Un método escalable basado en células para la evaluación funcional de variantes de Ube3a

Resumen

Se desarrolló un método simple y escalable para evaluar la importancia funcional de las variantes sin sentido en Ube3a, un gen cuya pérdida y ganancia de función están relacionadas tanto con el síndrome de Angelman como con el trastorno del espectro autista.

Resumen

El aumento del uso de la secuenciación en medicina ha identificado millones de variantes codificantes en el genoma humano. Muchas de estas variantes ocurren en genes asociados con trastornos del neurodesarrollo, pero el significado funcional de la gran mayoría de las variantes sigue siendo desconocido. El presente protocolo describe el estudio de variantes para Ube3a, un gen que codifica una ubiquitina ligasa E3 vinculada tanto al autismo como al síndrome de Angelman. La duplicación o triplicación de Ube3a está fuertemente relacionada con el autismo, mientras que su eliminación causa el síndrome de Angelman. Por lo tanto, comprender la valencia de los cambios en la actividad de la proteína UBE3A es importante para los resultados clínicos. Aquí, se describe un método rápido basado en células que empareja variantes de Ube3a con un reportero de la vía Wnt. Este ensayo simple es escalable y se puede utilizar para determinar la valencia y magnitud de los cambios de actividad en cualquier variante de Ube3a . Además, la facilidad de este método permite la generación de una gran cantidad de información estructura-función, que se puede utilizar para obtener información profunda sobre los mecanismos enzimáticos de UBE3A.

Introducción

Los recientes avances tecnológicos han hecho que la secuenciación de exomas y genomas sea rutinaria en entornos clínicos ^1,2. Esto ha llevado al descubrimiento de un gran número de variantes genéticas, incluyendo millones de variantes sin sentido que típicamente cambian un aminoácido en una proteína. Comprender el significado funcional de estas variantes sigue siendo un desafío, y solo una pequeña fracción (~2%) de las variantes sin sentido conocidas tienen una interpretación clínica ^1,3.

Un ejemplo destacado de este problema es Ube3a, un gen que codifica una ubiquitina ligasa E3 que se dirige a las proteínas de sustrato para su degradación⁴. Ube3a reside dentro del cromosoma 15q11-13 y se expresa exclusivamente a partir del alelo heredado materno ^5,6,7. Las observaciones de la genética de la enfermedad sugieren fuertemente que la actividad insuficiente o excesiva de la enzima UBE3A causa distintos trastornos del desarrollo neurológico. La deleción del cromosoma materno 15q11-13 causa el síndrome de Angelman (EA)8, un trastorno caracterizado por discapacidad intelectual grave, deficiencias motoras, convulsiones, un comportamiento feliz con sonrisas frecuentes y rasgos faciales dismórficos ^8,9,10. En contraste, la duplicación o triplicación del cromosoma materno 15q11-13 causa el síndrome de Dup15q, una condición heterogénea reconocida como una de las formas sindrómicas más prevalentes de autismo^11,12,13. Además, hay cientos de variantes sin sentido identificadas en Ube3a, la mayoría de las cuales se consideran variantes de significado incierto (VUS) ya que su significado funcional y clínico son desconocidos. Por lo tanto, existe un interés considerable en desarrollar métodos que puedan evaluar empíricamente las variantes de Ube3a para determinar si contribuyen a la enfermedad del desarrollo neurológico.

La enzima UBE3A pertenece a la familia de dominios HECT (homólogos a E6-AP C-terminal) de ligasas de ubiquitina E3 que poseen el dominio HECT del mismo nombre, que contiene la maquinaria bioquímica necesaria para aceptar ubiquitina activada de enzimas E2 y transferirla a proteínas sustrato¹⁴. Históricamente, la caracterización de las enzimas E3 se ha basado en sistemas in vitro reconstituidos que requieren un conjunto de proteínas purificadas 4,15,16. Tales métodos son lentos y requieren mucha mano de obra y no son susceptibles de evaluar la actividad de un gran número de variantes. En trabajos anteriores, se identificó UBE3A para activar la vía Wnt en las células HEK293T mediante la modulación de la función del proteasoma para ralentizar la degradación de la β-catenina¹⁷. Esta información permite el uso de reporteros de la vía Wnt como un método eficiente y rápido para identificar variantes de pérdida y ganancia de función de Ube3a¹⁸. El siguiente protocolo describe en detalle un método para generar variantes de Ube3a, así como un reportero basado en luciferasa para evaluar los cambios en la actividad de las variantes de Ube3a.

