Purificación de polisomas a partir de nódulos simbióticos de soja

Resumen

Este protocolo describe un método para la purificación de polisomas eucariotas a partir de nódulos de soja intactos. Después de la secuenciación, se pueden utilizar tuberías estándar para el análisis de la expresión génica para identificar genes expresados diferencialmente a nivel de transcriptoma y translatomo.

Resumen

El objetivo de este protocolo es proporcionar una estrategia para estudiar el translatomo eucariota del nódulo simbiótico de soja (Glycine max). Este documento describe métodos optimizados para aislar polirribosomas derivados de plantas y sus ARNm asociados para ser analizados mediante secuenciación de ARN. En primer lugar, los lisados citoplasmáticos se obtienen mediante homogeneización en condiciones de preservación de polisomas y ARN a partir de nódulos de soja enteros congelados. Luego, los lisados se eliminan por centrifugación a baja velocidad, y el 15% del sobrenadante se usa para el aislamiento de ARN total (TOTAL). El lisado eliminado restante se utiliza para aislar polisomas por ultracentrifugación a través de un cojín de sacarosa de dos capas (12% y 33,5%). El ARNm asociado a polisomas (PAR) se purifica a partir de gránulos polisomales después de la resuspensión. Tanto TOTAL como PAR se evalúan mediante electroforesis capilar altamente sensible para cumplir con los estándares de calidad de las bibliotecas de secuenciación para RNA-seq. Como ejemplo de una aplicación posterior, después de la secuenciación, se pueden utilizar tuberías estándar para el análisis de la expresión génica para obtener genes expresados diferencialmente a nivel de transcriptoma y translatomo. En resumen, este método, en combinación con RNA-seq, permite estudiar la regulación traslacional de los ARNm eucariotas en un tejido complejo como es el nódulo simbiótico.

Introducción

Las plantas leguminosas, como la soja (Glycine max), pueden establecer simbiosis con bacterias específicas del suelo llamadas rizobios. Esta relación mutualista provoca la formación de nuevos órganos, los nódulos simbióticos, en las raíces de las plantas. Los nódulos son los órganos de la planta que albergan las bacterias y consisten en células huésped cuyo citoplasma está colonizado con una forma especializada de rizobios llamados bacteroides. Estos bacteroides catalizan la reducción del nitrógeno atmosférico (_N2) en amoníaco, que se transfiere a la planta a cambio de carbohidratos ^1,2.

Aunque esta simbiosis fijadora de nitrógeno es una de las simbiosis planta-microbio mejor estudiadas, quedan muchos aspectos por comprender mejor, como cómo las plantas sometidas a diferentes condiciones de estrés abiótico modulan su interacción con su pareja simbiótica y cómo esto afecta el metabolismo de los nódulos. Estos procesos podrían entenderse mejor analizando el translatomo de nódulos (es decir, el subconjunto de ARN mensajeros [ARNm] traducidos activamente). Los polirribosomas o polisomas son complejos de múltiples ribosomas asociados con el ARNm, comúnmente utilizados para estudiar la traducción³. El método de perfilado de polisomas consiste en el análisis de los ARNm asociados a polisomas y ha sido utilizado con éxito para estudiar los mecanismos posttranscripcionales que controlan la expresión génica que ocurre en diversos procesos biológicos ^4,5.

Históricamente, el análisis de expresión del genoma se ha centrado principalmente en determinar la abundancia de ARNm 6,7,8,9. Sin embargo, existe una falta de correlación entre la transcripción y los niveles de proteínas debido a las diferentes etapas de la regulación posttranscripcional de la expresión génica, particularmente la traducción^10,11,12. Además, no se ha observado dependencia entre los cambios a nivel del transcriptoma y los que ocurren a nivel del translatomo¹³. El análisis directo del conjunto de ARNm que se están traduciendo permite una medición más precisa y completa de la expresión génica celular (cuyo punto final es la abundancia de proteínas) que la obtenida cuando sólo se analizan los niveles de ARNm^14,15,16.

