Técnica de injeção de embriões para edição de genes no carrapato de patas pretas, Ixodes scapularis

Resumo

O presente protocolo descreve um método de injeção de embriões de carrapatos. A injeção embrionária é a técnica preferida para manipulação genética para gerar linhas transgênicas.

Resumo

Os carrapatos podem transmitir vários patógenos virais, bacterianos e protozoários e, portanto, são considerados vetores de importância médica e veterinária. Apesar da crescente carga de doenças transmitidas por carrapatos, a pesquisa sobre carrapatos ficou atrás dos vetores de doenças de insetos devido aos desafios na aplicação de ferramentas de transformação genética para estudos funcionais à biologia única dos carrapatos. As intervenções genéticas vêm ganhando atenção para reduzir as doenças transmitidas por mosquitos. No entanto, o desenvolvimento de tais intervenções requer uma transformação estável da linha germinativa através da injeção de embriões. Tal técnica de injeção de embriões está faltando para queliceratos, incluindo carrapatos. Vários fatores, como uma camada externa de cera espessa em embriões de carrapatos, córion duro e alta pressão intra-oval, são alguns obstáculos que anteriormente impediam o desenvolvimento do protocolo de injeção embrionária em carrapatos. O presente trabalho superou esses obstáculos, e uma técnica de injeção de embriões para o carrapato de patas pretas, Ixodes scapularis, é descrita aqui. Esta técnica pode ser usada para fornecer componentes, como CRISPR / Cas9, para transformações estáveis da linha germinativa.

Introdução

Os carrapatos são vetores de importância médica e veterinária, capazes de transmitir uma variedade de patógenos virais, bacterianos, protozoários e nematoides ^1,2. No leste dos Estados Unidos, o carrapato-de-patas-pretas, Ixodes scapularis, é um importante vetor do patógeno da doença de Lyme (DL), a espiroqueta Borrelia burgdorferi. Mais de 400.000 casos de DL são relatados a cada ano nos Estados Unidos, tornando-se a principal doença infecciosa transmitida por vetores nos EUA¹. Além de B. burgdorferi, seis outros microrganismos são transmitidos por I. scapularis, incluindo quatro bactérias (Anaplasma phagocytophilum, B. mayonii, B. miyamotoi e Ehrlichia muris eauclarensis), um protozoário parasita (Babesia microti) e um vírus (Powassan virus), tornando esta espécie de carrapato uma grande preocupação de saúde pública³ . Embora as doenças transmitidas por carrapatos tenham se tornado mais prevalentes nos últimos anos, a pesquisa sobre carrapatos ficou para trás de outros vetores artrópodes, como mosquitos, devido à biologia única dos carrapatos e aos desafios associados à aplicação de ferramentas genômicas genéticas e funcionais ^4,5.

Técnicas de edição de genes, particularmente CRISPR/Cas9, agora tornaram os estudos de genômica funcional viáveis em organismos não modelo. Para a criação de mutações hereditárias em um organismo, a injeção embrionária continua sendo o método preferido para fornecer construções para alterar a linha germinativa 6,7,8,9. No entanto, até^{recentemente 4}, os ovos de carrapatos eram considerados muito difíceis ou mesmo impossíveis de injetar sem matar o embrião^10,11. Uma espessa camada de cera nos ovos, córion duro e alta pressão intra-oval foram alguns dos principais obstáculos que impediram a injeção de embriões em carrapatos. Adulto, alimentado com sangue I. scapularis depositar uma única ninhada de até 2.000 ovos¹² ao longo de 3-4 semanas (aproximadamente 100 ovos / dia). Os ovos são postos isoladamente, e cada ovo é revestido com cera que é secretada por saliências ou "chifres" do órgão glandular de Gené^13,14,15 da mãe. Esta cera protege os ovos da dessecação e contém compostos antimicrobianos¹⁵. Para injetar com sucesso ovos de carrapatos, é importante remover a camada de cera, suavizar o córion e dessecar os ovos para diminuir a pressão intraoval para que a injeção não danifique irreversivelmente o ovo. Compreendendo a importância crítica das injeções de embriões para o sucesso da transformação da linha germinativa, é desenvolvido um protocolo para I. scapularis, que pode ser usado para fornecer uma construção CRISPR/Cas9 e gerar mutações estáveis na linha germinativa⁴. Além de sua contribuição para a pesquisa de I. scapularis, este protocolo também poderia ser otimizado para outras espécies de carrapatos.

Protocolo

Ixodes scapularis adultos foram comprados da Oklahoma State University (OSU) ou criados na Universidade de Nevada, Reno (UNR) (protocolo IACUC # 21-001-1118).

