JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Fonksiyon kaybı ve kazancı hem Angelman sendromu hem de otizm spektrum bozukluğu ile bağlantılı olan bir gen olan Ube3a'daki yanlış anlam varyantlarının fonksiyonel önemini değerlendirmek için basit ve ölçeklenebilir bir yöntem geliştirilmiştir.

Özet

Tıpta dizilemenin artan kullanımı, insan genomunda milyonlarca kodlama varyantı tanımlamıştır. Bu varyantların birçoğu nörogelişimsel bozukluklarla ilişkili genlerde görülür, ancak varyantların büyük çoğunluğunun fonksiyonel önemi bilinmemektedir. Mevcut protokol, hem otizm hem de Angelman sendromuna bağlı bir E3 ubikitin ligazını kodlayan bir gen olan Ube3a için varyantların incelenmesini açıklamaktadır. Ube3a'nın çoğaltılması veya çoğaltılması otizmle güçlü bir şekilde bağlantılıdır, oysa silinmesi Angelman sendromuna neden olur. Bu nedenle, UBE3A protein aktivitesindeki değişikliklerin değerini anlamak, klinik sonuçlar için önemlidir. Burada, Ube3a varyantlarını bir Wnt yol muhabiri ile eşleştiren hızlı, hücre tabanlı bir yöntem açıklanmaktadır. Bu basit tahlil ölçeklenebilir ve herhangi bir Ube3a varyantındaki aktivite değişikliklerinin değerini ve büyüklüğünü belirlemek için kullanılabilir. Dahası, bu yöntemin tesisi, UBE3A'nın enzimatik mekanizmaları hakkında derin bilgiler edinmek için kullanılabilecek çok sayıda yapı-işlev bilgisinin üretilmesine izin verir.

Giriş

Son teknolojik gelişmeler, ekzomların ve genomların dizilimini klinik ortamlarda rutin hale getirmiştir 1,2. Bu, tipik olarak bir proteindeki bir amino asidi değiştiren milyonlarca yanlış anlam varyantı da dahil olmak üzere çok sayıda genetik varyantın keşfedilmesine yol açmıştır. Bu varyantların fonksiyonel önemini anlamak bir zorluk olmaya devam etmektedir ve bilinen yanlış anlam varyantlarının sadece küçük bir kısmı (~% 2) klinik bir yoruma sahiptir 1,3.

Bu sorunun belirgin bir örneği, yıkım için substrat proteinlerini hedef alan bir E3 ubikitin ligazını kodlayan bir gen olan Ube3a'dır 4. Ube3a, kromozom 15q11-13 içinde bulunur ve sadece maternal kalıtsal alel 5,6,7'den eksprese edilir. Hastalık genetiğinden yapılan gözlemler, UBE3A enziminin yetersiz veya aşırı aktivitesinin farklı nörogelişimsel bozukluklara neden olduğunu kuvvetle göstermektedir. Maternal kromozom 15q11-13'ün silinmesi, ciddi zihinsel engellilik, motor bozukluklar, nöbetler, sık sık gülümseyen mutlu bir tavır ve dismorfik yüz özellikleri 8,9,10 ile karakterize bir bozukluk olan Angelman sendromuna (AS) 8'e neden olur. Buna karşılık, maternal kromozom 15q11-13'ün çoğaltılması veya çoğaltılması, otizmin en yaygın sendromik formlarından biri olarak kabul edilen heterojen bir durum olan Dup15q sendromuna neden olur11,12,13. Ek olarak, Ube3a'da tanımlanan yüzlerce yanlış anlam varyantı vardır, bunların çoğu, fonksiyonel ve klinik önemi bilinmediğinden, belirsiz öneme sahip varyantlar (VUS) olarak kabul edilir. Bu nedenle, nörogelişimsel hastalığa katkıda bulunup bulunmadıklarını belirlemek için Ube3a varyantlarını ampirik olarak değerlendirebilecek yöntemler geliştirmeye büyük ilgi vardır.

