Un metodo scalabile basato su celle per la valutazione funzionale delle varianti Ube3a

Riepilogo

È stato sviluppato un metodo semplice e scalabile per valutare il significato funzionale delle varianti missenso in Ube3a, un gene la cui perdita e guadagno di funzione sono legati sia alla sindrome di Angelman che al disturbo dello spettro autistico.

Abstract

L'aumento dell'uso del sequenziamento in medicina ha identificato milioni di varianti codificanti nel genoma umano. Molte di queste varianti si verificano in geni associati a disturbi dello sviluppo neurologico, ma il significato funzionale della stragrande maggioranza delle varianti rimane sconosciuto. Il presente protocollo descrive lo studio di varianti per Ube3a, un gene che codifica per una ubiquitina ligasi E3 legata sia all'autismo che alla sindrome di Angelman. La duplicazione o triplicazione di Ube3a è fortemente legata all'autismo, mentre la sua delezione causa la sindrome di Angelman. Pertanto, comprendere la valenza dei cambiamenti nell'attività della proteina UBE3A è importante per i risultati clinici. Qui viene descritto un metodo rapido basato su cellule che accoppia le varianti di Ube3a con un reporter di percorso Wnt. Questo semplice test è scalabile e può essere utilizzato per determinare la valenza e l'entità dei cambiamenti di attività in qualsiasi variante di Ube3a . Inoltre, la facilità di questo metodo consente la generazione di una ricchezza di informazioni struttura-funzione, che possono essere utilizzate per ottenere informazioni approfondite sui meccanismi enzimatici di UBE3A.

Introduzione

I recenti progressi tecnologici hanno reso il sequenziamento di esomi e genomi di routine in ambito clinico ^1,2. Ciò ha portato alla scoperta di un gran numero di varianti genetiche, tra cui milioni di varianti missenso che tipicamente cambiano un amminoacido in una proteina. Comprendere il significato funzionale di queste varianti rimane una sfida, e solo una piccola frazione (~2%) delle varianti missenso conosciute ha un'interpretazione clinica ^1,3.

Un esempio importante di questo problema è Ube3a, un gene che codifica per una ubiquitina ligasi E3 che prende di mira le proteine del substrato per la degradazione⁴. Ube3a risiede all'interno del cromosoma 15q11-13 ed è espresso esclusivamente dall'allele ^5,6,7 ereditato per via materna. Le osservazioni della genetica delle malattie suggeriscono fortemente che l'attività insufficiente o eccessiva dell'enzima UBE3A causa distinti disturbi dello sviluppo neurologico. La delezione del cromosoma materno 15q11-13 causa la sindrome di Angelman (AS)8, un disturbo caratterizzato da grave disabilità intellettiva, menomazioni motorie, convulsioni, un contegno felice con frequenti sorrisi e caratteristiche facciali dismorfiche ^8,9,10. Al contrario, la duplicazione o triplicazione del cromosoma materno 15q11-13 causa la sindrome di Dup15q, una condizione eterogenea riconosciuta come una delle forme sindromiche più diffuse di autismo^11,12,13. Inoltre, ci sono centinaia di varianti missenso identificate in Ube3a, la maggior parte delle quali sono considerate varianti di significato incerto (VUS) in quanto il loro significato funzionale e clinico è sconosciuto. Pertanto, vi è un notevole interesse nello sviluppo di metodi in grado di valutare empiricamente le varianti di Ube3a per determinare se contribuiscono alla malattia dello sviluppo neurologico.

L'enzima UBE3A appartiene alla famiglia di domini HECT (omologa a E6-AP C-terminale) delle ubiquitina ligasi E3 che possiedono tutte l'omonimo dominio HECT, che contiene il macchinario biochimico necessario per accettare l'ubiquitina attivata dagli enzimi E2 e trasferirla alle proteine del substrato¹⁴. Storicamente, la caratterizzazione degli enzimi E3 si è basata su sistemi in vitro ricostituiti che richiedono un insieme di proteine purificate 4,15,16. Tali metodi sono lenti e laboriosi e non suscettibili di valutare l'attività di un gran numero di varianti. In lavori precedenti, UBE3A è stato identificato per attivare la via Wnt nelle cellule HEK293T modulando la funzione del proteasoma per rallentare la degradazione della β-catenina¹⁷. Questa intuizione consente l'uso di Wnt pathway reporter come metodo efficiente e rapido per identificare sia le varianti di perdita che di guadagno di funzione di Ube3a¹⁸. Il protocollo seguente descrive in dettaglio un metodo per generare varianti di Ube3a e un reporter basato sulla luciferasi per valutare i cambiamenti nell'attività delle varianti di Ube3a.

