שיטה מדרגית ומבוססת תאים להערכה פונקציונלית של גרסאות Ube3a

Summary

שיטה פשוטה ומדרגית פותחה כדי להעריך את המשמעות התפקודית של גרסאות missense ב- Ube3a, גן שאובדן ורווח תפקודו קשורים הן לתסמונת אנג'למן והן להפרעת ספקטרום האוטיזם.

Abstract

השימוש המוגבר בריצוף ברפואה זיהה מיליוני גרסאות קידוד בגנום האנושי. רבים מהווריאנטים האלה מתרחשים בגנים הקשורים להפרעות נוירו-התפתחותיות, אך המשמעות התפקודית של הרוב המכריע של הווריאנטים עדיין לא ידועה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את המחקר של וריאנטים עבור Ube3a, גן המקודד E3 יוביקוויטין ליגאז הקשור הן לאוטיזם והן לתסמונת אנג'למן. שכפול או משולש של Ube3a קשור מאוד לאוטיזם, ואילו מחיקתו גורמת לתסמונת אנג'למן. לפיכך, הבנת הערכיות של שינויים בפעילות החלבון UBE3A חשובה לתוצאות קליניות. כאן מתוארת שיטה מהירה, מבוססת תאים, המשלבת גרסאות Ube3a עם כתב מסלול Wnt. בדיקה פשוטה זו ניתנת להרחבה וניתן להשתמש בה כדי לקבוע את הערכיות ואת גודל השינויים בפעילות בכל גרסה של Ube3a . יתר על כן, המתקן של שיטה זו מאפשר יצירת שפע של מידע מבנה-פונקציה, אשר ניתן להשתמש בו כדי לקבל תובנות עמוקות על מנגנונים אנזימטיים של UBE3A.

Introduction

ההתקדמות הטכנולוגית האחרונה הפכה את ריצוף האקסומים והגנומים לשגרתי במסגרות קליניות ^1,2. זה הוביל לגילוי של מספר רב של וריאנטים גנטיים, כולל מיליוני וריאנטים של מיסנס שבדרך כלל משנים חומצת אמינו אחת בחלבון. הבנת המשמעות הפונקציונלית של וריאנטים אלה נותרה אתגר, ורק לחלק קטן (~2%) מהווריאנטים הידועים של מיסנס יש פרשנות קלינית ^1,3.

דוגמה בולטת לבעיה זו היא Ube3a, גן המקודד יוביקוויטין ליגאז E3 המכוון לחלבוני סובסטרט לפירוק⁴. Ube3a שוכן בתוך כרומוזום 15q11-13 ומתבטא אך ורק באלל ^5,6,7 שעבר בירושה אימהית. תצפיות מהגנטיקה של מחלות מצביעות על כך שפעילות לא מספקת או מוגזמת של האנזים UBE3A גורמת להפרעות נוירו-התפתחותיות מובהקות. מחיקת כרומוזום אימהי 15q11-13 גורמת לתסמונת אנג'למן (AS)8, הפרעה המאופיינת במוגבלות אינטלקטואלית קשה, ליקויים מוטוריים, התקפים, התנהגות שמחה עם חיוך תכוף, ותווי פנים דיסמורפיים 8,9,10. לעומת זאת, שכפול או שילוש של כרומוזום אימהי 15q11-13 גורם לתסמונת Dup15q, מצב הטרוגני המוכר כאחת הצורות הסינדרומיות הנפוצות ביותר של אוטיזם^11,12,13. בנוסף, ישנם מאות וריאנטים שגויים שזוהו ב- Ube3a, שרובם נחשבים לווריאנטים בעלי משמעות לא ברורה (VUS) מכיוון שמשמעותם התפקודית והקלינית אינה ידועה. לפיכך, יש עניין רב בפיתוח שיטות שיכולות להעריך באופן אמפירי גרסאות Ube3a כדי לקבוע אם הם תורמים למחלות נוירו-התפתחותיות.