Este protocolo describe cómo los polisomas derivados de plantas se purifican a partir de nódulos de soja intactos mediante centrifugación diferencial a través de un cojín de sacarosa de dos capas (Figura 1). Sin embargo, dado que los ribosomas derivados de bacteroides también están presentes en los nódulos, se purifica una mezcla de ribosomas y especies de ARN, aunque los eucariotas representan la fracción principal (90%-95%). También se describe el posterior aislamiento, cuantificación y control de calidad del ARN (Figura 1). Este protocolo, en combinación con RNA-seq, debería proporcionar resultados experimentales sobre la regulación traslacional de los ARNm eucariotas en un tejido complejo como el nódulo simbiótico.

Figura 1: Resumen esquemático de la metodología propuesta para la purificación de polisomas eucariotas a partir de nódulos simbióticos. El esquema ofrece una visión general de los pasos seguidos en el protocolo desde (1) crecimiento de plantas y (2) recolección de nódulos hasta (3) preparación de los extractos citosólicos, (3) obtención de muestras TOTAL y (4) muestras PAR, y (5) extracción de ARN y control de calidad. Abreviaturas: PEB = tampón de extracción de polisomas; RB = tampón de resuspensión; TOTAL = ARN total; PAR = ARNm asociado a polisomas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocolo

1. Crecimiento de plantas e inoculación de rizobios

1. Para generar los nódulos requeridos, siembre las semillas de soja de elección en el sustrato seleccionado en una cámara de crecimiento bajo condiciones controladas.
   NOTA: En este protocolo, las semillas se sembraron en una botella de plástico de 0,5 L llena de una mezcla de arena: vermiculita (1:1). La cámara de crecimiento se estableció con una temperatura de ciclo día/noche de 28 °C / 20 °C, respectivamente, y un fotoperíodo de luz/oscuridad de 16 h/8 h, respectivamente. La intensidad de radiación fotosintéticamente activa fue de 620 μmol·m−²·s⁻¹.
2. Prepare por adelantado el medio líquido de manitol de extracto de levadura (YEM) (consulte la Tabla de materiales). Autoclave el medio.
3. El mismo día de la siembra de semillas, inocular un matraz que contenga 100 ml de YEM con la cepa Bradyrhizobium elkanii U1302. Incubar el matraz a 28 °C en un agitador orbital a 100 rpm.
   1. Deje que los rizobios crezcan durante 2 días e inocule las plántulas con 2 ml del cultivo.

2. Tratamiento del déficit hídrico (opcional)

NOTA: Este protocolo describe el tratamiento del déficit hídrico de las plantas de soja. Esta parte puede ser cambiada u omitida por completo dependiendo de la pregunta experimental en cuestión.

1. Cultive las plántulas de soja durante 19 días (etapa de desarrollo V2-3) sin restricción de agua. Mantenga el sustrato a su capacidad de campo con B&D-medium¹⁷ suplementado con 0,5 mM KNO₃.
2. El día 20, retirar el riego.
   NOTA: Aquí, el contenido de agua se midió diariamente por gravimetría (contenido gravimétrico de agua) durante los períodos de crecimiento y déficit de agua.
3. Mida la conductancia estomática por triplicado diariamente en la superficie abaxial de la hoja con un porómetro, según las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales), desde el día 20 hasta el final del período de déficit hídrico.
   NOTA: El final del período de déficit hídrico se determinó individualmente para cada planta cuando el valor de conductancia estomática fue aproximadamente del 50% del obtenido el día 20 de la siembra.

3. Recolección de nódulos

1. Recoja el nitrógeno líquido en un recipiente limpio y etiquete los tubos de 15 ml (uno para cada planta).
   PRECAUCIÓN: Manipule el nitrógeno líquido con guantes criogénicos, protectores faciales y gafas de seguridad.
2. Recupere cada planta individualmente. Cortar y desechar la parte aérea. Lave bien la raíz con agua para eliminar cualquier sustrato restante.
3. Separe cada nódulo de la raíz y recójalos en un tubo preenfriado de 15 ml. Congele los tubos a presión y guárdelos a -80 °C.