UBE3A enzimi, E2 enzimlerinden aktive ubikitini kabul etmek ve substrat proteinlerine aktarmak için gerekli biyokimyasal makineleri içeren isimsiz HECT alanına sahip olan E3 ubikitin ligazlarının HECT (E6-AP C-terminus'a homolog) alan ailesine aittir14. Tarihsel olarak, E3 enzimlerinin karakterizasyonu,saflaştırılmış proteinlerin bir topluluğunu gerektiren yeniden yapılandırılmış in vitro sistemlere dayanmaktadır 4,15,16. Bu tür yöntemler yavaş ve emek yoğundur ve çok sayıda varyantın aktivitesini değerlendirmeye uygun değildir. Önceki çalışmalarda, UBE3A'nın, β-katenin17'nin bozulmasını yavaşlatmak için proteazomun işlevini modüle ederek HEK293T hücrelerinde Wnt yolunu aktive ettiği tespit edildi. Bu içgörü, Wnt yol muhabirlerinin Ube3a18'in hem işlev kaybı hem de kazanç değişkenlerini tanımlamak için verimli ve hızlı bir yöntem olarak kullanılmasına izin verir. Aşağıdaki protokol, Ube3a varyantlarının aktivitesindeki değişiklikleri değerlendirmek için Lusiferaz tabanlı bir muhabirin yanı sıra Ube3a varyantlarını üretmek için bir yöntemi ayrıntılı olarak açıklamaktadır.

Protokol

1. Ube3a varyantları üretmek için mutagenez klonlaması

  1. Tüm Ube3a varyantlarını, EGFP ekspresyonu19 için bir tavuk-β-aktin promotörü ve bir iç ribozom giriş bölgesi (IRES) içeren bir bisistronik vektör olan pCIG2 plazmidine (Şekil 1A) klonlayın. Tam uzunluktaki Ube3a yapıları bir N-terminal Myc-tag dizisi içerir ve 5' SacI sitesi ve 3' XmaI sitesi kullanılarak pCIG2'ye klonlanır. Ek olarak, Ube3a kodlama dizisindeki doğal olarak oluşan EcoRI, EcoRV ve PstI siteleri de parçaları alt klonlamak için kullanılır.
    NOT: Ube3a için tanımlanmamış varyantlar, literatür aracılığıyla ve ClinVar veritabanı1 gibi kamuya açık depolarda elde edilebilir. Bildirilmemiş ek varyantlar, tıp merkezleriyle kişisel iletişim yoluyla elde edilebilir.
  2. Ube3a okuma çerçevesine mutasyonlar eklemek için uyarlanmış iki aşamalı megaprimer mutagenez yöntemi20 kullanın. İlk adımda, istenen mutasyonu içeren mutajenik oligonükleotidi tasarlayın (bu protokolde gösterilen örnek, mutasyona en az 30 baz çifti (bp) homoloji 5′ ve 3′ ile çevrili bir UBE3A Q588E varyantı oluşturmaktır (Şekil 1B ve Tablo 1).
  3. Mutasyonu içeren 200-400 bp'lik bir megaprimer oluşturmak için ilk tur PCR için tamamlayıcı bir oligonükleotid ile birlikte mutajenik oligonükleotidi kullanın (Şekil 1C; Tablo 2 ve Tablo 3). % 1'lik bir jel ve müteakip jel saflaştırması (Malzeme Tablosu) kullanarak agaroz jel elektroforezi için PCR reaksiyon hacminin 50 μL'sinin tamamını kullanın. PCR ürününü aşağıdaki ikinci tur PCR adımında kullanılmak üzere 30 μL deiyonize H2O (diH2O) içinde süzün.
  4. İkinci tur PCR'yi belirtildiği gibi ayarlayın (Şekil 1C; Tablo 2 ve Tablo 3). Bu adım, alt klonlama için uygun mutasyon ve terminal kısıtlama bölgelerini içeren daha büyük DNA fragmanları (tipik olarak ~ 1-1.5 kb uzunluğunda) üretecektir (Şekil 1C).
  5. PCR reaksiyonunun tamamlanmasından sonra, elde edilen ürünü bir PCR saflaştırma kiti (Malzeme Tablosu) kullanarak saflaştırın. 30 μL'de salınım yapın ve saflaştırılmış tüm ürünü ve pCIG2 Ube3a WT yapısını uygun kısıtlama enzimleri ile sindirin (örnek EcoRI ve XmaI ile sindirimi gösterir).
  6. 37 °C'de 2 saatlik sindirimden sonra, sindirim ürünlerini agaroz jel elektroforezi (% 1 jel) ile çözün ve uygun ürünleri jel saflaştırın. Üreticinin protokolüne (Malzeme Tablosu) göre ligasyonlar kurun, ligasyon ürünlerini DH10B bakteri suşuna (Malzeme Tablosu) dönüştürün ve ardından ampisilin (100 μg / mL) seçimi ile plaka.
  7. Ertesi gün, Luria Broth (LB) ve 100 μg / mL ampisilin içeren 3 mL kültürleri aşılamak için iki ila dört koloni seçin. Kültürlerin bir gecede 37 ° C'de bir yörüngesel inkübatörde sallanarak (225 rpm) büyümesine izin verin.
  8. Ertesi gün, plazmid DNA'sını en aza indirmek için 1-1.5 mL bakteri kültürü kullanın (Malzeme Tablosu). Kalan kültürü 4 °C'ye yerleştirerek kaydedin. Miniprepped plazmidleri, istenen mutasyondan ~ 200 bp'ye bağlanan bir oligonükleotid kullanarak Sanger dizilimi ile tarayın.
  9. Doğru plazmidin midiprep edilmesi için 50 mL kültürleri yeniden aşılamak için 4 ° C'de kaydedilen bakteri kültürlerini kullanın (Malzeme Tablosu). DNA'nın doğru dizisini doğrulamak için Ube3a kodlama dizisini tam olarak sıralayın.
  10. Sonraki transfeksiyon adımları için steril H 2 O kullanarak Ube3a varyantı plazmidlerinin yanı sıra β-katenin aktive edilmiş muhabir (BAR)21, TK-Renilla lusiferaz, ligaz-ölü Ube3a (UBE3A C820A mutasyonu) vepCIG2boş vektörünün çalışma stoklarını oluşturun.