האנזים UBE3A שייך למשפחת התחום HECT (הומולוגית ל-E6-AP C-terminus) של ליגאזות יוביקוויטין E3 שכולן מחזיקות בתחום ה-HECT המפורסם, המכיל את המנגנון הביוכימי הדרוש כדי לקבל יוביקוויטין פעיל מאנזימי E2 ולהעבירו לחלבוני סובסטרט¹⁴. מבחינה היסטורית, האפיון של אנזימי E3 הסתמך על מערכות מבחנה משוחזרות הדורשות אנסמבל של חלבונים מטוהרים 4,15,16. שיטות כאלה הן איטיות ועתירות עבודה ואינן ניתנות להערכת הפעילות של מספר רב של גרסאות. בעבודה קודמת, UBE3A זוהה כמפעיל את מסלול ה-Wnt בתאי HEK293T על ידי ויסות תפקוד הפרוטאזום כדי להאט את הפירוק של β-קטנין¹⁷. תובנה זו מאפשרת את השימוש בכתבי מסלול Wnt כשיטה יעילה ומהירה לזיהוי גרסאות אובדן ורווח של פונקציה של Ube3a¹⁸. הפרוטוקול שלהלן מתאר בפירוט שיטה ליצירת וריאנטים של Ube3a וכן כתב מבוסס לוציפראז להערכת שינויים בפעילות של וריאנטים של Ube3a.