Protocolo

1. Clonación de mutagénesis para generar variantes de Ube3a

1. Clone todas las variantes de Ube3a en el plásmido pCIG2 (Figura 1A), un vector bicistrónico que contiene un promotor de β-actina de pollo y un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES) para la expresión de EGFP¹⁹. Las construcciones Ube3a de longitud completa contienen una secuencia de etiquetas Myc de N-terminal y se clonan en pCIG2 usando un sitio SacI de 5' y un sitio XmaI de 3'. Además, los sitios EcoRI, EcoRV y PstI naturales dentro de la secuencia de codificación Ube3a también se utilizan para subclonar fragmentos.
   NOTA: Las variantes no identificadas para Ube3a se pueden obtener a través de la literatura y en repositorios de acceso público como la base de datos ClinVar¹. Se pueden obtener variantes adicionales no reportadas a través de la comunicación personal con los centros médicos.
2. Utilice un método adaptado de mutagénesis de megacebadores de dos pasos²⁰ para introducir mutaciones en el marco de lectura Ube3a . En el primer paso, diseñar el oligonucleótido mutagénico que contiene la mutación deseada (el ejemplo que se muestra en este protocolo es generar una variante UBE3A Q588E) flanqueada por al menos 30 pares de bases (pb) de homología 5' y 3' a la mutación (Figura 1B y Tabla 1).
3. Utilice el oligonucleótido mutagénico junto con un oligonucleótido complementario para la primera ronda de PCR para generar un megacebador de 200-400 pb que contenga la mutación (Figura 1C; Cuadro 2 y Cuadro 3). Utilice los 50 μL completos del volumen de reacción de PCR para la electroforesis en gel de agarosa utilizando un gel al 1% y la posterior purificación del gel (Tabla de materiales). Eluya el producto de PCR en 30 μL de_H2Odesionizado (_diH2O) para su uso en el paso de PCR de segunda ronda a continuación.
4. Configure la segunda ronda de PCR como se indica (Figura 1C; Cuadro 2 y Cuadro 3). Este paso generará fragmentos de ADN más grandes (típicamente ~ 1-1.5 kb de longitud) que contienen los sitios de mutación y restricción terminal adecuados para la subclonación (Figura 1C).
5. Después de completar la reacción de PCR, purificar el producto resultante utilizando un kit de purificación de PCR (Tabla de materiales). Eluya en 30 μL y digiera todo el producto purificado y la construcción pCIG2 Ube3a WT con las enzimas de restricción apropiadas (el ejemplo muestra la digestión con EcoRI y XmaI).
6. Después de 2 h de digestión a 37 °C, resolver los productos de digestión mediante electroforesis en gel de agarosa (gel al 1%) y purificar los productos apropiados. Configure las ligaduras de acuerdo con el protocolo del fabricante (Tabla de materiales), transforme los productos de ligadura en una cepa bacteriana DH10B (Tabla de materiales) y luego coloque una placa con ampicilina (100 μg / ml) selección.
7. Al día siguiente, escoja de dos a cuatro colonias para inocular cultivos de 3 ml que contengan caldo Luria (LB) y ampicilina de 100 μg/ml. Dejar que los cultivos crezcan durante la noche a 37 °C en una incubadora orbital con agitación (225 rpm).
8. Al día siguiente, use 1-1.5 ml del cultivo bacteriano para minipreparar el ADN plásmido (Tabla de materiales). Guardar el cultivo restante colocándolos a 4 °C. Examinar los plásmidos miniprepped mediante secuenciación de Sanger utilizando un oligonucleótido que se une a ~200 pb de la mutación deseada.
9. Utilice los cultivos bacterianos guardados a 4 °C para volver a inocular 50 ml de cultivos para midiprep el plásmido correcto (Tabla de materiales). Secuencie completamente la secuencia de codificación Ube3a para validar la secuencia correcta del ADN.
10. Crear existencias funcionales de plásmidos variantes de Ube3a, así como el reportero activado por β-catenina (BAR)²¹, TK-Renilla luciferasa, Ube3a muerto por ligasa (mutación UBE3A C820A) y vector vacío pCIG2 a una concentración de 100 ng/μL utilizando_H2Oestéril para los pasos posteriores de transfección.

