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Un paso necesario en el desarrollo de aptámeros anticancerosos es probar su unión al objetivo. Demostramos un ensayo basado en citometría de flujo para estudiar esta unión, enfatizando la importancia de incluir un aptámero de control negativo y células cancerosas que sean positivas o negativas para esa proteína en particular.
Un desafío clave en el desarrollo de un aptámero anticanceroso es determinar eficientemente la selectividad y especificidad del aptámero desarrollado para la proteína diana. Debido a sus varias ventajas sobre los anticuerpos monoclonales, el desarrollo de aptámeros ha ganado una enorme popularidad entre los investigadores del cáncer. La evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX) es el método más común para desarrollar aptámeros específicos para proteínas de interés. Después de SELEX, un ensayo de unión rápido y eficiente acelera el proceso de identificación, confirmando la selectividad y especificidad del aptámero.
Este documento explica un ensayo de unión citométrico de flujo paso a paso de un aptámero específico para la molécula de adhesión celular epitelial (EpCAM). La glicoproteína transmembrana EpCAM se sobreexpresa en la mayoría de los carcinomas y desempeña un papel en el inicio, la progresión y la metástasis del cáncer. Por lo tanto, es un candidato valioso para la administración de fármacos dirigidos a los tumores. Para evaluar la selectividad y especificidad del aptámero a la EpCAM unida a la membrana, se requieren células positivas y negativas para EpCAM. Además, se requiere un aptámero EpCAM no vinculante con una longitud y estructura bidimensional (2D) similares al aptámero de unión a EpCAM. El ensayo de unión incluye diferentes tampones (tampón de bloqueo, tampón de lavado, tampón de incubación y tampón FACS) y pasos de incubación.
El aptámero se incuba con las líneas celulares. Después de los pasos de incubación y lavado, las células se evaluarán mediante un ensayo de citometría de flujo sensible. El análisis de los resultados muestra la unión del aptámero específico de EpCAM a las células positivas para EpCAM y no a las células negativas para EpCAM. En las células positivas para EpCAM, esto se representa como un cambio de banda en la unión del aptámero EpCAM a la derecha en comparación con el control del aptámero no vinculante. En las células negativas para EpCAM, las bandas correspondientes de aptámeros de unión y no unión a EpCAM se superponen. Esto demuestra la selectividad y especificidad del aptámero EpCAM. Si bien este protocolo se centra en el aptámero EpCAM, el protocolo es aplicable a otros aptámeros publicados.
El cáncer sigue siendo una de las principales causas de mortalidad en todo el mundo1. A pesar de la mejora significativa en el tratamiento del cáncer en las últimas décadas, el desarrollo de medicamentos contra el cáncer sigue siendo un tema muy debatido. Esto se debe a que la quimioterapia, como pilar del tratamiento del cáncer, se acompaña de efectos secundarios graves que limitan el cumplimiento del tratamiento por parte del paciente. Además, la resistencia al tratamiento del cáncer inducida por la quimioterapia ha restringido su aplicación como la única opción de intervención médica. La aplicación de anticuerpos monoclonales (mAbs) introduj....
NOTA: Antes de comenzar el experimento, use equipo de protección personal, incluyendo una bata de laboratorio, guantes y gafas. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre materiales, reactivos, equipos y software utilizados en este protocolo.
1. Tampones necesarios para el ensayo
Un aspecto importante del descubrimiento y desarrollo de nuevos fármacos es asegurar la selectividad y especificidad del candidato a fármaco. Esto significa que el candidato a fármaco debe ser capaz de discriminar entre diferentes células y sólo afectar a la población celular de interés (selectividad). La selectividad se estudia utilizando líneas celulares que difieren en términos de expresión de la proteína de interés. En este estudio, las líneas celulares MDA-MB-231 y HEK 293T fueron elegidas como células.......
El desafío clave con el desarrollo de nuevos aptámeros es la falta de directrices estándar que se aplican a los diferentes pasos de este proceso. McKeague et al. han demostrado recientemente algunos de los desafíos asociados, que conducen a presentaciones poco claras de los datos en las publicaciones y al fracaso de replicar la investigación. Propusieron directrices fundamentales necesarias para su consideración en la caracterización de aptámeros19. Un ensayo de unión de aptámeros es un .......
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Los autores reconocen la financiación de SEED del Instituto de Salud Mental y Física y Traducción Clínica (IMPACT), el programa "Alfred Deakin Postdoctoral Research Fellowship" en la Universidad de Deakin y la "Beca del Programa de Capacitación en Investigación del Gobierno de Australia".
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL microcentrifuge tubes with attached lid | Sigma-Aldrich | T6649 | |
15 mL CellStar blue screw cap, conical bottom tube | Greiner Bio One | 188271 | |
5 mL serological pipettes | Greiner Bio One | 606180 | |
BD FACSCanto II Flow Becton Dickinson Cytometer | Becton Dickinson | N/A | |
BD FACSDiva V9.0 | BD Biosciences | N/A | |
Bovine Serum Albumin (BSA), Lyophilized powder | Sigma-AldrichTM | A7906-50G | |
Bright-line Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) High Glucose Media Powder | Life Technologies | 12100046 | |
Dulbecco’s Phosphate- Buffered Saline (DPBS) | Life Technologies | 21300025 | |
FlowJo, LLC 10.8.1 | BD Biosciences | N/A | |
Foetal Bovine Serum (FBS) | Bovogen | SFBS-F | |
HEK293T | American Type Culture Collection | ACS-4500 | |
Heracell 150i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
Heraeus Megafuge 16R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
MDA-MB-231 | American Type Culture Collection | CRM-HTB-26 | |
Microplate, PS, 96 well, F-bottom (Chimney well), Black | Greiner Bio One | 655076 | |
MiniAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A37834 | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) tablets | Life Technologies | 18912014 | |
Pyrogen- and RNase-free ultrapure water | Milli-Q | ||
T75 Cell Culture flask | Cellstar | 658170 | |
TENN | Integrated DNA Technologies | N/A | 5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3 |
TEPP | Integrated DNA Technologies | N/A | 5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′ |
Transfer RNA (tRNA) | Sigma-Aldrich | R8508-5X1ML | |
Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15250061 | |
Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 |
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