1. Preparação de carrapatos fêmeas para a coleta de embriões

NOTA: Para coletar ovos de idade apropriada, é importante sincronizar a postura de ovos. Embora as pistas de postura de ovos em carrapatos permaneçam obscuras, sob as condições insetárias padrão (temperatura de 27 °C e umidade relativa (UR) de >90%), as fêmeas de I. scapularis começam a botar ovos aproximadamente 8 dias após o descolamento do hospedeiro. Esta linha do tempo pode ser alongada armazenando fêmeas repletas a 4 °C. Armazenamos fêmeas alimentadas com sangue a 4 °C até 8 semanas sem qualquer efeito negativo na postura de ovos. Essas condições podem precisar ser modificadas para cada insetário.

1. Armazenar todas as fêmeas repletas a 4 °C com >90% de UR numa caixa de plástico de 6 litros forrada com papel de filtro húmido até ser utilizada para microinjecções.
2. Uma semana antes das injecções, transferir as fêmeas de 4 °C para uma incubadora de 27 °C para o início da postura de ovos.
3. Quando as fêmeas começarem a botar ovos (3-4 dias depois de movê-los para 27 °C), remova todos os ovos usando um pincel de ponta fina e prepare as fêmeas para a ablação do órgão de Gené (glândula de cera).
   NOTA: O órgão de Gené se estende da área entre o escudo e o capítulo (base dorsal das partes bucais), as partes bucais se dobram sobre a superfície corporal ventral (paralela à superfície) e o órgão estendido do gene reveste os ovos assim que os ovos são postos (Figura 1). Os ovos colocados antes da remoção do órgão de Gené ou esvaziamento da cera terão um revestimento de cera e não são adequados para injeções e devem ser descartados.
4. Para remover ou esvaziar o órgão de Gené, use argila para posicionar a fêmea ingurgitada em uma lâmina de vidro sob um microscópio orientado para que as partes bucais sejam visíveis nos lados ventral e dorsal (Figura 1B,C).
   1. Cuidadosamente cutuque a área exatamente entre o escudo e as partes bucais usando pinça fina e agulhas de tungstênio feitas em laboratório usando fio de tungstênio seguindo um protocolo publicado anteriormente¹⁶ (as agulhas também podem ser compradas comercialmente e anexadas a uma sonda de microdissecação, consulte Tabela de Materiais).
   2. Trabalhando o caminho para dentro com a agulha de tungstênio, puxe a glândula de cera para fora (Figura 1D,E). Pode levar vários minutos para remover a glândula. Limpe qualquer secreção de cera líquida usando lenços umedecidos de laboratório.
      NOTA: A glândula também pode ser removida do lado ventral logo abaixo das partes bucais; alcançando as costas em direção ao escudo com uma agulha e pinça. A aplicação de cola de silício ao redor das partes bucais também bloqueia a eversão de órgãos de Gene e pode ser usada em vez de remover ou esvaziar a cera (comunicação pessoal com o Dr. Ladislav Simo, INRAE, França). Os carrapatos ingurgitados não permanecerão em fita dupla face. Usar argila para "enrolar" o carrapato ajuda a mantê-los no lugar durante a manipulação. Use fórceps para segurar o carrapato e a agulha de tungstênio para dissecação. A parte ventral é mais fácil de perfurar com uma agulha e preferida pelos autores.
5. Para esvaziar a glândula, organize o carrapato gravídico conforme mencionado na etapa 1.4. Puncione cuidadosamente a área atrás das partes bucais no lado dorsal e aplique pressão no lado ventral usando pinça.
   NOTA: Alternativamente, não é necessário remover a glândula de cera; esvaziar a glândula de cera durará vários dias. As fêmeas que põem ovos têm uma área branca ao redor das partes da boca que indica a localização da glândula de cera e pode ser usada como referência.
   1. Coloque a borda de uma limpeza de laboratório sem fiapos e remova a cera líquida que sai do local da punção. Certifique-se de evitar a secreção de hemolinfa, que é um líquido claro em comparação com a cera viscosa ligeiramente amarelada. Pode levar de 5 a 10 minutos até que a maior parte da cera seja removida.
6. Após a manipulação, coloque as fêmeas em uma incubadora a 27 °C (>90% UR) e deixe-as se recuperar por 1-2 dias.
   NOTA: As fêmeas tratadas geralmente levam 1-2 dias para se recuperar e começar a botar ovos novamente.
7. Quando as fêmeas começarem a botar ovos novamente, use um pincel fino para coletar ovos recém-depositados (0-18 h após a postura dos ovos) e coloque-os em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
   NOTA: Se usar ovos da mesma fêmea ao longo do tempo, este procedimento deve ser repetido após 4-5 dias de postura de ovos, se as glândulas não foram removidas.