Protocollo

1. Clonazione mutagenetica per generare varianti di Ube3a

1. Clonare tutte le varianti di Ube3a nel plasmide pCIG2 (Figura 1A), un vettore bicistronico che contiene un promotore di pollo-β-actina e un sito di ingresso interno del ribosoma (IRES) per l'espressione di EGFP¹⁹. I costrutti Ube3a a lunghezza intera contengono una sequenza di tag Myc-terminali N-terminali e sono clonati in pCIG2 usando un sito SacI di 5' e un sito XmaI di 3'. Inoltre, i siti EcoRI, EcoRV e PstI presenti in natura all'interno della sequenza di codifica Ube3a vengono utilizzati anche per subclonare i frammenti.
   NOTA: Le varianti de-identificate per Ube3a possono essere ottenute attraverso la letteratura e in archivi accessibili al pubblico come il database ClinVar¹. Ulteriori varianti non segnalate possono essere ottenute attraverso la comunicazione personale con i centri medici.
2. Utilizzare un metodo di mutagenesi megaprimer adattato in due fasi²⁰ per introdurre mutazioni nel frame di lettura Ube3a . Nella prima fase, progettare l'oligonucleotide mutageno che contiene la mutazione desiderata (l'esempio mostrato in questo protocollo è quello di generare una variante UBE3A Q588E) affiancato da almeno 30 coppie di basi (bp) di omologia 5′ e 3′ alla mutazione (Figura 1B e Tabella 1).
3. Utilizzare l'oligonucleotide mutageno insieme a un oligonucleotide complementare per la PCR del primo ciclo per generare un megaprimer da 200-400 bp contenente la mutazione (Figura 1C; Tabella 2 e tabella 3). Utilizzare l'intero volume di reazione PCR di 50 μL per l'elettroforesi su gel di agarosio utilizzando un gel all'1% e successiva purificazione del gel (Tabella dei materiali). Eluire il prodotto PCR in 30 μL di H 2 O deionizzato(diH₂O) per l'uso nella fase del secondo ciclo di PCR riportata di seguito.
4. Impostare il secondo ciclo di PCR come indicato (Figura 1C; Tabella 2 e tabella 3). Questa fase genererà frammenti di DNA più grandi (tipicamente ~1-1,5 kb di lunghezza) contenenti i siti di mutazione e restrizione terminale adatti per la sub-clonazione (Figura 1C).
5. Dopo il completamento della reazione PCR, purificare il prodotto risultante utilizzando un kit di purificazione PCR (Table of Materials). Eluire in 30 μL e digerire tutto il prodotto purificato e il costrutto pCIG2 Ube3a WT con gli enzimi di restrizione appropriati (l'esempio mostra la digestione con EcoRI e XmaI).
6. Dopo 2 ore di digestione a 37 °C, risolvere i prodotti della digestione mediante elettroforesi su gel di agarosio (gel all'1%) e gelificare i prodotti appropriati. Impostare le legature secondo il protocollo del produttore (Table of Materials), trasformare i prodotti di legatura in un ceppo batterico DH10B (Table of Materials) e quindi placcare con ampicillina (100 μg / mL) selezione.
7. Il giorno successivo, scegliere da due a quattro colonie per inoculare 3 mL di colture contenenti Luria Brodo (LB) e 100 μg/mL di ampicillina. Lasciare crescere le colture durante la notte a 37 °C in un incubatore orbitale con agitazione (225 rpm).
8. Il giorno seguente, utilizzare 1-1,5 ml di coltura batterica per miniprep il DNA plasmidico (Table of Materials). Salvare la coltura rimanente posizionandola a 4 °C. Schermare i plasmidi minipreparati mediante sequenziamento Sanger utilizzando un oligonucleotide che lega ~ 200 bp dalla mutazione desiderata.
9. Utilizzare le colture batteriche salvate a 4 °C per reinoculare colture da 50 ml per midiprep il plasmide corretto (Table of Materials). Sequenziare completamente la sequenza codificante Ube3a per convalidare la sequenza corretta del DNA.
10. Creare stock di plasmidi della variante Ube3a, così come il reporter attivato da β-catenina (BAR)²¹, TK-Renilla luciferasi, Ube3a morto in ligasi (mutazione UBE3A C820A) e il vettore vuoto pCIG2 a una concentrazione di 100 ng / μL utilizzando H₂O sterile per le successive fasi di trasfezione.