Protocol

1. שיבוט מוטגנזה ליצירת גרסאות Ube3a

1. שכפלו את כל גרסאות Ube3a לפלסמיד pCIG2 (איור 1A), וקטור ביקיסטרוני המכיל מקדם עוף-β-אקטין ואתר כניסה לריבוזום פנימי (IRES) עבור ביטוי EGFP¹⁹. מבנים באורך מלא של Ube3a מכילים רצף תגי Myc מסוף N והם משוכפלים ל-pCIG2 באמצעות אתר SacI בגודל 5' ואתר XmaI בגודל 3 אינץ'. בנוסף, אתרי EcoRI, EcoRV ו-PstI טבעיים בתוך רצף הקידוד Ube3a משמשים גם להחלקת שברים.
   הערה: ניתן להשיג גרסאות לא מזוהות עבור Ube3a באמצעות הספרות ובמאגרים נגישים לציבור כגון מסד הנתונים ClinVar¹. גרסאות נוספות שאינן מדווחות ניתן להשיג באמצעות תקשורת אישית עם מרכזים רפואיים.
2. השתמש בשיטת מוטגנזה דו-שלבית מותאמת של מגה-פרימר²⁰ כדי להכניס מוטציות למסגרת הקריאה של Ube3a . בשלב הראשון, תכננו את האוליגונוקלאוטיד המוטגני המכיל את המוטציה הרצויה (הדוגמה המוצגת בפרוטוקול זה היא יצירת וריאנט UBE3A Q588E) שלצדו לפחות 30 זוגות בסיסים (bp) של הומולוגיה 5′ ו-3′ למוטציה (איור 1B וטבלה 1).
3. השתמשו באוליגונוקלאוטיד המוטגני יחד עם אוליגונוקלאוטיד משלים עבור ה-PCR בסיבוב הראשון כדי ליצור מגה-פרימר של 200-400 bp המכיל את המוטציה (איור 1C; טבלה 2 וטבלה 3). השתמש בכל 50 μL של נפח התגובה PCR עבור אלקטרופורזה ג'ל agarose באמצעות ג'ל 1% וטיהור ג'ל לאחר מכן (טבלת חומרים). יש להצמיד את מוצר ה-PCR ב-30 μL של_H2O שעבר דה-יוניזציה (diH₂O) לשימוש בסיבוב השני של ה-PCR בשלב הבא.
4. הגדר את ה-PCR בסיבוב השני כפי שצוין (איור 1C; טבלה 2 וטבלה 3). שלב זה ייצור מקטעי דנ"א גדולים יותר (בדרך כלל באורך של ~1-1.5 קילובייט) המכילים את אתרי המוטציה וההגבלה הסופית המתאימים לשיבוט משנה (איור 1C).
5. לאחר השלמת תגובת ה-PCR, יש לטהר את המוצר המתקבל באמצעות ערכת טיהור PCR (טבלת חומרים). יש לעכל ב-30 μL ולעכל את כל המוצר המטוהר ואת מבנה ה-pCIG2 Ube3a WT עם אנזימי ההגבלה המתאימים (הדוגמה מראה עיכול עם EcoRI ו-XmaI).
6. לאחר שעתיים של עיכול בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, פתרו את תוצרי העיכול באמצעות אלקטרופורזה בג'ל אגרוז (1% ג'ל), וטיהרו את המוצרים המתאימים באמצעות ג'ל. הגדר קשירת בהתאם לפרוטוקול היצרן (טבלת חומרים), הפוך את מוצרי הקשירה לזן חיידקים DH10B (טבלת חומרים), ולאחר מכן צלחת עם בחירת אמפיצילין (100 מיקרוגרם / מ"ל).
7. למחרת, בחרו שתיים עד ארבע מושבות כדי לחסן תרביות של 3 מ"ל המכילות מרק לוריא (LB) ו-100 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין. תנו לתרביות לגדול בן לילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור מסלולי עם רעידות (225 סל"ד).
8. למחרת, השתמש ב-1-1.5 מ"ל של תרבית החיידקים כדי למזער את הדנ"א הפלסמיד (טבלת החומרים). להציל את התרבות הנותרת על ידי הצבתם ב 4 °C (64 °F). סנן את הפלסמידים המצומצמים על ידי ריצוף סנגר באמצעות אוליגונוקלאוטיד שנקשר ~200 bp מהמוטציה הרצויה.
9. השתמש בתרביות החיידקים שנשמרו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי לחסן מחדש תרביות של 50 מ"ל כדי למידיפרפ את הפלסמיד הנכון (טבלת החומרים). רצף מלא של רצף הקידוד Ube3a כדי לאמת את הרצף הנכון של הדנ"א.
10. צור מלאי עבודה של פלסמידים בגרסה Ube3a, כמו גם את הכתב המופעל על ידי β-קטנין (BAR)²¹, TK-Renilla luciferase, Ube3a מת ליגאז (מוטציית UBE3A C820A), וקטור ריק pCIG2 בריכוז של 100 ng/μL באמצעות H₂O סטרילי עבור שלבי ההעברה הבאים.

2. הכנה והעברה של תאי כליה עובריים אנושיים 293T (HEK293T)