2. Preparación y transfección de células embrionarias humanas 293T (HEK293T)

1. Realizar los ensayos en células HEK293T cultivadas en el medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco presuplementado con glutamina, suero bovino fetal al 10% (FBS) y agente antibiótico-antimicótico como se describió anteriormente¹⁷. Cultivar las células en una incubadora estéril y humidificada a 37 °C con un 5% de_CO2.
2. Usando un gabinete de bioseguridad, primero coloque las células HEK293T suspendidas en placas de fondo plano de 96 pocillos tratadas con cultivo de tejidos a una densidad de 2.2 × 10⁴ células por pocillo en 100 μL de medios de cultivo y déjelas crecer durante la noche.
3. En el segundo día, transfectar las células en un gabinete de bioseguridad con plásmidos reporteros Firefly y Renilla luciferasa (Tabla 4) y plásmidos Ube3a por triplicado. Realizar las transfecciones en 10 μL de volumen total por pocillo utilizando una relación 10:1:8 de plásmidos (50 ng de BAR, 5 ng de TK-Renilla y 40 ng de plásmido Ube3a por pocillo, respectivamente), como se describió anteriormente¹⁸, y 0,4 μL de reactivo de transfección (Tabla 4).
   NOTA: Para cada experimento, un vector vacío (solo GFP) y un plásmido que codifica la ligasa-muerta Ube3a también se transfectan para servir como controles negativos.
4. Cree una mezcla maestra para las transfecciones para cada variante en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml (Tabla 4) e incube a temperatura ambiente (RT) durante 15 min. Después de la incubación, agite suavemente la mezcla de transfección golpeando el tubo y luego agregue 10 μL de la mezcla de transfección directamente a los medios de cultivo existentes en los pocillos.
5. Después, devuelva las células a la incubadora y permita que los plásmidos se expresen durante 48 h. No es necesario reemplazar los medios de crecimiento.
6. Monitoree la eficiencia de transfección mediante fluorescencia GFP usando un microscopio de fluorescencia. Las células HEK293T se transectan eficientemente mediante este método, y el >80% de las células deben expresar GFP después de 48 h.

3. Medición de la actividad de la luciferasa

NOTA: La actividad de la luciferasa se evalúa utilizando un sistema disponible comercialmente que analiza Firefly y Renilla luciferase (Tabla de materiales) de acuerdo con el protocolo del fabricante.

1. Aspire cuidadosamente los medios de cultivo de las células HEK293T transfectadas y luego lave las células con solución salina tamponada con fosfato frío (PBS). Aspirar el PBS y lisar las células añadiendo 25 μL de tampón de lisis no desnaturalizante e incubar durante 15 min con un suave balanceo sobre hielo.
2. Después, añadir 20 μL del lisado resultante (no es necesaria centrifugación) en una nueva placa de ensayo de 96 pocillos que contenga 100 μL de un reactivo de sustrato de luciferasa Firefly. Mezclar el plato suavemente dando golpecitos.
3. Cargue la placa en un lector de placas y mida la luminiscencia utilizando un detector superior con una altura de lectura de 1 mm y un tiempo de integración de 1 s.
   NOTA: Es posible que sea necesario ajustar la ganancia del detector en función de la intensidad de la señal.
4. Inmediatamente después de leer la luminiscencia de la luciferasa Firefly, agregue 100 μL de sustrato de luciferasa Renilla a los pocillos. Este paso apaga simultáneamente la actividad luciferasa Firefly mientras evalúa la actividad de la luciferasa Renilla. Mezclar las muestras agitando suavemente la placa y medir la luminiscencia de nuevo para evaluar la actividad de la Renilla luciferasa.
   NOTA: Si bien se pueden usar otras placas para este ensayo, el uso de placas con marcos negros y pocillos blancos proporcionará los resultados más sensibles, ya que esto amplifica la señal de luciferasa y minimiza el ruido.
5. Cuantifique las respuestas del reportero como la relación luciferasa Firefly a Renilla luciferasa (Firefly/Renilla), y promedie los valores de las mediciones triplicadas. Después, normalice el valor de Firefly/Renilla para cada variante contra los valores de las células que expresan Ube3a de tipo salvaje (WT) para comparar la actividad relativa de las proteínas variantes.

