טיהור פוליזום מגושים סימביוטיים של פולי סויה

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה לטיהור פוליזום אאוקריוטי מגושי סויה שלמים. לאחר הריצוף, ניתן להשתמש בצינורות סטנדרטיים לניתוח ביטוי גנים כדי לזהות גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי ברמות השעתוק והטרנסלטום.

Abstract

מטרת פרוטוקול זה היא לספק אסטרטגיה לחקר הטרנסלטום האאוקריוטי של הגולם הסימביוטי של פולי הסויה (גליצין מקס). מאמר זה מתאר שיטות הממוטבות לבידוד פוליריבוזומים שמקורם בצמחים ואת ה-mRNA הקשורים אליהם לניתוח באמצעות ריצוף RNA. ראשית, ליזאטים ציטופלסמיים מתקבלים באמצעות הומוגניזציה בתנאים משמרים פוליזום ורנ"א מגושים שלמים וקפואים של פולי סויה. לאחר מכן, הליזטים מנוקים על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה, ו-15% מהסופר-נאטנט משמש לבידוד RNA כולל (TOTAL). הליזאט המנוקה הנותר משמש לבידוד פוליזומים על ידי אולטרה-צנטריפוגציה באמצעות כרית סוכרוז דו-שכבתית (12% ו-33.5%). mRNA הקשור לפוליזום (PAR) מטוהר מכדורים פוליסומליים לאחר חידוש. הן TOTAL והן PAR מוערכים על ידי אלקטרופורזה נימית רגישה ביותר כדי לעמוד בתקני האיכות של ספריות ריצוף עבור RNA-seq. כדוגמה ליישום במורד הזרם, לאחר ריצוף, ניתן להשתמש בצינורות סטנדרטיים לניתוח ביטוי גנים כדי לקבל גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי ברמות השעתוק והטרנסלטום. לסיכום, שיטה זו, בשילוב עם RNA-seq, מאפשרת לחקור את הוויסות התרגומי של mRNA אאוקריוטי ברקמה מורכבת כגון הגולם הסימביוטי.

Introduction

צמחים קטניים, כגון סויה (גליצין מקס), יכולים לבסס סימביוזה עם חיידקי אדמה ספציפיים הנקראים ריזוביה. מערכת יחסים הדדית זו מעוררת את היווצרותם של איברים חדשים, הגושים הסימביוטיים, על שורשי הצמח. הגושים הם האיברים הצמחיים המארחים את החיידקים ומורכבים מתאים מארחים שהציטופלסמה שלהם מיושבת עם צורה מיוחדת של ריזוביה הנקראת חיידקים. חיידקים אלה מזרזים את הפחתת החנקן האטמוספרי (N 2) לאמוניה, אשר מועבר לצמח בתמורה לפחמימות ^1,2.

אף על פי שסימביוזה זו של קיבוע חנקן היא אחת הסימביוזה בין צמחים למיקרובים הנחקרים ביותר, היבטים רבים עדיין צריכים להיות מובנים טוב יותר, כגון כיצד צמחים הנתונים לתנאי עקה אביוטיים שונים מווסתים את האינטראקציה שלהם עם השותף הסימביוטי שלהם וכיצד זה משפיע על חילוף החומרים של הגולם. ניתן היה להבין טוב יותר תהליכים אלה על ידי ניתוח טרנסלטום הגולם (כלומר, תת-הקבוצה של רנ"א שליח [mRNAs] המתורגמת באופן פעיל). פוליריבוזומים או פוליזומים הם קומפלקסים של ריבוזומים מרובים הקשורים ל-mRNA, המשמשים בדרך כלל לחקר תרגום³. שיטת פרופיל הפוליזום מורכבת מניתוח ה-mRNA הקשורים לפוליזומים ושימשה בהצלחה לחקר המנגנונים הפוסט-טרנספורמטיביים השולטים בביטוי גנים המתרחשים בתהליכים ביולוגיים מגוונים ^4,5.

מבחינה היסטורית, ניתוח ביטוי הגנום התמקד בעיקר בקביעת שפע mRNA ^6,7,8,9. עם זאת, קיים חוסר מתאם בין רמות התעתיק לרמות החלבון בשל השלבים השונים של ויסות פוסט-טרנספורמטיבי של ביטוי גנים, במיוחד תרגום^10,11,12. יתר על כן, לא נצפתה תלות בין השינויים ברמת התעתיק לבין אלה המתרחשים ברמה של translatome¹³. הניתוח הישיר של קבוצת ה-mRNA המתורגמת מאפשר מדידה מדויקת ומלאה יותר של ביטוי הגנים בתאים (שנקודת הקצה שלהם היא שפע חלבונים) מזו המתקבלת כאשר מנותחות רק רמות mRNA^14,15,16.