4. Preparación de extractos citosólicos

NOTA: El objetivo final de este protocolo es obtener ARN total (TOTAL) y ARN asociado a polisomas (PAR) de alta calidad. Por lo tanto, trabaje en condiciones que eviten la degradación del ARN, manteniendo siempre las muestras a 4 °C y utilizando equipos y soluciones de laboratorio libres de RNasa. A menos que se especifique, todas las soluciones se preparan con agua ultrapura estéril.

1. Preparación de soluciones de la reserva reguladora
   1. Preparar las soluciones madre esterilizables en autoclave enumeradas en la Tabla 1, esterilizarlas en autoclave durante 15 minutos y mantenerlas en RT.
   2. Preparar las soluciones madre esterilizables por filtración enumeradas en la Tabla 1, esterilizarlas por filtración y mantenerlas a −20 °C.
2. Prepare el tampón de extracción de polisomas (PEB, ver Tabla 1) y manténgalo en hielo.
   NOTA: Los volúmenes dados son para seis muestras.
3. Enfriar la centrífuga a 4 °C y colocar 2 ml de tubos de microcentrífuga sobre hielo.
4. Pesar aproximadamente 0,2 g de nódulos intactos en una fuente de pesaje y transferirlos a un tubo preenfriado de 2 ml.
   NOTA: Realice este paso rápidamente para evitar la descongelación de las muestras. Alternativamente, se puede utilizar un volumen de nódulo estimado de 0,4-0,5 ml en lugar de 0,2 g.
5. Agregue 1.2 ml de PEB, deje que la muestra se descongele durante 2 minutos y homogeneice con un molinillo de tejido hasta la interrupción y homogeneización completas de los nódulos.
   NOTA: Asegúrese de moler los nódulos una vez descongelados, ya que serán lo suficientemente suaves como para ser fácilmente interrumpidos con molinos de tejido (consulte la Tabla de materiales) en tubos de microcentrífuga. Los nódulos congelados son difíciles de moler. Además, se recomienda colocar los tubos en un refrigerador de sobremesa (0 ° C) para una homogeneización adecuada mientras se mantienen las muestras frescas.
6. Incubar las muestras en hielo con una agitación suave durante 10 minutos o hasta que todas las muestras hayan sido procesadas.
7. Centrifugar a 16.000 × g durante 15 min a 4 °C para granular los residuos. Recupere el sobrenadante y repita el paso de centrifugación.
8. Recuperar cuidadosamente el extracto citosólico clarificado y transferir una alícuota de 200 μL a un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 ml para el aislamiento TOTAL (muestras TOTAL; ver sección 7).

5. Preparación de cojines de sacarosa

NOTA: Este protocolo utiliza un cojín de sacarosa de dos capas (12% y 33.5%) en tubos de ultracentrífuga de 13.2 ml (consulte la Tabla de materiales). Todas las soluciones se preparan con agua ultrapura estéril.

1. Prepare las soluciones caldo de sacarosa y sal.
   1. Preparar 100 mL de solución de sacarosa 2 M (68,5%, Tabla 1).
   2. Prepare una solución salina 10x (Tabla 1).
2. Prepare las dos capas del cojín de sacarosa como se describe en la Tabla 2. Ver Tabla 1 para la composición de las soluciones madre de antibióticos (CHX y CHL).
   NOTA: Los volúmenes dados son para seis cojines.
3. Vierta 4,5 ml de la capa de sacarosa al 33,5% en los tubos de la centrífuga. Luego, agregue 4.5 ml de la capa al 12% con cuidado y lentamente con una micropipeta P1000. Poner los tubos en hielo hasta la adición del extracto citosólico clarificado.