2. Tratamento embrionário para microinjeções

1. Adicionar ~200 μL (ou volume suficiente para cobrir os ovos, dependendo do número de ovos) de 5% (peso/volume) de cloreto de benzalcónio/água (ver Tabela de Materiais) no tubo contendo ovos de 0-18 h de idade. Gire suavemente os ovos com o pincel por 5 minutos para evitar que os ovos se depositem no fundo do tubo (para detalhes, ver Sharma et ^al.4). Remova o sobrenadante usando uma micropipeta, deixando os ovos para trás em tubo.
   CUIDADO: O cloreto de benzalcónio é corrosivo para a pele e os olhos, use luvas e proteção ocular.
2. Adicione ~200 μL de água destilada (DI) ao tubo que contém ovos, gire com um pincel e remova a água do tubo de microcentrífuga usando uma micropipeta. Repita a lavagem com água DI mais uma vez.
3. Após a lavagem com água DI, adicione ~200 μL de cloreto de sódio (NaCl) a 5% (p/v) e gire suavemente com um pincel por 5 min. Retire a solução do tubo após 5 min e lave os ovos duas vezes com água DI.
4. Adicionar ~100 μL de solução de NaCl a 1% (p/v) no tubo de microcentrífuga contendo ovos. Manter os ovos em solução de NaCl a 1% (p/v) até que sejam utilizados para preparações injetáveis.
5. Inicie as microinjeções após cerca de uma hora. Esta linha do tempo ajuda na dessecação adequada dos ovos e evita que eles estourem.
   NOTA: Os ovos podem ser mantidos em solução de NaCl a 1% (p/v) por 7-8 h sem afetar significativamente a sobrevida. Se os ovos forem difíceis de injetar ou estourar, os ovos não são dessecados o suficiente e podem ser tratados com 5% (p/v) de NaCl por mais 5 minutos.

3. Preparação de agulhas de injeção

1. Insira um vidro capilar de aluminossilicato (com filamento, consulte Tabela de Materiais) no puxador da agulha seguindo as instruções do fabricante.
2. Ajuste o extrator da agulha para as seguintes configurações: Calor: 575, Puxar: 20, Velocidade: 50, Tempo: 200 e Pressão: 700.
3. Ative a função de tração do extrator da agulha e repita o processo para agulhas adicionais.
4. Armazene as agulhas puxadas colando-as em linhas de argila do modelador em uma placa de Petri limpa.
5. Carregue a agulha com a mistura de injeção usando uma ponta de micro carregador (consulte Tabela de materiais).
   NOTA: A comparação das agulhas utilizadas para injeção de embriões de carrapatos e mosquitos é mostrada na Figura 2.

4. Configuração da lâmina para as microinjeções

1. Usando fita adesiva dupla face, cole duas lâminas de microscópio de vidro juntas, deixando um espaço de cerca de 0,5 cm para apoiar o alinhamento dos ovos e impedi-los de rolar durante as injeções (Figura 3A).
2. Aplique um pedaço de curativo de filme transparente (consulte Tabela de materiais) na fita dupla face no espaço entre os slides. Certifique-se de alinhar o curativo do filme perfeitamente com o vão.

5. Microinjeções embrionárias

1. Alinhe de 8 a 10 ovos de cada vez na configuração do slide (acima) usando um pincel de pelo único.
   NOTA: Os ovos alinhados com o eixo mais longo perpendicular (Figura 3B) à borda deslizante são mais fáceis de injetar do que os ovos cujo eixo longitudinal está alinhado paralelamente à borda (Figura 3C). Ovos na orientação perpendicular (Figura 3B) podem suportar melhor a injeção, resultando em maior sobrevida.
2. Coloque a lâmina com ovos alinhados no estágio de um microscópio composto. Use um pedaço de limpeza sem fiapos para remover a solução de NaCl a 1% na qual eles estão armazenados.
3. Ligue a agulha de injeção cheia a um microinjetor ligado a um micromanipulador (ver Tabela de Materiais).
4. Abra a agulha esfregando-a suavemente contra a superfície do ovo usando uma configuração de alta pressão no microinjetor (>5.000 hPa).
5. Depois que a agulha for aberta, reduza a pressão (1.000-2.500 hPa) do microinjetor, dependendo da abertura da agulha.
   NOTA: Uma abertura pequena exigirá uma pressão comparativamente maior, enquanto uma abertura maior exigirá uma pressão mais baixa. Isto é para controlar o volume da construção injetada. Dependendo do tamanho da abertura da agulha, o volume de injeção irá variar de 1-5 pL.
6. Injete todos os ovos na lâmina em um ângulo de 10°-15° o mais rápido possível e mova imediatamente a lâmina para condições de alta umidade em uma placa de Petri forrada com papel úmido. Assim que os ovos são injetados, eles começam a dessecar.
   NOTA: Injetar um pequeno número de ovos de cada vez aumenta o sucesso da injeção e a probabilidade de sobrevivência. As agulhas ficam entupidas pelo refluxo embrionário. Se a ponta ainda estiver afiada, para limpar as agulhas entupidas, mova a agulha para uma pequena gota de 1% de NaCl adicionada à borda da lâmina. A ação capilar desalojará o pequeno tamanco. Se a agulha já estiver contundente, troque-a.