2. Preparazione e trasfezione di cellule 293T (HEK293T) del rene embrionale umano (HEK293T)

1. Eseguire i test in cellule HEK293T coltivate nel mezzo Eagle modificato (DMEM) di Dulbecco pre-integrato con glutammina, siero bovino fetale al 10% (FBS) e agente antibiotico-antimicotico come descritto in precedenza¹⁷. Far crescere le cellule in un incubatore sterile e umidificato a 37 °C con il 5% di CO₂.
2. Utilizzando un armadio di biosicurezza, prima placcare le cellule HEK293T sospese su piastre a fondo piatto trattate con colture tissutali a 96 pozzetti a una densità di 2,2 × 10⁴ cellule per pozzetto in 100 μL di terreno di coltura e lasciarle crescere durante la notte.
3. Il secondo giorno, trasfettare le cellule in un armadio di biosicurezza con plasmidi reporter Firefly e Renilla luciferasi (Tabella 4) e plasmidi Ube3a in triplice copia. Eseguire le trasfezioni in 10 μL di volume totale per pozzetto utilizzando un rapporto 10:1:8 di plasmidi (50 ng di BAR, 5 ng di TK-Renilla e 40 ng di plasmide Ube3a per pozzetto, rispettivamente), come descritto in precedenza¹⁸, e 0,4 μL di reagente di trasfezione (Tabella 4).
   NOTA: Per ogni esperimento, un vettore vuoto (solo GFP) e un plasmide che codifica Ube3a morto di ligasi sono anche trasfettati per fungere da controlli negativi.
4. Creare un master mix per le trasfezioni per ogni variante in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml (Tabella 4) e incubare a temperatura ambiente (RT) per 15 minuti. Dopo l'incubazione, agitare delicatamente la miscela di trasfezione toccando il tubo, quindi aggiungere 10 μL della miscela di trasfezione direttamente al terreno di crescita esistente nei pozzetti.
5. Successivamente, riportare le cellule all'incubatore e consentire ai plasmidi di esprimersi per 48 ore. La sostituzione dei substrati di crescita non è necessaria.
6. Monitorare l'efficienza di trasfezione mediante fluorescenza GFP utilizzando un microscopio a fluorescenza. Le cellule HEK293T sono trasfettate in modo efficiente con questo metodo e >80% delle cellule dovrebbe esprimere GFP dopo 48 ore.

3. Misurazione dell'attività della luciferasi

NOTA: L'attività della luciferasi viene valutata utilizzando un sistema disponibile in commercio che analizza sia Firefly che Renilla luciferasi (Table of Materials) secondo il protocollo del produttore.

1. Aspirare accuratamente i terreni di coltura dalle cellule HEK293T trasfettate, quindi lavare le cellule con soluzione salina tamponata con fosfato freddo (PBS). Aspirare il PBS e lisare le cellule aggiungendo 25 μL di tampone di lisi non denaturante e incubare per 15 minuti con un leggero dondolio sul ghiaccio.
2. Successivamente, aggiungere 20 μL del lisato risultante (non è necessaria alcuna centrifugazione) in una nuova piastra di dosaggio a 96 pozzetti contenente 100 μL di un reagente substrato della luciferasi Firefly. Mescolare delicatamente il piatto picchiettando.
3. Caricare la piastra su un lettore di piastre e misurare la luminescenza utilizzando un rilevatore superiore con un'altezza di lettura di 1 mm e un tempo di integrazione di 1 s.
   NOTA: Potrebbe essere necessario regolare il guadagno del rilevatore in base alla potenza del segnale.
4. Subito dopo aver letto la luminescenza della Luciferasi Firefly, aggiungere 100 μL di substrato di Renilla luciferasi ai pozzetti. Questo passaggio spegne simultaneamente l'attività della luciferasi Firefly mentre valuta l'attività della renilla luciferasi. Mescolare i campioni agitando delicatamente la piastra e misurare nuovamente la luminescenza per valutare l'attività della Renilla luciferasi.
   NOTA: Mentre altre piastre possono essere utilizzate per questo test, l'uso di piastre con cornici nere e pozzetti bianchi fornirà i risultati più sensibili in quanto ciò amplifica il segnale della luciferasi riducendo al minimo il rumore.
5. Quantificare le risposte del reporter come rapporto Luciferasi di Firefly / Renilla luciferasi (Firefly / Renilla) e calcolare la media dei valori delle misurazioni triplice. Successivamente, normalizzare il valore Firefly/Renilla per ciascuna variante rispetto ai valori per le cellule che esprimono Ube3a wild-type (WT) per confrontare l'attività relativa delle proteine varianti.