2. İnsan embriyonik böbrek 293T (HEK293T) hücrelerinin hazırlanması ve transfeksiyonu

  1. Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamında (DMEM) yetiştirilen HEK293T hücrelerinde glutamin,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve daha önce tarif edildiği gibi antibiyotik-antimikotik ajan ile önceden desteklenmiş HEK293T hücrelerinde tahlilleri gerçekleştirin17. Steril, nemlendirilmiş bir inkübatördeki hücreleri% 5 CO2 ile 37 ° C'de büyütün.
  2. Bir biyogüvenlik kabini kullanarak, ilk önce askıya alınmış HEK293T hücrelerini, 100 μL kültür ortamında kuyu başına 2.2 × 104 hücre yoğunluğunda doku kültürü ile muamele edilmiş 96 kuyucuklu düz tabanlı plakalara yerleştirin ve bir gecede büyümelerini sağlayın.
  3. İkinci gün, bir biyogüvenlik kabinindeki hücreleri Firefly ve Renilla lusiferaz muhabir plazmidleri (Tablo 4) ve Ube3a plazmidleri üçlü olarak transfekte edin. Transfeksiyonları, daha önce tarif edildiği gibi 10: 1: 8 plazmid oranı (sırasıyla 50 ng BAR, 5 ng TK-Renilla ve kuyu başına 40 ng Ube3a plazmid) kullanarak kuyu başına toplam hacmin 10 μL'sinde gerçekleştirin18 ve 0.4 μL transfeksiyon reaktifi (Tablo 4).
    NOT: Her deney için, boş bir vektör (yalnızca GFP) ve bir plazmid kodlama ligaz ölü Ube3a da negatif kontroller olarak hizmet etmek üzere transfekte edilir.
  4. 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde (Tablo 4) her varyant için transfeksiyonlar için bir ana karışım oluşturun ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında (RT) inkübe edin. Kuluçkadan sonra, tüpe dokunarak transfeksiyon karışımını hafifçe çalkalayın ve ardından transfeksiyon karışımının 10 μL'sini doğrudan kuyucuklardaki mevcut büyüme ortamına ekleyin.
  5. Daha sonra, hücreleri inkübatöre geri döndürün ve plazmidlerin 48 saat boyunca eksprese olmasına izin verin. Büyüme ortamının değiştirilmesi gerekli değildir.
  6. Bir floresan mikroskobu kullanarak GFP floresan ile transfeksiyon verimliliğini izleyin. HEK293T hücreleri bu yöntemle verimli bir şekilde transfekte edilir ve hücrelerin% >80'i 48 saat sonra GFP eksprese etmelidir.