1. בצע את הבדיקות בתאי HEK293T שגודלו במדיום הנשר המהונדס (DMEM) של דולבקו, בתוספת גלוטמין, 10% סרום בקר עוברי (FBS) וחומר אנטיביוטי-אנטימיקוטי כפי שתואר קודם^{לכן 17}. לגדל את התאים באינקובטור סטרילי ולח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂.
2. באמצעות ארון בטיחות ביולוגית, צלחת תחילה את תאי HEK293T המרחפים על לוחות 96 בעלי תחתית שטוחה שטופלו בתרבית רקמה בצפיפות של 2.2 × 10^{4 תאים} לכל באר ב-100 μL של מדיית תרבית ולאפשר להם לגדול בן לילה.
3. ביום השני, העבירו את התאים בארון בטיחות ביולוגית עם פלסמידים של פיירפליי ורנילה לוציפראז (טבלה 4) ופלסמידים של Ube3a במשולש. בצע את הטרנספקציות ב-10 μL של הנפח הכולל לכל באר באמצעות יחס של 10:1:8 של פלסמידים (50 ng של BAR, 5 ng של TK-Renilla, ו-40 ng של Ube3a פלסמיד לכל באר, בהתאמה), כפי שתואר קודם לכן¹⁸, ו-0.4 μL של מגיב טרנספקציה (טבלה 4).
   הערה: עבור כל ניסוי, וקטור ריק (GFP בלבד) וקידוד פלסמיד ליגאז-מת Ube3a גם הם מועברים כדי לשמש כבקרות שליליות.
4. צור תערובת אב עבור הטרנספקציות עבור כל גרסה בצינור מיקרוצנטריפוגה בגודל 1.5 מ"ל (טבלה 4) ודגירה בטמפרטורת החדר (RT) למשך 15 דקות. לאחר הדגירה, התסיסו בעדינות את תערובת הטרנספקציה על ידי הקשה על הצינור, ולאחר מכן הוסיפו 10 μL של תערובת הטרנספקציה ישירות למדיית הצמיחה הקיימת בבארות.
5. לאחר מכן, החזירו את התאים לאינקובטור ואפשרו לפלסמידים להתבטא במשך 48 שעות. החלפת מדיית הצמיחה אינה הכרחית.
6. נטר את יעילות ההעברה על ידי פלואורסצנציה של GFP באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. תאי HEK293T עוברים טרנספקציה יעילה בשיטה זו, ו->80% מהתאים צריכים לבטא GFP לאחר 48 שעות.

3. מדידת פעילות לוציפראז

הערה: פעילות לוציפראז מוערכת באמצעות מערכת זמינה מסחרית הבודקת הן את Firefly והן את Renilla luciferase (טבלת חומרים) בהתאם לפרוטוקול היצרן.

1. שאפו בזהירות את מדיית התרבית מתאי HEK293T שעברו טרנספקציה, ולאחר מכן שטפו את התאים בתמיסת מלח קרה עם מאגרי פוספט (PBS). שאפו את ה-PBS והניחו את התאים על ידי הוספת 25 μL של חיץ ליזיס שאינו דנטורינג ודגירה במשך 15 דקות עם נדנדה עדינה על קרח.
2. לאחר מכן, הוסף 20 μL של ליזאט שנוצר (אין צורך בצנטריפוגה) לתוך צלחת בדיקה חדשה של 96 בארות המכילה 100 μL של מגיב מצע לוציפראז Firefly. מערבבים את הצלחת בעדינות על ידי הקשה.
3. טען את הצלחת על קורא צלחות ומדוד את עוצמת האור באמצעות גלאי עליון עם גובה קריאה של 1 מ"מ וזמן אינטגרציה של 1 שניות.
   הערה: ייתכן שיהיה צורך להתאים את הרווח של הגלאי בהתבסס על עוצמת האות.
4. מיד לאחר קריאת לומינסנציה של פיירפליי לוציפראז, הוסף 100 μL של מצע Renilla luciferase לבארות. צעד זה מרווה בו זמנית את פעילות לוציפראז Firefly תוך הערכת פעילות רנילה לוציפראז. מערבבים את הדגימות על ידי תסיסה עדינה של הצלחת ומודדים שוב את הלומינסנציה כדי להעריך את פעילות רנילה לוציפראז.
   הערה: בעוד שניתן להשתמש בלוחות אחרים לבדיקה זו, שימוש בלוחות עם מסגרות שחורות ובארות לבנות יספק את התוצאות הרגישות ביותר מכיוון שהדבר מגביר את אות לוציפראז תוך מזעור הרעש.
5. לכמת את תגובות הכתבים כיחס לוציפראז של פיירפליי ל-Renilla luciferase (Firefly/Renilla), ולממוצע את הערכים של מדידות המשולש. לאחר מכן, נרמל את הערך Firefly/Renilla עבור כל וריאנט כנגד הערכים עבור תאים מסוג בר (WT) Ube3a המבטאים כדי להשוות את הפעילות היחסית של חלבונים משתנים.

