Une méthode évolutive basée sur des cellules pour l’évaluation fonctionnelle des variantes d’Ube3a

Résumé

Une méthode simple et évolutive a été développée pour évaluer la signification fonctionnelle des variantes faux-sens dans Ube3a, un gène dont la perte et le gain de fonction sont liés à la fois au syndrome d’Angelman et au trouble du spectre autistique.

Résumé

L’utilisation accrue du séquençage en médecine a permis d’identifier des millions de variantes codantes dans le génome humain. Beaucoup de ces variantes se produisent dans les gènes associés aux troubles neurodéveloppementaux, mais la signification fonctionnelle de la grande majorité des variantes reste inconnue. Le présent protocole décrit l’étude des variantes de Ube3a, un gène qui code pour une ubiquitine ligase E3 liée à la fois à l’autisme et au syndrome d’Angelman. La duplication ou la triplication d’Ube3a est fortement liée à l’autisme, alors que sa délétion provoque le syndrome d’Angelman. Ainsi, la compréhension de la valence des changements dans l’activité de la protéine UBE3A est importante pour les résultats cliniques. Ici, une méthode rapide basée sur les cellules qui associe les variantes Ube3a avec un rapporteur de voie Wnt est décrite. Ce test simple est évolutif et peut être utilisé pour déterminer la valence et l’ampleur des changements d’activité dans n’importe quelle variante d’Ube3a . De plus, la facilité de cette méthode permet la génération d’une mine d’informations structure-fonction, qui peuvent être utilisées pour obtenir des informations approfondies sur les mécanismes enzymatiques d’UBE3A.

Introduction

Les progrès technologiques récents ont rendu le séquençage des exomes et des génomes systématique en milieu clinique ^1,2. Cela a conduit à la découverte d’un grand nombre de variantes génétiques, y compris des millions de variantes faux-sens qui modifient généralement un acide aminé dans une protéine. Comprendre la signification fonctionnelle de ces variantes reste un défi, et seule une petite fraction (~2%) des variantes faux-sens connues ont une interprétation clinique ^1,3.

Un exemple frappant de ce problème est Ube3a, un gène qui code pour une ubiquitine ligase E3 qui cible les protéines substrat pour la dégradation⁴. Ube3a réside dans le chromosome 15q11-13 et est exprimé exclusivement à partir de l’allèle maternel ^5,6,7. Les observations de la génétique de la maladie suggèrent fortement qu’une activité insuffisante ou excessive de l’enzyme UBE3A provoque des troubles neurodéveloppementaux distincts. La délétion du chromosome maternel 15q11-13 provoque le syndrome d’Angelman (SA)8, un trouble caractérisé par une déficience intellectuelle sévère, des déficiences motrices, des convulsions, un comportement heureux avec des sourires fréquents et des traits du visage dysmorphiques ^8,9,10. En revanche, la duplication ou la triplication du chromosome maternel 15q11-13 provoque le syndrome Dup15q, une maladie hétérogène reconnue comme l’une des formes syndromiques les plus répandues de l’autisme^11,12,13. En outre, il existe des centaines de variantes faux-sens identifiées dans Ube3a, dont la majorité sont considérées comme des variantes de signification incertaine (VUS) car leur signification fonctionnelle et clinique est inconnue. Ainsi, il existe un intérêt considérable pour le développement de méthodes permettant d’évaluer empiriquement les variantes d’Ube3a afin de déterminer si elles contribuent à la maladie neurodéveloppementale.

L’enzyme UBE3A appartient à la famille de domaines HECT (homologue à E6-AP C-terminus) des ligases d’ubiquitine E3 qui possèdent toutes le domaine HECT éponyme, qui contient la machinerie biochimique nécessaire pour accepter l’ubiquitine activée des enzymes E2 et la transférer aux protéines substrat¹⁴. Historiquement, la caractérisation des enzymes E3 s’est appuyée sur des systèmes in vitro reconstitués qui nécessitent un ensemble de protéines purifiées 4,15,16. Ces méthodes sont lentes et laborieuses et ne se prêtent pas à l’évaluation de l’activité d’un grand nombre de variantes. Dans des travaux antérieurs, UBE3A a été identifié pour activer la voie Wnt dans les cellules HEK293T en modulant la fonction du protéasome pour ralentir la dégradation de la β-caténine¹⁷. Cet aperçu permet l’utilisation des rapporteurs de trajectoire Wnt comme méthode efficace et rapide pour identifier les variantes de perte et de gain de fonction d’Ube3a¹⁸. Le protocole ci-dessous décrit en détail une méthode pour générer des variantes Ube3a ainsi qu’un rapporteur basé sur la luciférase pour évaluer les changements dans l’activité des variants Ube3a.