3. Lusiferaz aktivitesinin ölçülmesi

NOT: Luciferaz aktivitesi, üreticinin protokolüne göre hem Firefly hem de Renilla luciferase'i (Malzeme Tablosu) test eden ticari olarak temin edilebilen bir sistem kullanılarak değerlendirilir.

  1. Kültür ortamını transfekte HEK293T hücrelerinden dikkatlice aspire edin ve ardından hücreleri soğuk fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. PBS'yi aspire edin ve 25 μL denatüre olmayan lizis tamponu ekleyerek hücreleri lize edin ve buz üzerinde hafifçe sallanarak 15 dakika boyunca inkübe edin.
  2. Daha sonra, elde edilen lizatın 20 μL'sini (santrifüjleme gerekmez) 100 μL Firefly lusiferaz substrat reaktifi içeren yeni bir 96 kuyulu tahlil plakasına ekleyin. Plakayı hafifçe dokunarak karıştırın.
  3. Plakayı bir plaka okuyucuya yükleyin ve 1 mm okuma yüksekliğine ve 1 s entegrasyon süresine sahip bir üst dedektör kullanarak parlaklığı ölçün.
    NOT: Dedektörün kazancının, sinyalin gücüne göre ayarlanması gerekebilir.
  4. Firefly lusiferaz lüminesansını okuduktan hemen sonra, kuyucuklara 100 μL Renilla lusiferaz substratı ekleyin. Bu adım, Renilla lusiferaz aktivitesini değerlendirirken aynı zamanda Firefly lusiferaz aktivitesini söndürür. Numuneleri plakanın nazikçe çalkalanması ile karıştırın ve Renilla lusiferaz aktivitesini değerlendirmek için lüminesansı tekrar ölçün.
    NOT: Bu test için başka plakalar da kullanılabilirken, siyah çerçeveli ve beyaz kuyucuklu plakaların kullanılması, gürültüyü en aza indirirken lusiferaz sinyalini yükselttiği için en hassas sonuçları sağlayacaktır.
  5. Muhabirin yanıtlarını Firefly luciferase - Renilla luciferase oranı (Firefly / Renilla) olarak ölçün ve üçlü ölçümlerin değerlerinin ortalamasını alın. Daha sonra, varyant proteinlerin göreceli aktivitesini karşılaştırmak için her varyant için Firefly / Renilla değerini, vahşi tip (WT) Ube3a eksprese eden hücrelerin değerlerine karşı normalleştirin.

Sonuçlar

Ube3a yanlış anlam varyantlarının büyük ölçekli fonksiyonel taraması, fonksiyon kaybı ve kazancı mutasyonlarının geniş bir manzarasını tanımlar.
Ube3a mutantları ile yapılan önceki çalışmalar, Wnt yanıtının hücresel UBE3A protein aktivitesinin bir muhabiri olarak hizmet edebileceğini öne sürdü. Bu gözlemler genişletildi ve BAR testinin hücredeki bir dizi UBE3A aktivitesini rapor etmek için uygun olup olmadığını araştırmak için ek doğrulama d...

Tartışmalar

Burada açıklanan protokol, Ube3a varyantlarının enzimatik aktivitesini değerlendirmek için verimli ve ölçeklenebilir bir yöntem sağlar. Bu tahlili kullanırken dikkatli bir şekilde düşünülmesini gerektiren birkaç teknik ayrıntı vardır. Bir husus, bu tahlilde kullanılan Wnt muhabir plazmidlerinin seçimidir. Burada açıklanan protokol, özellikle TCF bağlanma bölgelerinin rekombinasyonunu ve kaybını en aza indirmek için özel olarak tasarlanmış bağlayıcı dizileriyle ayrılmış 12 T...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Simons Vakfı Bağımsızlık Köprüsü Ödülü (SFARI Ödülü #387972; J.J.Y.), Beyin ve Davranış Araştırma Vakfı'ndan (J.J.Y.) NARSAD Genç Araştırmacı Ödülü, Alfred P. Sloan Vakfı'ndan (J.J.Y.) Araştırma Bursu ve Angelman Sendromu Vakfı (J.J.Y.), Whitehall Vakfı (J.J.Y.) ve NIMH'den (R01MH122786; J.J.Y.).