תוצאות

סריקה פונקציונלית בקנה מידה גדול של וריאנטים של Ube3a missense מזהה נוף רחב של מוטציות אובדן ורווח של תפקוד
עבודה קודמת עם מוטנטים של Ube3a הציעה שתגובת Wnt יכולה לשמש ככתב של פעילות החלבון UBE3A התאית. תצפיות אלה הורחבו, ונערכו ניסויי ולידציה נוספים כדי לחקור אם בדיקת BAR מתאימה לדי...

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן מספק שיטה יעילה ומדרגית להערכת הפעילות האנזימטית של גרסאות Ube3a. ישנם מספר פרטים טכניים המחייבים שיקול דעת זהיר בעת שימוש בבדיקה זו. שיקול אחד הוא הבחירה בפלסמידים של כתב Wnt המשמשים בבדיקה זו. הפרוטוקול המתואר כאן משתמש באופן ספציפי ב-β-catenin מופעל reporter (BAR)^2...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red	Gibco	25300-054
1 Kb DNA ladder	Lambda Biotech	M108-S
100 bp DNA Ladder	Lambda Biotech	M107
10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10 mM ATP	New England BioLabs	B0202A
5x Phusion HF Reaction Buffer	New England BioLabs	B0518S
Antibiotic-Antimycotic Solution	Corning	30004CI
Black/White Isoplate-96 Black Frame White Well plate	PerkinElmer	6005030
Carbenicillin Disodium Salt	Midwest Scientific	KCC46000-5
Countess cell counting chamber  slides	Invitrogen by Thermo Fisher Scientific	C10283
Countess II Automated Cell Counter	life technologies		Cell counting machine
Custom DNA oligos	Integrated DNA Technologies (IDT)
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix	New England BioLabs	N0447S
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate	Gibco	10569044	Basal medium for supporting the growth of HEK293T cell line
DPBS (1x)	Gibco	14190-136
Dual-Luciferase Reporter Assay System	Promega	E1910
EcoRI-HF	New England BioLabs	R3101S	Restriction enzyme
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated	Gibco	16140071	Fetal bovine serum
Fisherbrand Surface Treated Tissue Culture Dishes	Fisherbrand	FB012924
FuGENE 6 Transfection Reagent	Promega	E2691
Gel Loading Dye Purple (6x)	New England BioLabs	B7024A
HEK293T cells	ATCC	CRL-3216
High Efficiency ig 10B Chemically Competent Cells	Intact Genomics	1011-12	E. coli DH10B cells
HiSpeed Plasmid Midi Kit	Qiagen	12643	Midi prep
pCIG2 plasmid
pGL3 BAR plasmid
Phusion HF DNA Polymerase	New England BioLabs	M0530L	DNA polymerase
ProFlex 3 x 32 well PCR System	Applied biosystems by life technologies		Thermocycler
pTK Renilla plasmid
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)	Qiagen	27106	Mini prep
QIAquick Gel Extraction Kit (250)	Qiagen	28706	Gel purification
QIAquick PCR Purification Kit (250)	Qiagen	28106	PCR purification
rCutSmart Buffer	New England BioLabs	B6004S
SacI-HF	New England BioLabs	R3156S	Restriction enzyme
Synergy HTX Multi-Mode Reader	BioTek		Plate reader runs Gen5 software v3.08 (BioTek)
T4 DNA Ligase	New England BioLabs	M0202L	Ligase
TAE Buffer, Tris-Acetate-EDTA, 50x Solution, Electrophoresis	Fisher Scientific	BP13324
Tissue Culture Plate 96 wells, Flat Bottom	Fisherbrand	FB012931
UltraPure Ethidium Bromide Solution	Invitrogen by Thermo Fisher Scientific	15585011
XmaI	New England BioLabs	R0180S	Restriction enzyme