Um ensaio de ligação de proteínas de superfície celular baseado em citometria de fluxo para avaliar a seletividade e a especificidade de um Aptamer anticancerígeno

Resumo

Um passo necessário no desenvolvimento do aptâmero anticâncer é testar sua ligação ao alvo. Demonstramos um ensaio baseado em citometria de fluxo para estudar essa ligação, enfatizando a importância de incluir um aptâmero de controle negativo e células cancerígenas que são positivas ou negativas para essa proteína em particular.

Resumo

Um dos principais desafios no desenvolvimento de um aptâmero anticâncer é determinar eficientemente a seletividade e a especificidade do aptâmero desenvolvido para a proteína alvo. Devido às suas várias vantagens sobre os anticorpos monoclonais, o desenvolvimento do aptâmero ganhou enorme popularidade entre os pesquisadores do câncer. A evolução sistemática de ligantes por enriquecimento exponencial (SELEX) é o método mais comum de desenvolvimento de aptâmeros específicos para proteínas de interesse. Após o SELEX, um ensaio de ligação rápido e eficiente acelera o processo de identificação, confirmando a seletividade e especificidade do aptâmero.

Este artigo explica um ensaio de ligação baseado em citometria de fluxo passo-a-passo de um aptâmero específico para molécula de adesão celular epitelial (EpCAM). A glicoproteína transmembrana EpCAM é superexpressa na maioria dos carcinomas e desempenha papéis no início, progressão e metástase do câncer. Portanto, é um candidato valioso para a entrega de medicamentos direcionados aos tumores. Para avaliar a seletividade e a especificidade do aptâmero para a EpCAM ligada à membrana, são necessárias células positivas e negativas para EpCAM. Além disso, é necessário um aptâmero EpCAM não vinculativo com um comprimento e estrutura 2-dimensional (2D) semelhantes ao aptâmero de ligação ao EpCAM. O ensaio de ligação inclui diferentes buffers (buffer de bloqueio, buffer de lavagem, buffer de incubação e buffer FACS) e etapas de incubação.

O aptâmero é incubado com as linhas celulares. Após as etapas de incubação e lavagem, as células serão avaliadas por meio de um ensaio de citometria de fluxo sensível. A análise dos resultados mostra a ligação do aptâmero específico do EpCAM às células positivas para EpCAM e não às células negativas para EpCAM. Em células positivas para EpCAM, isso é descrito como um deslocamento de banda na ligação do aptâmero EpCAM à direita em comparação com o controle do aptâmero não ligante. Em células EpCAM-negativas, as bandas correspondentes de aptâmeros de ligação e não ligação a EpCAM se sobrepõem. Isso demonstra a seletividade e a especificidade do aptamer EpCAM. Enquanto este protocolo é focado no aptâmero EpCAM, o protocolo é aplicável a outros aptâmeros publicados.

Introdução

O câncer ainda é uma das principais causas de mortalidade em todo o mundo¹. Apesar da melhoria significativa no tratamento do câncer nas últimas décadas, o desenvolvimento de medicamentos anticâncer ainda é um tópico altamente debatido. Isso ocorre porque a quimioterapia, como a base do tratamento do câncer, é acompanhada por efeitos colaterais graves que limitam a adesão do paciente ao tratamento. Além disso, a resistência ao tratamento do câncer induzida pela quimioterapia restringiu sua aplicação como a única escolha de intervenção médica. A aplicação de anticorpos monoclonais (mAbs) introduziu uma resposta aprimorada aos tratamentos contra o câncer². A lógica do uso de mAbs foi melhorar a eficácia dos quimioterápicos e minimizar suas reações adversas. No entanto, a administração de mAbs também se tornou um desafio. Isso não ocorreu apenas por causa das reações imunológicas induzidas por mAb, mas também devido aos custos de produção caros e dependentes de animais e às difíceis condições de armazenamento³. A introdução dos aptâmeros^{na década de} 19904 levantou novas esperanças no tratamento do câncer, já que a aplicação de aptâmeros poderia enfrentar os desafios associados ao mAbs.