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol redGibco25300-054
1 Kb DNA ladderLambda BiotechM108-S
100 bp DNA LadderLambda BiotechM107
10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10 mM ATPNew England BioLabsB0202A
5x Phusion HF Reaction BufferNew England BioLabsB0518S
Antibiotic-Antimycotic SolutionCorning30004CI
Black/White Isoplate-96 Black Frame White Well platePerkinElmer6005030
Carbenicillin Disodium SaltMidwest ScientificKCC46000-5
Countess cell counting chamber  slidesInvitrogen by Thermo Fisher ScientificC10283
Countess II Automated Cell Counter life technologiesCell counting machine
Custom DNA oligosIntegrated DNA Technologies (IDT)
Deoxynucleotide (dNTP) Solution MixNew England BioLabsN0447S
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvateGibco10569044Basal medium for supporting the growth of HEK293T cell line
DPBS (1x)Gibco14190-136
Dual-Luciferase Reporter Assay SystemPromegaE1910
EcoRI-HF New England BioLabsR3101SRestriction enzyme
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivatedGibco16140071Fetal bovine serum
Fisherbrand Surface Treated Tissue Culture DishesFisherbrandFB012924
FuGENE 6 Transfection ReagentPromegaE2691
Gel Loading Dye Purple (6x)New England BioLabsB7024A
HEK293T cellsATCCCRL-3216
High Efficiency ig 10B Chemically Competent CellsIntact Genomics1011-12E. coli DH10B cells
HiSpeed Plasmid Midi KitQiagen12643Midi prep
pCIG2 plasmid
pGL3 BAR plasmid
Phusion HF DNA PolymeraseNew England BioLabsM0530LDNA polymerase
ProFlex 3 x 32 well PCR SystemApplied biosystems by life technologiesThermocycler
pTK Renilla plasmid
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)Qiagen27106Mini prep
QIAquick Gel Extraction Kit (250)Qiagen28706Gel purification
QIAquick PCR Purification Kit (250)Qiagen28106PCR purification
rCutSmart BufferNew England BioLabsB6004S
SacI-HFNew England BioLabsR3156SRestriction enzyme
Synergy HTX Multi-Mode ReaderBioTek Plate reader runs Gen5 software v3.08 (BioTek)
T4 DNA LigaseNew England BioLabsM0202LLigase
TAE Buffer, Tris-Acetate-EDTA, 50x Solution, ElectrophoresisFisher ScientificBP13324
Tissue Culture Plate 96 wells, Flat BottomFisherbrandFB012931
UltraPure Ethidium Bromide SolutionInvitrogen by Thermo Fisher Scientific15585011
XmaINew England BioLabsR0180SRestriction enzyme

