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En este artículo

  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Un paso necesario en el desarrollo de aptámeros anticancerosos es probar su unión al objetivo. Demostramos un ensayo basado en citometría de flujo para estudiar esta unión, enfatizando la importancia de incluir un aptámero de control negativo y células cancerosas que sean positivas o negativas para esa proteína en particular.

Resumen

Un desafío clave en el desarrollo de un aptámero anticanceroso es determinar eficientemente la selectividad y especificidad del aptámero desarrollado para la proteína diana. Debido a sus varias ventajas sobre los anticuerpos monoclonales, el desarrollo de aptámeros ha ganado una enorme popularidad entre los investigadores del cáncer. La evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX) es el método más común para desarrollar aptámeros específicos para proteínas de interés. Después de SELEX, un ensayo de unión rápido y eficiente acelera el proceso de identificación, confirmando la selectividad y especificidad del aptámero.

Este documento explica un ensayo de unión citométrico de flujo paso a paso de un aptámero específico para la molécula de adhesión celular epitelial (EpCAM). La glicoproteína transmembrana EpCAM se sobreexpresa en la mayoría de los carcinomas y desempeña un papel en el inicio, la progresión y la metástasis del cáncer. Por lo tanto, es un candidato valioso para la administración de fármacos dirigidos a los tumores. Para evaluar la selectividad y especificidad del aptámero a la EpCAM unida a la membrana, se requieren células positivas y negativas para EpCAM. Además, se requiere un aptámero EpCAM no vinculante con una longitud y estructura bidimensional (2D) similares al aptámero de unión a EpCAM. El ensayo de unión incluye diferentes tampones (tampón de bloqueo, tampón de lavado, tampón de incubación y tampón FACS) y pasos de incubación.

El aptámero se incuba con las líneas celulares. Después de los pasos de incubación y lavado, las células se evaluarán mediante un ensayo de citometría de flujo sensible. El análisis de los resultados muestra la unión del aptámero específico de EpCAM a las células positivas para EpCAM y no a las células negativas para EpCAM. En las células positivas para EpCAM, esto se representa como un cambio de banda en la unión del aptámero EpCAM a la derecha en comparación con el control del aptámero no vinculante. En las células negativas para EpCAM, las bandas correspondientes de aptámeros de unión y no unión a EpCAM se superponen. Esto demuestra la selectividad y especificidad del aptámero EpCAM. Si bien este protocolo se centra en el aptámero EpCAM, el protocolo es aplicable a otros aptámeros publicados.

Introducción

El cáncer sigue siendo una de las principales causas de mortalidad en todo el mundo1. A pesar de la mejora significativa en el tratamiento del cáncer en las últimas décadas, el desarrollo de medicamentos contra el cáncer sigue siendo un tema muy debatido. Esto se debe a que la quimioterapia, como pilar del tratamiento del cáncer, se acompaña de efectos secundarios graves que limitan el cumplimiento del tratamiento por parte del paciente. Además, la resistencia al tratamiento del cáncer inducida por la quimioterapia ha restringido su aplicación como la única opción de intervención médica. La aplicación de anticuerpos monoclonales (mAbs) introduj....

Protocolo

NOTA: Antes de comenzar el experimento, use equipo de protección personal, incluyendo una bata de laboratorio, guantes y gafas. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre materiales, reactivos, equipos y software utilizados en este protocolo.

1. Tampones necesarios para el ensayo

  1. Prepare los tampones necesarios para este experimento: el tampón SELEX requerido para el plegado del aptámero, el tampón de bloqueo (BB), el tampón de lavado (WB) y el tampón de unión (BiB) (Tabla 1), recién el día del experimento y manténgalos en hielo o a 4 °C.
    NOTA: Cada aptámero re....

Resultados

Un aspecto importante del descubrimiento y desarrollo de nuevos fármacos es asegurar la selectividad y especificidad del candidato a fármaco. Esto significa que el candidato a fármaco debe ser capaz de discriminar entre diferentes células y sólo afectar a la población celular de interés (selectividad). La selectividad se estudia utilizando líneas celulares que difieren en términos de expresión de la proteína de interés. En este estudio, las líneas celulares MDA-MB-231 y HEK 293T fueron elegidas como células.......

Discusión

El desafío clave con el desarrollo de nuevos aptámeros es la falta de directrices estándar que se aplican a los diferentes pasos de este proceso. McKeague et al. han demostrado recientemente algunos de los desafíos asociados, que conducen a presentaciones poco claras de los datos en las publicaciones y al fracaso de replicar la investigación. Propusieron directrices fundamentales necesarias para su consideración en la caracterización de aptámeros19. Un ensayo de unión de aptámeros es un .......

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Los autores reconocen la financiación de SEED del Instituto de Salud Mental y Física y Traducción Clínica (IMPACT), el programa "Alfred Deakin Postdoctoral Research Fellowship" en la Universidad de Deakin y la "Beca del Programa de Capacitación en Investigación del Gobierno de Australia".

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microcentrifuge tubes with attached lidSigma-AldrichT6649
15 mL CellStar blue screw cap, conical bottom tubeGreiner Bio One188271
5 mL serological pipettesGreiner Bio One606180
BD FACSCanto II Flow Becton Dickinson CytometerBecton DickinsonN/A
BD FACSDiva V9.0BD BiosciencesN/A
Bovine Serum Albumin (BSA), Lyophilized powderSigma-AldrichTMA7906-50G
Bright-line HemocytometerSigma-AldrichZ359629
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) High Glucose Media PowderLife Technologies12100046
Dulbecco’s Phosphate- Buffered Saline (DPBS)Life Technologies21300025
FlowJo, LLC 10.8.1BD BiosciencesN/A
Foetal Bovine Serum (FBS)BovogenSFBS-F
HEK293TAmerican Type Culture CollectionACS-4500
Heracell 150i CO2 IncubatorThermo Fisher ScientificN/A
Heraeus Megafuge 16R CentrifugeThermo Fisher ScientificN/A
Magnesium Chloride (MgCl2)Sigma-AldrichM8266
MDA-MB-231American Type Culture CollectionCRM-HTB-26
Microplate, PS, 96 well, F-bottom (Chimney well), BlackGreiner Bio One655076
MiniAmp Thermal CyclerThermo Fisher ScientificA37834
Phosphate-Buffered Saline (PBS) tabletsLife Technologies18912014
Pyrogen- and RNase-free ultrapure waterMilli-Q
T75 Cell Culture flaskCellstar658170
TENNIntegrated DNA TechnologiesN/A5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3
TEPPIntegrated DNA TechnologiesN/A5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′
Transfer RNA (tRNA)Sigma-AldrichR8508-5X1ML
Trypan Blue SolutionLife Technologies15250061
Trypsin-EDTAGibco15400054

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