Resultados

El cribado funcional a gran escala de las variantes sin sentido de Ube3a identifica un amplio panorama de mutaciones de pérdida y ganancia de función
Trabajos previos con mutantes Ube3a sugirieron que la respuesta Wnt puede servir como un reportero de la actividad celular de la proteína UBE3A. Estas observaciones se ampliaron y se realizaron experimentos de validación adicionales para investigar si el ensayo BAR es adecuado para informar una gama de actividades UBE3A en la célul...

Discusión

El protocolo descrito aquí proporciona un método eficiente y escalable para evaluar la actividad enzimática de las variantes de Ube3a. Hay varios detalles técnicos que merecen una cuidadosa consideración al usar este ensayo. Una consideración es la elección de los plásmidos reporteros Wnt utilizados en este ensayo. El protocolo descrito aquí utiliza específicamente el reportero activado por β-catenina (BAR)²¹, un informador que contiene un concatemer de 12 elementos de respuest...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red	Gibco	25300-054
1 Kb DNA ladder	Lambda Biotech	M108-S
100 bp DNA Ladder	Lambda Biotech	M107
10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10 mM ATP	New England BioLabs	B0202A
5x Phusion HF Reaction Buffer	New England BioLabs	B0518S
Antibiotic-Antimycotic Solution	Corning	30004CI
Black/White Isoplate-96 Black Frame White Well plate	PerkinElmer	6005030
Carbenicillin Disodium Salt	Midwest Scientific	KCC46000-5
Countess cell counting chamber  slides	Invitrogen by Thermo Fisher Scientific	C10283
Countess II Automated Cell Counter	life technologies		Cell counting machine
Custom DNA oligos	Integrated DNA Technologies (IDT)
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix	New England BioLabs	N0447S
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate	Gibco	10569044	Basal medium for supporting the growth of HEK293T cell line
DPBS (1x)	Gibco	14190-136
Dual-Luciferase Reporter Assay System	Promega	E1910
EcoRI-HF	New England BioLabs	R3101S	Restriction enzyme
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated	Gibco	16140071	Fetal bovine serum
Fisherbrand Surface Treated Tissue Culture Dishes	Fisherbrand	FB012924
FuGENE 6 Transfection Reagent	Promega	E2691
Gel Loading Dye Purple (6x)	New England BioLabs	B7024A
HEK293T cells	ATCC	CRL-3216
High Efficiency ig 10B Chemically Competent Cells	Intact Genomics	1011-12	E. coli DH10B cells
HiSpeed Plasmid Midi Kit	Qiagen	12643	Midi prep
pCIG2 plasmid
pGL3 BAR plasmid
Phusion HF DNA Polymerase	New England BioLabs	M0530L	DNA polymerase
ProFlex 3 x 32 well PCR System	Applied biosystems by life technologies		Thermocycler
pTK Renilla plasmid
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)	Qiagen	27106	Mini prep
QIAquick Gel Extraction Kit (250)	Qiagen	28706	Gel purification
QIAquick PCR Purification Kit (250)	Qiagen	28106	PCR purification
rCutSmart Buffer	New England BioLabs	B6004S
SacI-HF	New England BioLabs	R3156S	Restriction enzyme
Synergy HTX Multi-Mode Reader	BioTek		Plate reader runs Gen5 software v3.08 (BioTek)
T4 DNA Ligase	New England BioLabs	M0202L	Ligase
TAE Buffer, Tris-Acetate-EDTA, 50x Solution, Electrophoresis	Fisher Scientific	BP13324
Tissue Culture Plate 96 wells, Flat Bottom	Fisherbrand	FB012931
UltraPure Ethidium Bromide Solution	Invitrogen by Thermo Fisher Scientific	15585011
XmaI	New England BioLabs	R0180S	Restriction enzyme