Risultati

Lo screening funzionale su larga scala delle varianti missenso di Ube3a identifica un ampio panorama di mutazioni con perdita e guadagno di funzione
Precedenti lavori con mutanti Ube3a hanno suggerito che la risposta Wnt può servire come reporter dell'attività cellulare della proteina UBE3A. Queste osservazioni sono state ampliate e sono stati eseguiti ulteriori esperimenti di convalida per indagare se il test BAR è adatto a segnalare una serie di attività UBE3A nella cellula. In...

Discussione

Il protocollo qui descritto fornisce un metodo efficiente e scalabile per valutare l'attività enzimatica delle varianti di Ube3a. Ci sono diversi dettagli tecnici che meritano un'attenta considerazione quando si utilizza questo test. Una considerazione è la scelta dei plasmidi reporter Wnt utilizzati in questo test. Il protocollo qui descritto utilizza specificamente il reporter attivato da β-catenina (BAR)²¹, un reporter che contiene un concatenatore di 12 elementi di risposta del fat...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red	Gibco	25300-054
1 Kb DNA ladder	Lambda Biotech	M108-S
100 bp DNA Ladder	Lambda Biotech	M107
10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10 mM ATP	New England BioLabs	B0202A
5x Phusion HF Reaction Buffer	New England BioLabs	B0518S
Antibiotic-Antimycotic Solution	Corning	30004CI
Black/White Isoplate-96 Black Frame White Well plate	PerkinElmer	6005030
Carbenicillin Disodium Salt	Midwest Scientific	KCC46000-5
Countess cell counting chamber  slides	Invitrogen by Thermo Fisher Scientific	C10283
Countess II Automated Cell Counter	life technologies		Cell counting machine
Custom DNA oligos	Integrated DNA Technologies (IDT)
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix	New England BioLabs	N0447S
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate	Gibco	10569044	Basal medium for supporting the growth of HEK293T cell line
DPBS (1x)	Gibco	14190-136
Dual-Luciferase Reporter Assay System	Promega	E1910
EcoRI-HF	New England BioLabs	R3101S	Restriction enzyme
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated	Gibco	16140071	Fetal bovine serum
Fisherbrand Surface Treated Tissue Culture Dishes	Fisherbrand	FB012924
FuGENE 6 Transfection Reagent	Promega	E2691
Gel Loading Dye Purple (6x)	New England BioLabs	B7024A
HEK293T cells	ATCC	CRL-3216
High Efficiency ig 10B Chemically Competent Cells	Intact Genomics	1011-12	E. coli DH10B cells
HiSpeed Plasmid Midi Kit	Qiagen	12643	Midi prep
pCIG2 plasmid
pGL3 BAR plasmid
Phusion HF DNA Polymerase	New England BioLabs	M0530L	DNA polymerase
ProFlex 3 x 32 well PCR System	Applied biosystems by life technologies		Thermocycler
pTK Renilla plasmid
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)	Qiagen	27106	Mini prep
QIAquick Gel Extraction Kit (250)	Qiagen	28706	Gel purification
QIAquick PCR Purification Kit (250)	Qiagen	28106	PCR purification
rCutSmart Buffer	New England BioLabs	B6004S
SacI-HF	New England BioLabs	R3156S	Restriction enzyme
Synergy HTX Multi-Mode Reader	BioTek		Plate reader runs Gen5 software v3.08 (BioTek)
T4 DNA Ligase	New England BioLabs	M0202L	Ligase
TAE Buffer, Tris-Acetate-EDTA, 50x Solution, Electrophoresis	Fisher Scientific	BP13324
Tissue Culture Plate 96 wells, Flat Bottom	Fisherbrand	FB012931
UltraPure Ethidium Bromide Solution	Invitrogen by Thermo Fisher Scientific	15585011
XmaI	New England BioLabs	R0180S	Restriction enzyme