Protocole

1. Clonage de mutagenèse pour générer des variantes d’Ube3a

1. Cloner toutes les variantes d’Ube3a dans le plasmide pCIG2 (Figure 1A), un vecteur bicistronique qui contient un promoteur de la β-actine de poulet et un site d’entrée interne du ribosome (IRES) pour l’expression EGFP¹⁹. Les constructions Ube3a complètes contiennent une séquence Myc-tag N-terminale et sont clonées en pCIG2 à l’aide d’un site SacI de 5' et d’un site XmaI de 3'. En outre, les sites naturels EcoRI, EcoRV et PstI dans la séquence de codage Ube3a sont également utilisés pour sous-cloner des fragments.
   REMARQUE : Les variantes anonymisées d’Ube3a peuvent être obtenues dans la littérature et dans des dépôts accessibles au public tels que la base de données ClinVar¹. D’autres variantes non signalées peuvent être obtenues par le biais d’une communication personnelle avec les centres médicaux.
2. Utiliser une méthode de mutagénèse mégaamorce adaptée en deux étapes²⁰ pour introduire des mutations dans le cadre de lecture Ube3a . Dans un premier temps, concevoir l’oligonucléotide mutagène qui contient la mutation souhaitée (l’exemple montré dans ce protocole est de générer une variante UBE3A Q588E) flanquée d’au moins 30 paires de bases (pb) d’homologie 5′ et 3′ à la mutation (Figure 1B et Tableau 1).
3. Utiliser l’oligonucléotide mutagène avec un oligonucléotide complémentaire pour la première PCR de cycle afin de générer une mégaamorce de 200 à 400 pb contenant la mutation (Figure 1C ; Tableau 2 et Tableau 3). Utiliser la totalité des 50 μL du volume de réaction PCR pour l’électrophorèse sur gel d’agarose en utilisant un gel à 1% et une purification ultérieure du gel (Tableau des matériaux). Éluer le produit de PCR dans 30 μL de_H2Odésionisé (_diH2O) pour l’utiliser dans la deuxième étape de PCR ronde ci-dessous.
4. Configurez la PCR de deuxième cycle comme indiqué (Figure 1C; Tableau 2 et Tableau 3). Cette étape générera des fragments d’ADN plus grands (généralement ~1-1,5 kb de longueur) contenant les sites de mutation et de restriction terminale appropriés pour le sous-clonage (Figure 1C).
5. Une fois la réaction PCR terminée, purifier le produit résultant à l’aide d’un kit de purification PCR (Table of Materials). Éluer dans 30 μL et digérer tout le produit purifié et la construction pCIG2 Ube3a WT avec les enzymes de restriction appropriées (l’exemple montre la digestion avec EcoRI et XmaI).
6. Après 2 h de digestion à 37 °C, résoudre les produits de digestion par électrophorèse sur gel d’agarose (gel à 1%) et purifier les produits appropriés. Mettre en place des ligatures selon le protocole du fabricant (Table of Materials), transformer les produits de ligature en une souche bactérienne DH10B (Table of Materials), puis plaquer avec une sélection d’ampicilline (100 μg/mL).
7. Le lendemain, prélevez de deux à quatre colonies pour inoculer 3 mL de cultures contenant du bouillon de Luria (LB) et 100 μg/mL d’ampicilline. Laisser pousser les cultures pendant la nuit à 37 °C dans un incubateur orbital avec agitation (225 rpm).
8. Le lendemain, utilisez 1 à 1,5 mL de la culture bactérienne pour mini-préparer l’ADN plasmidique (Tableau des matériaux). Conserver la culture restante en les plaçant à 4 °C. Cribler les plasmides mini-imprégnés par séquençage de Sanger à l’aide d’un oligonucléotide qui se lie à ~200 bp de la mutation souhaitée.
9. Utiliser les cultures bactériennes conservées à 4 °C pour inoculer à nouveau 50 mL de cultures afin de midipréparer le plasmide correct (Tableau des matériaux). Séquencer complètement la séquence codante Ube3a pour valider la séquence correcte de l’ADN.
10. Créer des stocks de travail de plasmides variants Ube3a, ainsi que du rapporteur activé par la β-caténine (BAR)²¹, de la TK-Renilla luciférase, de l’Ube3a mort par la ligase (mutation UBE3A C820A) et du vecteur vide pCIG2 à une concentration de 100 ng/μL en utilisant le_H2Ostérile pour les étapes de transfection suivantes.