Referanslar

  1. Landrum, M. J., et al. ClinVar: Public archive of relationships among sequence variation and human phenotype. Nucleic Acids Research. 42, 980-985 (2014).
  2. Lek, M., et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).
  3. Starita, L. M., et al. Variant interpretation: Functional assays to the rescue. American Journal of Human Genetics. 101 (3), 315-325 (2017).
  4. Scheffner, M., Huibregtse, J. M., Vierstra, R. D., Howley, P. M. The HPV-16 E6 and E6-AP complex functions as a ubiquitin-protein ligase in the ubiquitination of p53. Cell. 75 (3), 495-505 (1993).
  5. Albrecht, U., et al. Imprinted expression of the murine Angelman syndrome gene, Ube3a, in hippocampal and Purkinje neurons. Nature Genetics. 17 (1), 75-78 (1997).
  6. Rougeulle, C., Glatt, H., Lalande, M. The Angelman syndrome candidate gene, UBE3A/E6-AP, is imprinted in brain. Nature Genetics. 17 (1), 14-15 (1997).
  7. Vu, T. H., Hoffman, A. R. Imprinting of the Angelman syndrome gene, UBE3A, is restricted to brain. Nature Genetics. 17 (1), 12-13 (1997).
  8. Kishino, T., Lalande, M., Wagstaff, J. UBE3A/E6-AP mutations cause Angelman syndrome. Nature Genetics. 15 (1), 70-73 (1997).
  9. Jiang, Y. H., et al. Mutation of the Angelman ubiquitin ligase in mice causes increased cytoplasmic p53 and deficits of contextual learning and long-term potentiation. Neuron. 21 (4), 799-811 (1998).
  10. Mabb, A. M., Judson, M. C., Zylka, M. J., Philpot, B. D. Angelman syndrome: Insights into genomic imprinting and neurodevelopmental phenotypes. Trends in Neuroscience. 34 (6), 293-303 (2011).
  11. Hogart, A., Wu, D., LaSalle, J. M., Schanen, N. C. The comorbidity of autism with the genomic disorders of chromosome 15q11.2-q13. Neurobiology of Disease. 38 (2), 181-191 (2010).
  12. Urraca, N., et al. The interstitial duplication 15q11.2-q13 syndrome includes autism, mild facial anomalies and a characteristic EEG signature. Autism Research. 6 (4), 268-279 (2013).
  13. de la Torre-Ubieta, L., Won, H., Stein, J. L., Geschwind, D. H. Advancing the understanding of autism disease mechanisms through genetics. Nature Medicine. 22 (4), 345-361 (2016).
  14. Scheffner, M., Staub, O. HECT E3s and human disease. BMC Biochemistry. 8, (2007).
  15. Cooper, E. M., Hudson, A. W., Amos, J., Wagstaff, J., Howley, P. M. Biochemical analysis of Angelman syndrome-associated mutations in the E3 ubiquitin ligase E6-associated protein. Journal of Biological Chemistry. 279 (39), 41208-41217 (2004).
  16. Yi, J. J., Barnes, A. P., Hand, R., Polleux, F., Ehlers, M. D. TGF-beta signaling specifies axons during brain development. Cell. 142 (1), 144-157 (2010).
  17. Yi, J. J., et al. The autism-linked UBE3A T485A mutant E3 ubiquitin ligase activates the Wnt/beta-catenin pathway by inhibiting the proteasome. Journal of Biological Chemistry. 292 (30), 12503-12515 (2017).
  18. Weston, K. P., et al. Identification of disease-linked hyperactivating mutations in UBE3A through large-scale functional variant analysis. Nature Communications. 12 (1), 6809 (2021).
  19. Hand, R., Polleux, F. Neurogenin2 regulates the initial axon guidance of cortical pyramidal neurons projecting medially to the corpus callosum. Neural Development. 6, 30 (2011).
  20. Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nature Biotechnology. 28 (7), 743-747 (2010).
  21. Biechele, T. L., Moon, R. T. Assaying beta-catenin/TCF transcription with beta-catenin/TCF transcription-based reporter constructs. Methods in Molecular Biology. , 99-110 (2008).
  22. Yi, J. J., et al. An Autism-linked mutation disables phosphorylation control of UBE3A. Cell. 162 (4), 795-807 (2015).
  23. Kuhnle, S., et al. Angelman syndrome-associated point mutations in the Zn(2+)-binding N-terminal (AZUL) domain of UBE3A ubiquitin ligase inhibit binding to the proteasome. Journal of Biological Chemistry. 293 (47), 18387-18399 (2018).
  24. Yamamoto, Y., Huibregtse, J. M., Howley, P. M. The human E6-AP gene (UBE3A) encodes three potential protein isoforms generated by differential splicing. Genomics. 41 (2), 263-266 (1997).
  25. Avagliano Trezza, R., et al. Loss of nuclear UBE3A causes electrophysiological and behavioral deficits in mice and is associated with Angelman syndrome. Nature Neuroscience. 22 (8), 1235-1247 (2019).
  26. Bossuyt, S. N. V., et al. Loss of nuclear UBE3A activity is the predominant cause of Angelman syndrome in individuals carrying UBE3A missense mutations. Human Molecular Genetics. 30 (6), 430-442 (2021).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

N robilimSay 188UBE3Aprotein y k mAngelman sendromuotizm spektrum bozuklu ulusiferazWnt yolugen varyant

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır