlayın. Bu zaman çizelgesi, yumurtaların uygun şekilde kurutulmasına yardımcı olur ve patlamalarını önler.
   NOT: Yumurtalar, sağkalımı önemli ölçüde etkilemeden 7-8 saat boyunca% 1 (w / v) NaCl çözeltisinde tutulabilir. Yumurtaların enjekte edilmesi veya patlaması zorsa, yumurtalar yeterince kurutulmaz ve 5 dakika daha% 5 (w / v) NaCl ile muamele edilebilir.

3. Enjeksiyon iğnelerinin hazırlanması

1. Üreticinin talimatlarını izleyerek iğne çektiricisine bir alüminosilikat kılcal cam (filamentli, Malzeme Tablosuna bakınız) yerleştirin.
2. İğne çektiricisini şu ayarlara ayarlayın: Isı: 575, Çekme: 20, Hız: 50, zaman: 200 ve Basınç: 700.
3. İğne çektiricisinin çekme işlevini etkinleştirin ve ek iğneler için işlemi tekrarlayın.
4. Çekilen iğneleri, temiz bir Petri kabında modelleyicinin kil hatlarına yapıştırarak saklayın.
5. İğneyi bir mikro yükleyici ucu kullanarak enjeksiyon karışımıyla doldurun (bkz.
   NOT: Kene ve sivrisinek embriyosu enjeksiyonu için kullanılan iğnelerin karşılaştırılması Şekil 2'de gösterilmiştir.

4. Mikroenjeksiyonlar için slayt kurulumu

1. Çift taraflı bant kullanarak, iki cam mikroskop slaytını birbirine yapıştırın, yumurtaların hizalanmasını desteklemek ve enjeksiyonlar sırasında yuvarlanmalarını önlemek için yaklaşık 0,5 cm'lik bir boşluk bırakın (Şekil 3A).
2. Slaytlar arasındaki boşluktaki çift taraflı bant üzerine bir parça şeffaf film pansuman uygulayın (bkz. Film pansuman boşluğuyla mükemmel bir şekilde hizaladığınızdan emin olun.

5. Embriyo mikroenjeksiyonları

1. Tek saçlı bir boya fırçası kullanarak slayt kurulumunda (yukarıda) bir seferde 8-10 yumurtayı hizalayın.
   NOT: Kızak kenarına dik olarak daha uzun eksenle hizalanmış yumurtaların (Şekil 3B), uzunlamasına ekseni kenara paralel olarak hizalanmış yumurtalara göre enjekte edilmesi daha kolaydır (Şekil 3C). Dik yöndeki yumurtalar (Şekil 3B) enjeksiyona daha iyi dayanabilir ve bu da daha yüksek hayatta kalma ile sonuçlanabilir.
2. Slaytı hizalanmış yumurtalarla bileşik mikroskop sahnesine yerleştirin. Depolandıkları %1 NaCl çözeltisini çıkarmak için bir parça tüy bırakmayan mendil kullanın.
3. Doldurulmuş enjeksiyon iğnesini bir mikromanipülatöre bağlı bir mikroenjektöre takın (bkz.
4. İğneyi, mikroenjektör üzerinde yüksek basınç ayarı kullanarak yumurta yüzeyine nazikçe sürtünerek açın (>5.000 hPa).
5. İğne açıldıktan sonra, iğnenin açılmasına bağlı olarak mikroenjektörün basıncını (1.000-2.500 hPa) azaltın.
   NOT: Küçük bir açıklık nispeten daha yüksek basınç gerektirirken, daha büyük bir açıklık daha düşük bir basınç gerektirecektir. Bu, enjekte edilen yapının hacmini kontrol etmek içindir. İğne açıklığının boyutuna bağlı olarak, enjeksiyon hacmi 1-5 pL arasında değişecektir.
6. Slayttaki tüm yumurtaları mümkün olduğunca çabuk 10°-15° açıyla enjekte edin ve slaytı nemli kağıtla kaplı bir Petri kabında hemen yüksek nem koşullarına getirin. Yumurtalar enjekte edilir edilmez kurumaya başlarlar.
   NOT: Bir seferde az sayıda yumurta enjekte etmek, enjeksiyon başarısını ve hayatta kalma olasılığını arttırır. İğneler embriyo reflü tarafından tıkanır. Uç hala keskinse, tıkanmış iğneleri temizlemek için, iğneyi slaytın kenarına eklenen% 1'lik küçük bir NaCl damlacığına hareket ettirin. Kılcal hareket, küçük tıkanıklığı yerinden çıkaracaktır. İğne zaten kör ise, değiştirin.