פרוטוקול זה מתאר כיצד פוליזומים ממקור צמחי מטוהרים מגושי סויה שלמים על-ידי צנטריפוגה דיפרנציאלית באמצעות כרית סוכרוז דו-שכבתית (איור 1). עם זאת, מכיוון שריבוזומים שמקורם בבקטרואיד נמצאים גם בגושים, תערובת של ריבוזומים ומיני RNA מטוהרים, למרות שהאאוקריוטים מייצגים את החלק העיקרי (90%-95%). כמו כן מתוארים הבידוד, הכימות ובקרת האיכות של הרנ"א הבאים (איור 1). פרוטוקול זה, בשילוב עם RNA-seq, אמור לספק תוצאות ניסיוניות על הוויסות התרגומי של mRNA אאוקריוטי ברקמה מורכבת כגון הגולם הסימביוטי.

איור 1: סקירה סכמטית של המתודולוגיה המוצעת לטיהור פוליזום אאוקריוטי מגושים סימביוטיים. התוכנית נותנת סקירה של השלבים הבאים בפרוטוקול מ-(1) גידול צמחים ו-(2) קציר גולמים ועד (3) הכנת התמציות הציטוזוליות, (3) קבלת דגימות TOTAL ו-(4) דגימות PAR, ו-(5) מיצוי RNA ובקרת איכות. קיצורים: PEB = מאגר מיצוי פוליזום; RB = חיץ resuspension; סה"כ = סך רנ"א; PAR = mRNA הקשור לפוליזום. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Protocol

1. גידול צמחים וחיסון ריזוביה

1. כדי ליצור את הגושים הנדרשים, לזרוע את זרעי סויה של בחירה במצע שנבחר בתא הגידול בתנאים מבוקרים.
   הערה: בפרוטוקול זה, זרעים נזרעו בבקבוק פלסטיק 0.5 ליטר מלא בתערובת של חול:ורמיקוליט (1:1). תא הגידול נקבע עם טמפרטורת מחזור יום / לילה של 28 °C (75 °F) / 20 ° C, בהתאמה, ו photoperiod אור / חושך של 16 h / 8 h, בהתאמה. עוצמת הקרינה הפעילה מבחינה פוטוסינתטית הייתה 620 μmol·m−²·s⁻¹.
2. הכינו מראש תמצית שמרים נוזלית מניטול (YEM)-בינונית (ראו טבלת חומרים). אוטוקלאב את המדיום.
3. באותו יום של זריעת זרעים, לחסן בקבוק אחד המכיל 100 מ"ל של YEM עם זן Bradyrhizobium elkanii U1302. דגירה של הבקבוקון ב-28 מעלות צלזיוס על שייקר מסלולי ב-100 סל"ד.
   1. תן ריזוביה לגדול במשך 2 ימים לחסן את השתילים עם 2 מ"ל של התרבות.

2. טיפול בגירעון מים (אופציונלי)

הערה: פרוטוקול זה מתאר את הטיפול בגירעון המים של צמחי הסויה. חלק זה ניתן לשינוי או להשמטה לחלוטין בהתאם לשאלה הניסויית העומדת על הפרק.

1. לגדל את שתילי סויה במשך 19 ימים (V2-3 שלב התפתחותי) ללא הגבלת מים. שמור על המצע בקיבולת שדה עם B&D-בינוני¹⁷ בתוספת 0.5 mM KNO₃.
2. ביום 20, למשוך השקיה.
   הערה: כאן, תכולת המים נמדדה מדי יום על ידי גרבימטריה (תכולת גרבימטרי במים) במהלך תקופות הגידול והגירעון במים.
3. יש למדוד את המוליכות הסטומטית במשולש מדי יום על פני העלה האבקסיאלי באמצעות פורומטר, בהתאם להוראות היצרן (ראו טבלת חומרים), מהיום ה-20 ועד תום תקופת גירעון המים.
   הערה: סוף תקופת הגירעון במים נקבע בנפרד עבור כל צמח כאשר ערך ההולכה הסטומטית היה כ-50% מזה שהתקבל ביום 20 מהזריעה.