6. Purificación de polisomas

1. Cargar 1 ml del extracto citosólico clarificado (paso 4.8) sobre el cojín de sacarosa pipeteando cuidadosamente sobre la pared lateral del tubo.
2. Transfiera los tubos de la ultracentrífuga a cucharones preenfriados y centrífuga a 217.874 × g (35.000 rpm en el rotor de referencia [consulte la tabla de materiales]) durante 2 h a 4 °C.
3. Desechar el extracto citosólico restante y el cojín de sacarosa, y resuspender el pellet polisómico con 200 μL de RB preenfriado (previamente preparado según la Tabla 1).
4. Incubar durante 30 minutos en hielo y luego transferir la resuspensión polisomal a tubos preenfriados de 1,5 ml. Proceder con la extracción de ARN (muestras PAR).

7. Extracción de ARN y control de calidad

NOTA: Este paso se realiza para las muestras TOTAL (paso 4.8) y PAR (paso 6.4).

1. Preparar EtOH al 75% con agua ultrapura estéril y enfriar a -20 °C. Además, enfriar el cloroformo y el isopropanol a -20 °C.
2. Homogeneizar las muestras con 750 μL del reactivo de aislamiento de ARN e incubar durante 5 min a RT.
3. Añadir 200 μL de cloroformo frío y agitar los tubos vigorosamente durante 15 s. Incubar en RT durante 10 min.
4. Centrifugar a 12.000 × g durante 15 min a 4 °C para la separación de fases. Transfiera 500 μL de la fase acuosa superior a un tubo limpio sin alterar la fase orgánica rosada, y agregue 375 μL de isopropanol frío y 0,5 μL de glucógeno libre de RNasa (consulte la Tabla de materiales). Mezclar bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
   NOTA: El glucógeno es un portador utilizado como coprecipitante para aumentar la recuperación de ácidos nucleicos de la precipitación de alcohol.
5. Incubar la mezcla durante 10 min a 4 °C y centrifugar a 12.000 × g durante 15 min. Deseche el sobrenadante.
6. Lavar el precipitado de ARN con 1 mL de EtOH frío al 75%. Mezclar por vórtice breve.
   NOTA: En este punto, las muestras se pueden almacenar a -20 °C durante la noche.
7. Centrifugar a 7.500 × g durante 5 min a 4 °C, retirar con cuidado el sobrenadante con una micropipeta y secar al aire el pellet de ARN.
8. Disolver el pellet en 50 μL de agua libre de RNasa e incubar a 65 °C durante 5 min.
9. Evaluar la concentración e integridad de ARN con electroforesis capilar altamente sensible¹⁸ (ver la Tabla de materiales) y/o electroforesis en un gel de agarosa libre de RNasa al 2%¹⁹ (ver la Tabla de materiales).
   NOTA: Si las muestras de ARN no se van a utilizar inmediatamente o se van a enviar a la instalación de secuenciación para la preparación de la biblioteca de ARN-seq, se recomienda utilizar EtOH para precipitarlas.

8. Precipitación de ARN

1. Enfriar la centrífuga y EtOH a 4 °C.
2. Preparar acetato de sodio 3 M.
3. Prepare EtOH al 70% con agua ultrapura estéril y enfríela a -20 °C.
4. Estimar el volumen de la muestra. Agregue 0.1 volúmenes de acetato de sodio 3 M, 3 volúmenes de EtOH frío y 0.5 μL de glucógeno libre de RNasa. Homogeneizar.
5. Dejar a -20 °C hasta que sea necesario.
   NOTA: Las muestras precipitadas de ARN pueden almacenarse hasta 1 año a −80 °C.