2. Préparation et transfection de cellules 293T (HEK293T) embryonnaires humaines

1. Effectuer les dosages sur des cellules HEK293T cultivées dans le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco pré-supplémenté en glutamine, 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et un agent antibiotique-antimycotique comme décrit précédemment¹⁷. Cultiver les cellules dans un incubateur stérile humidifié à 37 °C avec 5% de CO₂.
2. À l’aide d’une enceinte de biosécurité, plaquez d’abord les cellules HEK293T en suspension sur des plaques à fond plat à 96 puits traitées par culture tissulaire à une densité de 2,2 × 10^{à 4} cellules par puits dans 100 μL de milieux de culture et laissez-les croître pendant la nuit.
3. Le deuxième jour, transfectez les cellules dans une armoire de biosécurité avec des plasmides rapporteurs Firefly et Renilla luciferase (tableau 4) et Ube3a en trois exemplaires. Effectuer les transfections dans 10 μL de volume total par puits en utilisant un rapport de 10:1:8 de plasmides (50 ng de BAR, 5 ng de TK-Renilla et 40 ng de plasmide Ube3a par puits, respectivement), comme décrit précédemment,¹⁸, et 0,4 μL de réactif de transfection (tableau 4).
   NOTE: Pour chaque expérience, un vecteur vide (GFP uniquement) et un plasmide codant pour la ligase morte Ube3a sont également transfectés pour servir de témoins négatifs.
4. Créer un mélange maître pour les transfections pour chaque variante dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL (tableau 4) et incuber à température ambiante (TR) pendant 15 min. Après l’incubation, agiter doucement le mélange de transfection en tapotant le tube, puis ajouter 10 μL du mélange de transfection directement dans le milieu de croissance existant dans les puits.
5. Ensuite, remettez les cellules dans l’incubateur et laissez les plasmides s’exprimer pendant 48 h. Le remplacement du milieu de culture n’est pas nécessaire.
6. Surveiller l’efficacité de la transfection par fluorescence GFP à l’aide d’un microscope à fluorescence. Les cellules HEK293T sont efficacement transfectées par cette méthode, et >80% des cellules devraient exprimer la GFP après 48 h.

3. Mesure de l’activité de la luciférase

REMARQUE : L’activité de la luciférase est évaluée à l’aide d’un système disponible dans le commerce qui analyse à la fois Firefly et Renilla luciferase (tableau des matériaux) conformément au protocole du fabricant.

1. Aspirez soigneusement les milieux de culture des cellules HEK293T transfectées, puis lavez les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate froid (PBS). Aspirer le PBS et lyser les cellules en ajoutant 25 μL de tampon de lyse non dénaturant et incuber pendant 15 minutes en berçant doucement sur la glace.
2. Ensuite, ajoutez 20 μL du lysat résultant (aucune centrifugation n’est nécessaire) dans une nouvelle plaque de dosage de 96 puits contenant 100 μL d’un réactif de substrat de luciférase Firefly. Mélangez doucement l’assiette en tapotant.
3. Chargez la plaque sur un lecteur de plaques et mesurez la luminescence à l’aide d’un détecteur supérieur avec une hauteur de lecture de 1 mm et un temps d’intégration de 1 s.
   REMARQUE: Le gain du détecteur peut devoir être ajusté en fonction de la force du signal.
4. Immédiatement après avoir lu la luminescence luciférase Firefly, ajoutez 100 μL de substrat de Renilla luciferase aux puits. Cette étape éteint simultanément l’activité de la luciférase Firefly tout en évaluant l’activité de Renilla luciferase. Mélanger les échantillons par agitation douce de la plaque et mesurer à nouveau la luminescence pour évaluer l’activité de Renilla luciférase.
   REMARQUE: Bien que d’autres plaques puissent être utilisées pour ce test, l’utilisation de plaques avec des cadres noirs et des puits blancs fournira les résultats les plus sensibles car cela amplifie le signal de luciférase tout en minimisant le bruit.
5. Quantifier les réponses des rapporteurs comme le rapport luciférase luciférase Firefly / Renilla luciferase (Firefly/Renilla), et faire la moyenne des valeurs des mesures triples. Ensuite, normalisez la valeur Firefly/Renilla pour chaque variant par rapport aux valeurs des cellules exprimant Ube3a de type sauvage (WT) pour comparer l’activité relative des protéines variantes.