3. קציר גולם

1. אסוף חנקן נוזלי במיכל נקי ותייג צינורות של 15 מ"ל (אחד לכל צמח).
   התראה: טפל בחנקן נוזלי עם כפפות קריו, מגני פנים ומשקפי מגן.
2. יש לאחזר כל צמח בנפרד. חותכים ומשליכים את החלק האווירי. שטפו היטב את השורש במים כדי להסיר את כל המצע שנותר.
3. לנתק כל גולם מן השורש ולאסוף אותם בצינור prechilled 15 מ"ל. הקפיא את הצינורות ואחסן אותם בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס.

4. הכנת תמציות ציטוזוליות

הערה: המטרה הסופית של פרוטוקול זה היא להשיג RNA כולל באיכות גבוהה (TOTAL) ו- RNA הקשור לפוליזום (PAR). לכן, לעבוד בתנאים המונעים פירוק RNA, תמיד לשמור על דגימות ב 4 מעלות צלזיוס ולהשתמש בציוד מעבדה ללא RNase ופתרונות. אלא אם כן צוין, כל הפתרונות מוכנים עם מים סטריליים ultrapure.

1. הכנת פתרונות מלאי בופר
   1. הכן את פתרונות המלאי הניתנים להחלפה אוטומטית המפורטים בטבלה 1, אוטוקלאב אותם למשך 15 דקות, ושמור ב- RT.
   2. הכן את פתרונות המלאי הניתנים לעיקור במסננים המפורטים בטבלה 1, סנן-עקר אותם ושמור אותם בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס.
2. הכינו את חיץ מיצוי הפוליסום (PEB, ראו טבלה 1) ושמרו אותו על קרח.
   הערה: הכרכים שניתנו הם עבור שש דוגמאות.
3. מקררים את הצנטריפוגה ל-4 מעלות צלזיוס ומניחים 2 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה על קרח.
4. שוקלים כ -0.2 גרם של גושים שלמים בכלי שקילה ומעבירים אותם לצינור 2 מ"ל מקורר מראש.
   הערה: בצע שלב זה במהירות כדי למנוע הפשרה של הדגימות. לחלופין, ניתן להשתמש בנפח גולם מוערך של 0.4-0.5 מ"ל במקום 0.2 גרם.
5. מוסיפים 1.2 מ"ל של PEB, נותנים לדגימה להפשיר למשך 2 דקות, והומוגניים עם מטחנת רקמות עד לשיבוש מוחלט והומוגניות של הגושים.
   הערה: הקפידו לטחון את הגושים לאחר ההפשרה מכיוון שהם יהיו רכים מספיק כדי להיות מופרעים בקלות עם מטחנות רקמות (ראו טבלת החומרים) בצינורות מיקרוצנטריפוגה. גושים קפואים קשה לטחון. כמו כן, מומלץ למקם את הצינורות בצידנית ספסל (0 מעלות צלזיוס) להומוגניזציה נכונה תוך שמירה על דגימות קרירות.
6. דגרו את הדגימות על הקרח בתסיסה עדינה למשך 10 דקות או עד שכל הדגימות עובדו.
7. צנטריפוגה ב 16,000 × גרם במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס כדי לזרוק את הפסולת. לשחזר את supernatant ולחזור על שלב צנטריפוגה.
8. שחזר בזהירות את התמצית הציטוזולית המובהקת והעבר אליקוט של 200 μL לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי של 1.5 מ"ל לבידוד כולל (דגימות TOTAL; ראה סעיף 7).

5. הכנת כריות סוכרוז

הערה: פרוטוקול זה משתמש בכרית סוכרוז דו-שכבתית (12% ו-33.5%) בצינורות אולטרה-צנטריפוגה בגודל 13.2 מ"ל (ראו טבלת חומרים). כל הפתרונות מוכנים עם מים סטריליים ultrapure.

1. הכינו את תמיסות הסוכרוז והמלח.
   1. הכינו 100 מ"ל של תמיסת סוכרוז 2 M (68.5%, טבלה 1).
   2. הכינו 10x תמיסת מלח (טבלה 1).
2. הכינו את שתי השכבות של כרית הסוכרוז כמתואר בטבלה 2. ראו טבלה 1 להרכב תמיסות המלאי האנטיביוטיות (CHX ו-CHL).
   הערה: הכרכים שניתנו הם עבור שש כריות.
3. יוצקים 4.5 מ"ל של שכבת סוכרוז 33.5% לתוך צינורות צנטריפוגה. לאחר מכן, הוסיפו 4.5 מ"ל משכבת ה-12% בזהירות ובאיטיות עם מיקרופיפט P1000. שים את הצינורות על קרח עד תוספת של תמצית cytosolic הבהיר.