9. Tubería estándar para el análisis de la expresión génica

1. Realice un promedio de 40 millones de lecturas de extremo emparejado de Illumina, con una longitud de lectura >100 pb, para un análisis confiable de datos de transcriptoma y translatomo.
   NOTA: El análisis de datos estándar de RNA-seq incluye los siguientes pasos 9.2-9.5.
2. Realice inspecciones de calidad de lectura utilizando FastQC (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) o MultiQC²⁰ multimuestra.
3. Retire el adaptador y las secuencias de baja calidad utilizando Trimmomatic²¹, BBDuk (http://jgi.doe.gov/data-and-tools/bb-tools/), cutadapt 22, hoz²³ o Trim Galore (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/), entre otros.
4. Si se dispone de un genoma de referencia para la especie, realice un mapeo de lectura contra la referencia, seguido de la cuantificación de la abundancia, utilizando Bowtie2 24, TopHat2²⁵ o Salmon²⁶, y featureCounts²⁷, además de otras herramientas de código abierto.
5. Realizar análisis estadísticos para la identificación diferencial de genes expresados utilizando edgeR²⁸, DESeq2²⁹ o limma³⁰, entre otros.
   NOTA: Este software de código abierto se puede utilizar localmente, a través de la línea de comandos. Alternativamente, pueden ser operados a través de un navegador web en un servidor público, como Galaxy³¹ o GEOexplorer³², que ofrecen una interfaz gráfica de usuario, por lo que no se requieren conocimientos de línea de comandos para su uso.

Resultados

La evaluación de la cantidad y calidad de las fracciones TOTAL y PAR purificadas con el procedimiento mencionado anteriormente es clave para determinar su éxito, ya que para la mayoría de las aplicaciones posteriores, como la secuenciación de ARN, las muestras de alta calidad son fundamentales para la preparación y secuenciación de bibliotecas. Además, la integridad de las moléculas de ARN permite la captura de una instantánea del perfil de expresión génica en el momento de la recolección de la muestra

Discusión

El estudio de la regulación de la expresión génica a nivel traslacional es fundamental para comprender mejor los diferentes procesos biológicos, ya que el punto final de la expresión génica celular es la abundancia de proteínas^13,14. Esto se puede evaluar analizando el translatomo del tejido u organismo de interés para el cual se debe purificar la fracción polisomal y analizar sus ARNm asociados 3,4,34,35,36.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plant growth and rhizobia inoculation
Orbital shaker	Daihan Scientific		Model SHO-1D
YEM-medium	Amresco	J850 (yeast extract) 0122 (mannitol)
Water deficit treatment
KNO3	Merck	221295
Porometer	Decagon Device		Model SC-1
Scalpel
Preparation of cytosolic extracts
Brij L23	Sigma-Aldrich	P1254
Centrifuge	Sigma		Model 2K15
Chloranphenicol	Sigma-Aldrich	C0378
Cycloheximide	Sigma-Aldrich	C7698
DOC	Sigma-Aldrich	30970
DTT	Sigma-Aldrich	D9779
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
Igepal CA 360	Sigma-Aldrich	I8896
KCl	Merck	1.04936
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266
Plastic tissue grinder	Fisher Scientific	12649595
PMSF	Sigma-Aldrich	P7626
PTE	Sigma-Aldrich	P2393
Tris	Invitrogen	15504-020
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379
Weighing dish	Deltalab	1911103
Preparation of sucrose cushions
Sucrose	Invitrogen	15503022
SW 40 Ti rotor	Beckman-Coulter
Ultracentrifuge	Beckman-Coulter		Optima L-100K
Ultracentrifuge tubes	Beckman-Coulter	344059	13.2 mL tubes
RNA extraction and quality control
Agarose	Thermo scientific	R0492
Bioanalyzer	Agilent		Model 2100. Eukaryote total RNA nano assay
Chloroform	DI	41191
Ethanol	Dorwil	UN1170
Isopropanol	Mallinckrodt	3032-06
Glycogen	Sigma	10814-010
TRIzol LS	Ambion	102960028
Miscellaneous
Falcon tubes 15 mL	Biologix	10-0152
Filter tips 10 µL	BioPointe Scientific	321-4050
Filter tips 1000 µL	BioPointe Scientific	361-1050
Filter tips 20 µL	BioPointe Scientific	341-4050
Filter tips 200 µL	Tarsons	528104
Microcentrifuge tubes 1.5 mL	Tarsons	500010-N
Microcentrifuge tubes 2.0 mL	Tarsons	500020-N
Sequencing company	Macrogen
Sterile 250 mL flask	Marienfeld	4110207