Résultats

Le criblage fonctionnel à grande échelle des variantes faux-sens d’Ube3a identifie un large paysage de mutations de perte et de gain de fonction
Des travaux antérieurs avec des mutants Ube3a ont suggéré que la réponse Wnt peut servir de rapporteur de l’activité cellulaire de la protéine UBE3A. Ces observations ont été élargies et des expériences de validation supplémentaires ont été réalisées pour déterminer si le test BAR est approprié pour signaler une gamme ...

Discussion

Le protocole décrit ici fournit une méthode efficace et évolutive pour évaluer l’activité enzymatique des variantes d’Ube3a. Plusieurs détails techniques méritent d’être soigneusement examinés lors de l’utilisation de ce test. Une considération est le choix des plasmides rapporteurs Wnt utilisés dans ce test. Le protocole décrit ici utilise spécifiquement le rapporteur activé par la β-caténine (BAR)²¹, un rapporteur qui contient un concatémère de 12 éléments de...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red	Gibco	25300-054
1 Kb DNA ladder	Lambda Biotech	M108-S
100 bp DNA Ladder	Lambda Biotech	M107
10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10 mM ATP	New England BioLabs	B0202A
5x Phusion HF Reaction Buffer	New England BioLabs	B0518S
Antibiotic-Antimycotic Solution	Corning	30004CI
Black/White Isoplate-96 Black Frame White Well plate	PerkinElmer	6005030
Carbenicillin Disodium Salt	Midwest Scientific	KCC46000-5
Countess cell counting chamber  slides	Invitrogen by Thermo Fisher Scientific	C10283
Countess II Automated Cell Counter	life technologies		Cell counting machine
Custom DNA oligos	Integrated DNA Technologies (IDT)
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix	New England BioLabs	N0447S
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate	Gibco	10569044	Basal medium for supporting the growth of HEK293T cell line
DPBS (1x)	Gibco	14190-136
Dual-Luciferase Reporter Assay System	Promega	E1910
EcoRI-HF	New England BioLabs	R3101S	Restriction enzyme
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated	Gibco	16140071	Fetal bovine serum
Fisherbrand Surface Treated Tissue Culture Dishes	Fisherbrand	FB012924
FuGENE 6 Transfection Reagent	Promega	E2691
Gel Loading Dye Purple (6x)	New England BioLabs	B7024A
HEK293T cells	ATCC	CRL-3216
High Efficiency ig 10B Chemically Competent Cells	Intact Genomics	1011-12	E. coli DH10B cells
HiSpeed Plasmid Midi Kit	Qiagen	12643	Midi prep
pCIG2 plasmid
pGL3 BAR plasmid
Phusion HF DNA Polymerase	New England BioLabs	M0530L	DNA polymerase
ProFlex 3 x 32 well PCR System	Applied biosystems by life technologies		Thermocycler
pTK Renilla plasmid
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)	Qiagen	27106	Mini prep
QIAquick Gel Extraction Kit (250)	Qiagen	28706	Gel purification
QIAquick PCR Purification Kit (250)	Qiagen	28106	PCR purification
rCutSmart Buffer	New England BioLabs	B6004S
SacI-HF	New England BioLabs	R3156S	Restriction enzyme
Synergy HTX Multi-Mode Reader	BioTek		Plate reader runs Gen5 software v3.08 (BioTek)
T4 DNA Ligase	New England BioLabs	M0202L	Ligase
TAE Buffer, Tris-Acetate-EDTA, 50x Solution, Electrophoresis	Fisher Scientific	BP13324
Tissue Culture Plate 96 wells, Flat Bottom	Fisherbrand	FB012931
UltraPure Ethidium Bromide Solution	Invitrogen by Thermo Fisher Scientific	15585011
XmaI	New England BioLabs	R0180S	Restriction enzyme