Aptamers são sequências curtas de ácidos nucleicos que são produzidas especificamente para um determinado alvo. A evolução sistemática de ligantes por enriquecimento exponencial (SELEX) é um método comum na produção de aptâmeros. No SELEX, a proteína de interesse é incubada com uma biblioteca de sequências aleatórias de nucleotídeos e, através de uma série de ciclos iterativos, o aptâmero específico para essa proteína é purificado. Os aptâmeros têm seletividade e especificidade de alvo semelhantes aos mAbs e, portanto, o desenvolvimento de medicamentos neste campo mostra aplicações futuras promissoras. Aptamers específicos para biomarcadores de câncer poderiam ser aplicados como medicamentos únicos e ferramentas de diagnóstico de câncer ^5,6,7. Devido à sua estrutura nanométrica, esses aptâmeros também poderiam atuar como portadores de fármacos para fornecer agentes citotóxicos especificamente ao tumor⁸. Isso aumentaria a eficácia da administração direcionada de medicamentos e diminuiria as reações adversas fora do alvo associadas à quimioterapia. Além disso, esses nanomedicamentos têm uma alta penetração tecidual, o que os torna um candidato desejável para a entrega e tratamento de medicamentos de tumores profundos. Os aptâmeros também podem ser projetados para atingir os transportadores expressos na barreira hematoencefálica (BBB) para melhorar a entrega de drogas a tumores cerebrais⁹. Um bom exemplo de tal aptâmero são os aptâmeros bifuncionais, visando o receptor de transferrina (TfR)¹⁰ para melhorar a entrega de drogas em todo o BBB e entregando uma carga útil de drogas citotóxicas às células tumorais¹¹.

Apesar de todas as vantagens dos aptâmeros, o desenvolvimento de medicamentos neste campo ainda não produziu um medicamento anticâncer comercializado e bem-sucedido. Uma razão para isso pode ser a falta de métodos padrão e reprodutíveis que poderiam ser seguidos globalmente por pesquisadores da área. Neste trabalho, um protocolo passo-a-passo de um aptâmero se ligando a uma proteína nativa expressa na superfície celular é demonstrado. Este protocolo é uma etapa pré-requisito na avaliação pré-clínica de aptâmeros anticancerígenos. O ensaio é realizado para mostrar a seletividade e especificidade do aptâmero purificado coletado do SELEX ou uma sequência de aptâmeros publicada para confirmação da seletividade e especificidade. Este ensaio baseado em citometria de fluxo é um ensaio rápido, confiável e sensível que mostra com precisão a seletividade e a especificidade do aptâmero, onde o aptâmero está sendo testado contra proteínas na superfície celular^12,13,14. Este método é demonstrado usando a ligação de um aptâmero específico para EpCAM mostrado neste trabalho¹⁵. A EpCAM, como glicoproteína transmembrana, desempenha papéis na sinalização, progressão, migração e metástase de células tumorais^16,17. Para mostrar a seletividade e especificidade deste aptâmero, foram utilizadas células cancerígenas positivas e negativas para EpCAM. O aptâmero específico de EpCAM previamente desenvolvido, TEPP (5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′), e um aptâmero controle negativo, TENN (5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3), foram utilizados como aptâmeros ligantes e não ligantes de EpCAM, respectivamente¹⁰. A extremidade 3' do TEPP e do TENN foi marcada com um fluoróforo TYE665.

O TEPP é um aptâmero bifuncional que tem como alvo o EpCAM de uma extremidade e o TfR do outro. Isso tornou o TEPP um candidato adequado para a administração de medicamentos para tumores cerebrais ^EpCAM +. Usando sua extremidade específica da TfR, a TEPP atravessa a barreira hematoencefálica e, usando a extremidade específica da EpCAM, encontra o tumor e entrega sua carga (por exemplo, drogas citotóxicas) ao tumor. O TENN tem um comprimento e uma estrutura 2D semelhantes ao TEPP, mas não tem afinidade com o EpCAM ou TfR e, portanto, é um aptâmero de controle negativo adequado. Usando TEPP e TENN, testar a ligação de um aptâmero à proteína-alvo usando citometria de fluxo é mostrado neste artigo. Este protocolo aplica-se ao desenvolvimento de aptâmeros específicos de células. Também é aplicável a outras análises complementares e de confirmação das sequências de aptâmeros disponíveis na literatura. O protocolo também pode ser usado por aqueles novos no campo do aptâmero que estão procurando usar um aptâmero publicado anteriormente para seus fins de pesquisa e desenvolvimento (P & D). Neste trabalho, são estudadas duas sequências de aptâmeros disponíveis na literatura.

Protocolo

NOTA: Antes de iniciar o experimento, use equipamentos de proteção individual, incluindo um jaleco, luvas e óculos. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre materiais, reagentes, equipamentos e software usados neste protocolo.

1. Buffers necessários para o ensaio

1. Preparar os buffers necessários para este experimento - o buffer SELEX necessário para dobrar aptâmeros, Blocking Buffer (BB), Wash Buffer (WB) e Binding Buffer (BiB) (Tabela 1) - recentemente no dia do experimento e mantê-los no gelo ou a 4 °C.
   NOTA: Cada aptâmero requer uma condição de dobragem única. Isso inclui o buffer SELEX e as condições de temperatura dobrável. Deve-se ter o cuidado de replicar completamente os métodos do artigo original que descreve o aptâmero¹⁰. Neste experimento, todos os tampões são preparados na solução salina tamponada com fosfato (DPBS) da Dulbecco. O volume tampão necessário em cada experimento depende do número de linhagens celulares, do número de replicações e do número de concentrações de aptâmeros que são testadas.

	Ingredientes		Volume necessário
	Item	Concentração
Buffer SELEX	MgCl2	5 mM	50 μL por amostra + erro de pipetagem de 10%
Bloqueando o buffer	MgCl2	5 mM	500 μL por linhagem celular
	BSA a	1 mg/mL
	RNAt b	0,1 mg/ml
	FBS c	10% (v/v)
Buffer de lavagem	MgCl2	5 mM	1 mL para a primeira lavagem + 100 μL por amostra de teste + 10% de erro de pipetagem
Buffer de ligação	MgCl2	5 mM	50 μL por amostra + erro de pipetagem de 10%
	BSA	2 mg/mL
	Trna	0,2 mg/ml
	FBS	20% (v/v)

Tabela 1: Buffers necessários para o ensaio de ligação. ^um Albumina Sérica Bovina, ^bTransferência de Ácido Ribonucleico, ^cSoro Fetal Bovino.

2. Preparação de aptâmeros

NOTA: Os aptâmeros usados no ensaio são marcados com uma molécula repórter de fluorescência e, portanto, deve-se tomar cuidado para protegê-los da luz.

1. Antes do experimento, preparar um estoque de 100 μM (estoque A) de aptâmeros de teste e controle usando água ultrapura livre de pirogênio e RNase (Figura 1).
   NOTA: Para a preservação a longo prazo, a unidade populacional A deve ser mantida no congelador a -20 °C.
2. Preparar a unidade populacional B como concentração de trabalho dos aptâmeros diluindo a reserva A utilizando o tampão SELEX (quadro 1). Para seguir esse protocolo, dilua o estoque A para um estoque de 1.000 nM para preparar o estoque B (Figura 1).
3. Para preparar o aptâmero para a formação da estrutura tridimensional (3D), num tubo de 250 μL, dilua o reservatório B com tampão SELEX para preparar o volume e a concentração necessários do aptâmero para dobragem.
   NOTA: Os aptâmeros dobrados serão expostos a um volume igual de células. Portanto, a concentração do aptâmero que é ajustado para dobramento deve ser 2x mais concentrada do que a concentração final desejada. Use a equação (1) para calcular os volumes e concentrações necessários. Lembre-se de considerar um volume extra de 10% para o erro de pipetagem.
   Existências_de concentração A × Existências de volume A = Existências de concentração B ×_{Existências de} volume_B (1)

Figura 1: Um diagrama mostrando as etapas na preparação dos aptâmeros. 1 O estoque ¹é armazenado a -20 °C para preservação a longo prazo. ^algarismo As concentrações de trabalho são preparadas em tampão SELEX e não são armazenadas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Manutenção das células cancerosas

NOTA: Antes do início do estudo, certifique-se de que as células estão em seus números de passagem iniciais, mostram suas características morfológicas típicas e estão livres de micoplasma. Para testar a seletividade e a especificidade do aptâmero, linhagens celulares que sejam expressores altos, moderados e baixos/negativos da proteína de interesse são idealmente necessários.

1. Semeia as células num balão de cultura T75, utilizando condições de cultura adequadas. Cultivá-los em uma incubadora umidificada de CO₂ a 5%, a 37 °C.
   NOTA: Neste estudo, foi utilizado o Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (meio completo).
2. Quando as células atingirem ~80% de confluência, passá-las para um novo frasco contendo meio fresco completo.
   NOTA: Dependendo da proteína de interesse e da linhagem celular, a confluência de 80% pode fornecer uma população celular adequada para o ensaio de ligação. Para as linhagens celulares deste experimento, MDA-MB-231 e HEK 293T, a confluência de 80% é adequada. Nesta fase, prossiga para a secção 4, o ensaio vinculativo. Verifique sempre a expressão da proteína de interesse, usando mAbs específicos para essa proteína.

4. Ensaio vinculativo

NOTA: A Figura 2 resume as etapas necessárias no ensaio de vinculação em células aderentes.

1. Num armário de biossegurança da classe II, recolher as células de cada balão em tubos do seguinte modo:
   1. Recolher e deitar fora o meio no balão, adicionar 2 ml de PBS, espalhá-lo sobre as células e, em seguida, recolher e descartar o PBS. Repita esta etapa mais duas vezes para remover todos os vestígios de mídia que podem inativar a tripsina. Adicionar 1 ml de 0,25% de tripsina/EDTA a cada balão e incubar durante 5-10 min a 37 o C. Visualize ^odescolamento das células ao microscópio.
   2. Adicione 1 mL de meio completo às células e pipete as células para cima e para baixo para fazer uma suspensão de célula única. Pipetar as células para um tubo adequado e centrifugar a 200 × g durante 5 minutos.
      NOTA: Para as células não aderentes, recolher as células num tubo, centrifugar (200 × g, 5 min) e passar ao passo 4.1.3.
   3. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 1 mL de meio fresco. Conte as células usando a coloração azul de tripano, diluindo um certo volume de suspensão celular com azul de tripano. Distribua ~15 μL da mistura entre um hemocitômetro e um copo de cobertura. Conte as células conforme descrito anteriormente¹⁸, usando a equação (2):
      (2)
      NOTA: Utilize o volume mínimo possível de suspensão celular e tome nota do factor de diluição. Por exemplo, misturar volumes iguais de suspensão celular e azul de tripano a 0,04% dá um fator de diluição de 2. Garantir alta viabilidade (células vivas / células totais × 100) de ~ 90% para a maioria das linhagens celulares aderentes antes de prosseguir. Células mortas não especificamente absorvem aptâmeros e alteram os resultados¹⁹. É possível usar outras técnicas de contagem de células, como usar um contador de células.
   4. Colete o número necessário de células, certificando-se de ter 10 × 10⁴ células por amostra de teste. Considere um volume extra de 10% para erro de pipetagem.
      NOTA: É importante manter sempre a mesma contagem de células entre experimentos e replicações.
   5. Incubar as células a 37 °C durante 2 h para permitir a estabilização da proteína de interesse na membrana celular após descolamento enzimático.
      NOTA: Este período de incubação pode diferir de acordo com a proteína de interesse.
2. Durante esta incubação de 2 h:
   1. Ajustar a temperatura da centrífuga para 4 °C. Deixe o RNAt e os estoques de aptâmero à temperatura ambiente ou no gelo para descongelar. Para proteger a molécula repórter de fluorescência, proteja os tubos de aptâmero da luz.
      NOTA: O papel do RNAt é bloquear os locais de ligação do ácido nucleico.
   2. Preparar o tampão SELEX, BB, WB e BiB (ver secção 1), mantendo-os todos no gelo ou a 4 °C. Coloque a máquina termocicladora em um ciclo vazio. Coloque uma placa preta de 96 poços e tubos de citometria de fluxo no gelo.
      NOTA: Colocar o termociclador em um ciclo vazio prepara o sistema de resfriamento e aquecimento e ajuda a gerar resultados mais reprodutíveis.
3. Após a incubação de 2 h, centrifugar as células a 500 × g por 5 min. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 500 μL de BB. Incubar as células a 4 °C durante 30 minutos com mistura intermitente.
4. Durante esta incubação de 30 minutos, realize a dobragem do aptâmero da seguinte forma:
   1. Completar as concentrações de 2x de aptâmeros (ver secção 2) e, em seguida, misturar e incubar os aptâmeros na máquina termocicladora, de acordo com as condições de dobragem exigidas. Para este aptâmero EpCAM, use as seguintes condições de dobragem de 95 °C, 5 min, seguido por 22 °C, 10 min, e 37 °C, 15 min.
      NOTA: Inclua sempre um controlo negativo (ou seja, tampão SELEX sem aptâmeros).
5. Após a incubação de 30 min, centrifugar as células (500 × g, 5 min, 4 °C), remover o sobrenadante, adicionar 1 mL de WB e centrifugar as células novamente (500 × g, 5 min, 4 °C). Remova o sobrenadante e ressuspenda as células em um volume adequado do BiB.
6. Pipetar 50 μL das células ressuspensas em cada poço de uma placa preta gelada de 96 poços. Mantenha as células no gelo para inibir a internalização da proteína de interesse.
7. Pipetar 50 μL dos aptâmeros para um volume de 50 μL de células, misturar e incubar no escuro a 4 °C durante 30 min. Centrifugar a placa a 500 × g, 5 min, 4 °C e remover cuidadosamente o sobrenadante.
8. Ressuscite cuidadosamente o pellet em WB e centrifugar a 500 × g durante 5 min. Repetir a etapa de lavagem (4.7) 2x e ressuspender em 100 μL de WB para análise citométrica de fluxo.
   NOTA: Consulte a Figura 3 para obter um diagrama de interações entre aptâmeros e células.

Figura 2: Um diagrama que descreve as etapas na execução de um ensaio de ligação à proteína do aptâmero. Abreviaturas: SELEX = Evolução Sistemática de Ligantes por Enriquecimento EXPONENCIAL; BB = Buffer de Bloqueio; WB = Tampão de Lavagem; BiB = buffer de ligação. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Um diagrama mostrando os diferentes tipos de células e aptâmeros necessários para executar o ensaio de ligação do aptâmero. Abreviação: EpCAM = molécula de adesão celular epitelial. Esta figura foi criada usando Biorender.com. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Citometria de fluxo e análise dos dados

NOTA: Antes de ligar o citômetro de fluxo, certifique-se de que não há "bolhas" nas unidades de filtro de membrana para a solução de desligamento, solução de limpeza e fluido da bainha (NaCl a 0,9%). "Sangra" bolhas se houver bolhas nas cápsulas. Certifique-se de que o recipiente de resíduos está vazio e os recipientes de fluido da bainha, água e 1% de água sanitária em água ultrapura estão cheios.

1. Ligue o citômetro de fluxo e, em seguida, o computador.
   NOTA: Os detalhes da execução do citômetro de fluxo explicados aqui são específicos da máquina e do software demonstrados no vídeo (consulte Tabela de materiais). Outro software exigiria treinamento apropriado para uso.
2. Abra o software de análise de citometria de fluxo, faça login no programa e, na guia Citômetro , execute o Fluidics Start up.
3. Para criar um novo experimento, na guia experimento, clique em Nova Pasta e nomeie a pasta/experimento adequadamente.
4. Clique em nova pasta para realçar e, em seguida, na guia experimento novamente, clique em Novo experimento e nomeie o experimento adequadamente.
5. Para adicionar a primeira amostra/espécime, na guia experimento, clique em Nova amostra e nomeie essa amostra apropriadamente (nome da linhagem celular/amostra de controle/amostra experimental).
6. Para adicionar uma amostra de tubo, realce a amostra (grupo) e, na guia experimento , clique em Novo tubo. Adicione o número apropriado de tubos e o nome.
7. Para preparar os gráficos necessários, na guia planilha , abra uma nova planilha. Quando a nova janela da planilha aparecer, abra o seguinte usando a tela da planilha (passe o mouse sobre o logotipo/imagens para encontrar os nomes):
   1. Prepare um gráfico de mancha de pontos de dispersão para frente (FSC) versus dispersão lateral (SCC) para selecionar a população de interesse. Defina o primeiro portão identificando e selecionando a população de interesse (P1) em um gráfico de densidade de dispersão para frente e para o lado. Exclua os detritos, que constituem a população com o menor sinal de dispersão para a frente.
      Observação : O parâmetro FSC detecta células ou eventos com base em seu tamanho e o SCC os discrimina com base em sua granularidade²⁰.
   2. Prepare um gráfico de mancha de pontos de área FSC (FSC-A) versus altura FSC (FSC-H) para selecionar a população de célula única. Defina a segunda porta excluindo as populações de células duplas, pois as células duplas afetam consideravelmente os resultados e as conclusões. Exclua duplicatas usando gráficos de densidade FSC-H versus FSC-A, em que células do mesmo tamanho mostram uma área e altura semelhantes. Assim, os singlets ficam agrupados diagonalmente e separados dos dubletos.
      NOTA: FSC é aproximadamente proporcional ao tamanho da célula. Os pulsos de tensão são definidos como FSC-H, a intensidade do sinal, FSC-largura que reflete o tamanho da célula e a duração do sinal, e FSC-A, que é H × W. Doublets têm um valor duplo de largura e área; portanto, o gating para singlets é baseado na detecção de desproporções entre H, W e A causadas por dubletes.
   3. Prepare um histograma do número de eventos contra o fluoróforo de interesse.
8. Antes de iniciar a citometria de fluxo, certifique-se de que o painel de aquisição para controlar a aquisição da amostra, o inspetor e o citômetro para ajustar os parâmetros de tensão, bem como a planilha com todos os gráficos, estejam abertos.
   NOTA: Pelo menos 100 μL de uma suspensão de 10 × 10⁴ células em um tubo de citometria de fluxo são necessários para realizar a análise. Especialmente em caso de menores viabilidades, a coloração com iodeto de propídio pode ser realizada para selecionar a população celular viável^21,22.
9. Para executar a primeira amostra, no lado esquerdo da tela, verifique se a seta que aponta para o tubo está verde. Se esta seta não estiver verde, clique na seta para torná-la verde.
10. Usando uma pipeta, transfira cada amostra da placa preta de 96 poços para um tubo de citometria de fluxo. Execute a amostra de controle não tratada e não manchada em uma velocidade baixa.
11. No painel de aquisição, escolha um número apropriado de eventos a serem registrados (30.000), altere a taxa de fluxo para baixa e clique em Adquirir Dados.
12. Ajuste a tensão para os parâmetros FSC e SCC. Certifique-se de que a população celular esteja centralizada dentro do gráfico de pontos e que nenhuma célula esteja tocando nenhum dos eixos do gráfico para evitar a perda das células de interesse.
13. Aumente a velocidade de aquisição para média ou alta para analisar as amostras mais rapidamente, mas não exceda mais de 200 eventos/s. Em seguida, clique em Registrar dados.
14. Realizar o gating para P1 (Figura 4A) e a população unicelular (Figura 4B). Construa o histograma dos eventos contra o fluorocromo utilizado e selecione P1 com base nos dados (aloficocianina (APC) neste caso) (Figura 4C).
15. Depois de ajustar a tensão, o controle e o registro dos dados, retire a amostra e clique em Avançar tubo.
16. Insira a próxima amostra e repita os dados de gravação para todas as amostras de controle e teste (Figura 3).
17. Depois que todos os dados forem coletados, lave o citômetro de fluxo executando três tubos de água sanitária a 50%, enxágue FACS e água ultrapura, cada um por 5 minutos a uma alta taxa de fluxo.
18. Em seguida, no menu suspenso Citômetro , clique em Fluidics Shut Down ( Fluidics Shut Down).
19. Antes de fechar o software e desligar a máquina e o computador, exporte os resultados como arquivos .fcs para uma unidade USB para transferi-los e analisá-los, da seguinte maneira:
    1. No software de análise, pressione o botão NEW para criar um novo documento e uma nova janela para lidar com a análise. Arraste os arquivos de exemplo para a nova janela.
    2. Clique duas vezes para abrir a amostra não manchada. Escolha a população P1, clique duas vezes na população P1 para criar um gráfico FSC-H versus FSC-A e porta a população de célula única.
    3. Clique duas vezes nas células individuais fechadas para criar um histograma de eventos contra o fluorocromo usado.
    4. Na janela original, selecione P1 e células individuais e arraste-as para Todas as amostras para que todas as amostras agora contenham o mesmo gating.
    5. Clique no botão Editor de layout para abrir a janela Layouts . Arraste duas amostras (controle e teste) uma sobre a outra para criar um histograma de sobreposição.

Resultados

Um aspecto importante da descoberta e desenvolvimento de novos medicamentos é garantir a seletividade e a especificidade do candidato a medicamento. Isso significa que o candidato a medicamento deve ser capaz de discriminar entre diferentes células e afetar apenas a população celular de interesse (seletividade). A seletividade é estudada usando linhagens celulares que diferem em termos de expressão da proteína de interesse. Neste estudo, as linhagens celulares MDA-MB-231 e HEK 293T foram escolhidas como células E...

Discussão

O principal desafio com o desenvolvimento de novos aptâmeros é a falta de diretrizes padrão que se aplicam a diferentes etapas desse processo. McKeague et al. demonstraram recentemente alguns dos desafios associados, que levam a apresentações pouco claras de dados em publicações e falha em replicar a pesquisa. Propuseram diretrizes fundamentais necessárias para a consideração na caracterização dos aptâmeros¹⁹. Um ensaio de ligação de aptâmeros é uma etapa crítica na triagem e/ou ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes with attached lid	Sigma-Aldrich	T6649
15 mL CellStar blue screw cap, conical bottom tube	Greiner Bio One	188271
5 mL serological pipettes	Greiner Bio One	606180
BD FACSCanto II Flow Becton Dickinson Cytometer	Becton Dickinson	N/A
BD FACSDiva V9.0	BD Biosciences	N/A
Bovine Serum Albumin (BSA), Lyophilized powder	Sigma-AldrichTM	A7906-50G
Bright-line Hemocytometer	Sigma-Aldrich	Z359629
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) High Glucose Media Powder	Life Technologies	12100046
Dulbecco’s Phosphate- Buffered Saline (DPBS)	Life Technologies	21300025
FlowJo, LLC 10.8.1	BD Biosciences	N/A
Foetal Bovine Serum (FBS)	Bovogen	SFBS-F
HEK293T	American Type Culture Collection	ACS-4500
Heracell 150i CO2 Incubator	Thermo Fisher Scientific	N/A
Heraeus Megafuge 16R Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	N/A
Magnesium Chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266
MDA-MB-231	American Type Culture Collection	CRM-HTB-26
Microplate, PS, 96 well, F-bottom (Chimney well), Black	Greiner Bio One	655076
MiniAmp Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific	A37834
Phosphate-Buffered Saline (PBS) tablets	Life Technologies	18912014
Pyrogen- and RNase-free ultrapure water	Milli-Q
T75 Cell Culture flask	Cellstar	658170
TENN	Integrated DNA Technologies	N/A	5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3
TEPP	Integrated DNA Technologies	N/A	5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′
Transfer RNA (tRNA)	Sigma-Aldrich	R8508-5X1ML
Trypan Blue Solution	Life Technologies	15250061
Trypsin-EDTA	Gibco	15400054