6. טיהור פוליזום

1. טען 1 מ"ל של תמצית ציטוזולית מזוקקת (שלב 4.8) על גבי כרית סוכרוז על ידי ניפוח בזהירות על דופן הצינור.
2. העבר את צינורות האולטרה-צנטריפוגה לדליים מוכנים מראש ולצנטריפוגה ב-217,874 × גרם (35,000 סל"ד ברוטור המוזכר [ראו טבלת החומרים]) למשך שעתיים ב-4 מעלות צלזיוס.
3. יש להשליך את התמצית הציטוזולית הנותרת ואת כרית הסוכוז, ולהשהות את הגלולה הפוליסומלית עם 200 μL של RB מקורר מראש (שהוכן בעבר לפי טבלה 1).
4. דגירה במשך 30 דקות על קרח ולאחר מכן להעביר את resuspension polysomal ל 1.5 מ"ל צינורות precooled. המשך עם מיצוי RNA (דגימות PAR).

7. מיצוי RNA ובקרת איכות

הערה: שלב זה מבוצע עבור דוגמאות TOTAL (שלב 4.8) ו- PAR (שלב 6.4).

1. הכינו 75% EtOH עם מים סטריליים במיוחד וקיררו אותם ל-20°C-. בנוסף, יש לקרר כלורופורם ואיזופרופנול ל-20°C-.
2. הומוגניזציה של הדגימות עם 750 μL של מגיב בידוד RNA ודגירה במשך 5 דקות ב- RT.
3. יש להוסיף 200 μL של כלורופורם קר ולנער את הצינורות במרץ במשך 15 שניות. דגירה ב- RT במשך 10 דקות.
4. צנטריפוגה בטמפרטורה של 12,000 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס להפרדת פאזה. העבירו 500 μL מהפאזה המימית העליונה לצינור נקי מבלי להפריע לפאזה האורגנית הוורודה, והוסיפו 375 μL של איזופרופנול קר ו-0.5 μL של גליקוגן ללא RNase (ראו טבלת חומרים). מערבבים היטב על ידי צנרת למעלה ולמטה.
   הערה: גליקוגן הוא נשא המשמש כמשקע משותף להגברת ההתאוששות מחומצת גרעין ממשקעי אלכוהול.
5. דגירה של התערובת למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס וצנטריפוגה ב-12,000 × גרם למשך 15 דקות. השליכו את הסופר-נטנט.
6. לשטוף את משקע RNA עם 1 מ"ל של קר 75% EtOH. מערבבים על ידי מערבולת קצרה.
   הערה: בשלב זה, ניתן לאחסן את הדגימות בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
7. צנטריפוגה ב 7,500 × גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס, להסיר בזהירות את supernatant עם micropipette, ולייבש באוויר את כדור RNA.
8. ממיסים את הכדור ב-50 μL של מים ללא RNase ודוגרים בטמפרטורה של 65°C למשך 5 דקות.
9. הערך את ריכוז הרנ"א ותקינותו באמצעות אלקטרופורזה נימית רגישה ביותר¹⁸ (ראו טבלת החומרים) ו/או אלקטרופורזה על ג'ל אגרוז¹⁹ נטול RNase בשיעור של 2% (ראו טבלת חומרים).
   הערה: אם דגימות ה- RNA אינן עומדות לשמש באופן מיידי או שהן עומדות להישלח למתקן הריצוף להכנת ספריית RNA-seq, מומלץ להשתמש ב- EtOH כדי לזרז אותן.

8. משקעי RNA

1. מצננים את הצנטריפוגה ואת EtOH ל-4 מעלות צלזיוס.
2. הכינו 3 M נתרן אצטט.
3. הכינו 70% EtOH עם מים סטריליים במיוחד וקיררו אותם ל-20°C-.
4. הערך את נפח המדגם. הוסף 0.1 כרכים של 3 M נתרן אצטט, 3 כרכים של EtOH קר, ו-0.5 μL של גליקוגן ללא RNase. מערבבים היטב.
5. להשאיר בטמפרטורה של −20°C עד הצורך.
   הערה: ניתן לאחסן דגימות מזרזות RNA למשך עד שנה אחת בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס.

9. צינור סטנדרטי לניתוח ביטוי גנים

1. בצע ממוצע של 40M קריאות קצה מזווגות של Illumina, עם אורך קריאה >100 bp, לניתוח בטוח של נתוני תמלול וטרנסלטום.
   הערה: ניתוח נתוני RNA-seq סטנדרטי כולל את השלבים הבאים 9.2-9.5.
2. בצע בדיקת איכות קריאה באמצעות FastQC (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) או MultiQC²⁰ מרובה הדגמות.
3. הסר מתאם ורצפים באיכות נמוכה באמצעות Trimmomatic 21, BBDuk (http://jgi.doe.gov/data-and-tools/bb-tools/), cutadapt²², מגל²³, או Trim Galore (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/), בין היתר.
4. אם גנום ייחוס זמין עבור המין, בצע מיפוי קריאה כנגד ההתייחסות, ולאחר מכן כימות שפע, באמצעות Bowtie2²⁴, TopHat2 25 או סלמון 26, ו- featureCounts²⁷, מלבד כלי קוד פתוח אחרים.
5. בצע ניתוח סטטיסטי לזיהוי גנים מבוטא דיפרנציאלי באמצעות edgeR²⁸, DESeq2²⁹, או limma³⁰, בין היתר.
   הערה: ניתן להשתמש בתוכנות קוד פתוח אלה באופן מקומי, דרך שורת הפקודה. לחלופין, ניתן להפעיל אותם באמצעות דפדפן אינטרנט בשרת ציבורי, כגון Galaxy³¹ או GEOexplorer³², המציעים ממשק משתמש גרפי, כך שאין צורך בידע בשורת הפקודה לצורך השימוש בהם.

תוצאות

הערכת הכמות והאיכות של שברים TOTAL ו- PAR המטוהרים באמצעות ההליך הנ"ל היא המפתח לקביעת הצלחתו, שכן עבור רוב היישומים במורד הזרם, כגון ריצוף RNA, דגימות באיכות גבוהה הן בסיסיות להכנת ספרייה וריצוף. יתר על כן, שלמות מולקולות הרנ"א מאפשרת לכידת תמונת מצב של פרופיל ביטוי הגנים ברגע איסוף הדגימה

Discussion

חקר ויסות ביטוי גנים ברמת התרגום הוא קריטי להבנה טובה יותר של תהליכים ביולוגיים שונים, שכן נקודת הקצה של ביטוי גנים בתאים היא שפע חלבונים^13,14. ניתן להעריך זאת על ידי ניתוח הטרנסלטום של הרקמה או האורגניזם המעניין שעבורו יש לטהר את השבר הפוליסומלי ואת ה- mRNAs הקש...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plant growth and rhizobia inoculation
Orbital shaker	Daihan Scientific		Model SHO-1D
YEM-medium	Amresco	J850 (yeast extract) 0122 (mannitol)
Water deficit treatment
KNO3	Merck	221295
Porometer	Decagon Device		Model SC-1
Scalpel
Preparation of cytosolic extracts
Brij L23	Sigma-Aldrich	P1254
Centrifuge	Sigma		Model 2K15
Chloranphenicol	Sigma-Aldrich	C0378
Cycloheximide	Sigma-Aldrich	C7698
DOC	Sigma-Aldrich	30970
DTT	Sigma-Aldrich	D9779
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
Igepal CA 360	Sigma-Aldrich	I8896
KCl	Merck	1.04936
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266
Plastic tissue grinder	Fisher Scientific	12649595
PMSF	Sigma-Aldrich	P7626
PTE	Sigma-Aldrich	P2393
Tris	Invitrogen	15504-020
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379
Weighing dish	Deltalab	1911103
Preparation of sucrose cushions
Sucrose	Invitrogen	15503022
SW 40 Ti rotor	Beckman-Coulter
Ultracentrifuge	Beckman-Coulter		Optima L-100K
Ultracentrifuge tubes	Beckman-Coulter	344059	13.2 mL tubes
RNA extraction and quality control
Agarose	Thermo scientific	R0492
Bioanalyzer	Agilent		Model 2100. Eukaryote total RNA nano assay
Chloroform	DI	41191
Ethanol	Dorwil	UN1170
Isopropanol	Mallinckrodt	3032-06
Glycogen	Sigma	10814-010
TRIzol LS	Ambion	102960028
Miscellaneous
Falcon tubes 15 mL	Biologix	10-0152
Filter tips 10 µL	BioPointe Scientific	321-4050
Filter tips 1000 µL	BioPointe Scientific	361-1050
Filter tips 20 µL	BioPointe Scientific	341-4050
Filter tips 200 µL	Tarsons	528104
Microcentrifuge tubes 1.5 mL	Tarsons	500010-N
Microcentrifuge tubes 2.0 mL	Tarsons	500020-N
Sequencing company	Macrogen
Sterile 250 mL flask	Marienfeld	4110207