6. Embriyoların enjeksiyon sonrası bakımı

1. Enjekte edilen embriyoları içeren slaytı, nemli filtre kağıdı ile kaplı büyük bir Petri kabına yerleştirin.
   NOT: Yumurtaları en az 5-6 saat rahatsız etmemek çok önemlidir. Bu, enjeksiyon yarasının düzgün bir şekilde kapatılmasını sağlar. Enjeksiyon yarası çalkalandığında açılabilir ve sitoplazma sızmaya başlayabilir ve yumurta mortalitesine neden olabilir.
2. 5-6 saat sonra, enjekte edilen embriyolar eklenmiş şeffaf film pansumanına küçük bir damla DI suyu ekleyin. Bir boya fırçası kullanarak, yumurtaları yavaşça yerinden oynatın. Yumurtaları küçük bir Petri kabına (10 cm) aktarın ve DI suyuna batırın.
   NOT: Film pansumanı, enjeksiyonlardan sonra yumurtaların kolayca çıkarılmasını sağlar. Film sosuna bir su damlası eklendiği anda, yumurtalar su ile birlikte hareket etmeye başlayacaktır.
3. Yumurtaları suya batırın ve Petri kabını 27 ° C ve% >90 RH'de bir inkübatörde 6 litrelik plastik bir kutuya yerleştirin.
4. Yumurtaları düzenli olarak, ilk birkaç gün boyunca günlük olarak ve daha sonra larvalar yumurtadan çıkmaya başlayana kadar her 3-4 günde bir kontrol edin.
   NOT: Mikroenjeksiyonlar sırasında çok sayıda yumurta hasar görürse, bir hafta sonra DI suyunun nazikçe boşaltılması, ölü yumurtalarda mantar büyümesini önleyecektir.
5. Larvalar enjekte edilen embriyolardan yumurtadan çıkmaya başladığında (mevcut laboratuvar kurulumu için enjeksiyondan 21-25 gün sonra), günlük olarak kontrol edin ve yumurtadan çıkmış larvaları üstte bir ekran bulunan cam şişelere aktarın. Larvalar su altında yumurtadan çıkabilir ve ~ 1-2 hafta hayatta kalabilir.
6. Yumurtalara görünür bir fenotiple sonuçlanabilecek bir yapı enjekte edilirse larvaları⁴ kez tarayın.

Sonuçlar

Bu makalede I. scapularis için başarılı bir embriyo enjeksiyon protokolü anlatılmaktadır. Yumurtlayan dişiler, kısmen mumlanmış yumurtaların kurumasını önlemek için yüksek nemde tutuldu. Balmumu tabakası, gravid dişinin Gen'in organını (balmumu bezi) ablatarak kene embriyolarını enjekte etmek için çıkarıldı (Şekil 1A-E). Daha kısa boyunlu alüminosilikat cam iğneler kullandık (Şekil 2). ...

Tartışmalar

Bu, erken kene embriyolarını başarılı bir şekilde enjekte etmek için geliştirilen ilk protokoldür. Diğer köklü böcek modellerinde embriyo enjeksiyonu ile karşılaştırılabilir olan ~% 4 -% 8'lik bir hayatta kalma oranı elde edilmiştir⁵.

Bu ilk protokol olduğundan, bu protokolün bireysel kene türlerine göre daha da rafine edileceği ve uzmanlaşacağı tahmin edilmektedir. Özellikle, enjeksiyon zamanlaması, embriyogeneze, özellikle de selülizasy...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum silicate capillaries, with filament	Sutter instruments	AF100-64-10	Embryo injection
Benzalkonium chloride 50% in water, 25 g	TCI-America	B0414	Embryo treatment, 25 g is approximately 25 mL
Filter paper	Whatman	1001-090	Post-injection care
Forceps	Thomas Scientific	300-101	Gene`s organ manipulation
Lab Wipes	Genesee Scientific	88-115
Microloader tips	Eppendorf	930001007	Loading the pulled needles
Micromanipulator	Sutter instruments	ROE-200	Embryo injection
Microscopic slides- plain, ground edges	Genesee Scientific	29-100	Embryo alignment, ground edges are preferred, beveled edges could obscure the eggs from view
NaCl	Research Products International	S23020-500.0	Embryo treatment
Needle Puller	Sutter Instruments	P-1000
Permanent Double sided tape	Scotch	34-8716-3417-5	Embryo alignment
Petri plates	Genesee Scientific	32-107G	Post-injection care
Tegaderm/ Transparent film dressing	3M Healthcare	1628	Embryo alignment
Tungsten needles	Fine Science Tools	10130-10	Gene`s organ manipulation
Tungsten Wire	Amazon	B08DNT7ZK3	Gene`s organ manipulation
XenoWorks Digital Microinjector	Sutter instruments	MPC-200	Embryo injection