6. Cuidados pós-injeção de embriões

1. Coloque a lâmina contendo embriões injetados em uma placa de Petri grande forrada com papel de filtro úmido.
   NOTA: É fundamental não perturbar os ovos por pelo menos 5-6 h. Isso permite que a ferida de injeção sele corretamente. A ferida injetável pode se abrir quando agitada e o citoplasma pode começar a escorrer, resultando em mortalidade por ovos.
2. Após 5-6 h, adicione uma pequena gota de água DI ao curativo de filme transparente com embriões injetados anexados. Usando um pincel, desloque suavemente os ovos. Transfira os ovos para uma pequena placa de Petri (10 cm) e submerja-os em água DI.
   NOTA: O curativo de filme permite a fácil remoção de ovos após injeções. No momento em que uma gota de água é adicionada ao curativo do filme, os ovos começarão a se mover junto com a água.
3. Mantenha os ovos submersos em água e coloque a placa de Petri em uma caixa de plástico de 6 litros em uma incubadora a 27 °C e >90% UR.
4. Verifique os ovos regularmente, diariamente nos primeiros dias e, em seguida, a cada 3-4 dias até que as larvas comecem a eclodir.
   NOTA: Se um grande número de ovos for danificado durante as microinjeções, drenar suavemente a água DI após uma semana impedirá o crescimento de fungos nos ovos mortos.
5. Quando as larvas começarem a eclodir dos embriões injetados (21-25 dias após a injeção para a configuração de laboratório atual), verifique-as diariamente e transfira as larvas eclodidas para frascos de vidro com uma tela no topo. As larvas podem eclodir debaixo d'água e sobreviver por ~ 1-2 semanas.
6. Rastreie as larvas⁴ se os ovos foram injetados com uma construção que pode resultar em um fenótipo visível.

Resultados

Um protocolo de injeção embrionária bem-sucedido para I. scapularis é descrito neste artigo. As fêmeas que põem ovos foram mantidas em alta umidade para evitar a dessecação de ovos parcialmente encerados. A camada de cera foi removida para injetar embriões de carrapatos por ablação do órgão do gene (glândula de cera) da fêmea gravídica (Figura 1A-E). Foram utilizadas agulhas de vidro de aluminossilicato com pescoço mais curto (

Discussão

Este é o primeiro protocolo desenvolvido para injetar embriões de carrapatos precoces com sucesso. Uma taxa de sobrevivência de ~4%-8% foi alcançada, o que é comparável à injeção de embriões em outros modelos de insetos bem estabelecidos⁵.

Como este é o protocolo inicial, prevê-se que este protocolo seja ainda mais refinado e especializado para espécies individuais de carrapatos. Em particular, o tempo de injeção varia de espécie para espécie, dependend...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum silicate capillaries, with filament	Sutter instruments	AF100-64-10	Embryo injection
Benzalkonium chloride 50% in water, 25 g	TCI-America	B0414	Embryo treatment, 25 g is approximately 25 mL
Filter paper	Whatman	1001-090	Post-injection care
Forceps	Thomas Scientific	300-101	Gene`s organ manipulation
Lab Wipes	Genesee Scientific	88-115
Microloader tips	Eppendorf	930001007	Loading the pulled needles
Micromanipulator	Sutter instruments	ROE-200	Embryo injection
Microscopic slides- plain, ground edges	Genesee Scientific	29-100	Embryo alignment, ground edges are preferred, beveled edges could obscure the eggs from view
NaCl	Research Products International	S23020-500.0	Embryo treatment
Needle Puller	Sutter Instruments	P-1000
Permanent Double sided tape	Scotch	34-8716-3417-5	Embryo alignment
Petri plates	Genesee Scientific	32-107G	Post-injection care
Tegaderm/ Transparent film dressing	3M Healthcare	1628	Embryo alignment
Tungsten needles	Fine Science Tools	10130-10	Gene`s organ manipulation
Tungsten Wire	Amazon	B08DNT7ZK3	Gene`s organ manipulation
XenoWorks Digital Microinjector	Sutter instruments	MPC-200	Embryo injection