Um método escalável baseado em células para a avaliação funcional de variantes do Ube3a

Resumo

Um método simples e escalável foi desenvolvido para avaliar o significado funcional de variantes missense em Ube3a, um gene cuja perda e ganho de função estão ligados à síndrome de Angelman e ao transtorno do espectro do autismo.

Resumo

O aumento do uso de sequenciamento na medicina identificou milhões de variantes codificadoras no genoma humano. Muitas dessas variantes ocorrem em genes associados a distúrbios do neurodesenvolvimento, mas o significado funcional da grande maioria das variantes permanece desconhecido. O presente protocolo descreve o estudo de variantes para Ube3a, um gene que codifica uma ubiquitina ligase E3 ligada ao autismo e à síndrome de Angelman. A duplicação ou triplicação de Ube3a está fortemente ligada ao autismo, enquanto sua deleção causa a síndrome de Angelman. Assim, a compreensão da valência das alterações na atividade da proteína UBE3A é importante para os desfechos clínicos. Aqui, um método rápido, baseado em células, que emparelha variantes Ube3a com um repórter de via Wnt é descrito. Este ensaio simples é escalável e pode ser usado para determinar a valência e a magnitude das mudanças de atividade em qualquer variante do Ube3a . Além disso, a facilidade deste método permite a geração de uma riqueza de informações estrutura-função, que podem ser usadas para obter insights profundos sobre os mecanismos enzimáticos da UBE3A.

Introdução

Avanços tecnológicos recentes têm tornado rotineiro o sequenciamento de exomas e genomas em ambientes clínicos ^1,2. Isso levou à descoberta de um grande número de variantes genéticas, incluindo milhões de variantes missense que normalmente mudam um aminoácido em uma proteína. Compreender o significado funcional dessas variantes continua sendo um desafio, e apenas uma pequena fração (~2%) das variantes de missense conhecidas tem uma interpretação clínica ^1,3.

Um exemplo proeminente desse problema é o Ube3a, um gene q....

Protocolo

1. Clonagem de mutagênese para gerar variantes do Ube3a

1. Clone todas as variantes de Ube3a no plasmídeo pCIG2 (Figura 1A), um vetor bicistrônico que contém um promotor de acetina β galinha e um local de entrada interno de ribossomo (IRES) para a expressão EGFP¹⁹. Construções Ube3a de comprimento total contêm uma sequência de N-terminal Myc-tag e são clonadas em pCIG2 usando um site SacI de 5' e um site XmaI de 3'. Além disso, os locais EcoRI, EcoRV e PstI que ocorrem naturalmente dentro da sequência de codificação Ube3a também são usados para subclonar f....

Resultados

A triagem funcional em larga escala de variantes de Missense do Ube3a identifica um amplo cenário de mutações de perda e ganho de função
Trabalhos anteriores com mutantes Ube3a sugeriram que a resposta Wnt pode servir como um repórter da atividade celular da proteína UBE3A. Essas observações foram expandidas e experimentos de validação adicionais foram realizados para investigar se o ensaio BAR é adequado para relatar uma série de atividades UBE3A na célula. Primeiro, a.......

Discussão

O protocolo aqui descrito fornece um método eficiente e escalável para avaliar a atividade enzimática das variantes de Ube3a. Existem vários detalhes técnicos que merecem uma consideração cuidadosa ao usar este ensaio. Uma consideração é a escolha dos plasmídeos repórteres Wnt utilizados neste ensaio. O protocolo descrito aqui usa especificamente o β-catenin activated reporter (BAR)²¹, um reportador que contém um concatenador de 12 elementos de resposta do fator de células .......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red	Gibco	25300-054
1 Kb DNA ladder	Lambda Biotech	M108-S
100 bp DNA Ladder	Lambda Biotech	M107
10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10 mM ATP	New England BioLabs	B0202A
5x Phusion HF Reaction Buffer	New England BioLabs	B0518S
Antibiotic-Antimycotic Solution	Corning	30004CI
Black/White Isoplate-96 Black Frame White Well plate	PerkinElmer	6005030
Carbenicillin Disodium Salt	Midwest Scientific	KCC46000-5
Countess cell counting chamber  slides	Invitrogen by Thermo Fisher Scientific	C10283
Countess II Automated Cell Counter	life technologies		Cell counting machine
Custom DNA oligos	Integrated DNA Technologies (IDT)
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix	New England BioLabs	N0447S
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate	Gibco	10569044	Basal medium for supporting the growth of HEK293T cell line
DPBS (1x)	Gibco	14190-136
Dual-Luciferase Reporter Assay System	Promega	E1910
EcoRI-HF	New England BioLabs	R3101S	Restriction enzyme
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated	Gibco	16140071	Fetal bovine serum
Fisherbrand Surface Treated Tissue Culture Dishes	Fisherbrand	FB012924
FuGENE 6 Transfection Reagent	Promega	E2691
Gel Loading Dye Purple (6x)	New England BioLabs	B7024A
HEK293T cells	ATCC	CRL-3216
High Efficiency ig 10B Chemically Competent Cells	Intact Genomics	1011-12	E. coli DH10B cells
HiSpeed Plasmid Midi Kit	Qiagen	12643	Midi prep
pCIG2 plasmid
pGL3 BAR plasmid
Phusion HF DNA Polymerase	New England BioLabs	M0530L	DNA polymerase
ProFlex 3 x 32 well PCR System	Applied biosystems by life technologies		Thermocycler
pTK Renilla plasmid
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)	Qiagen	27106	Mini prep
QIAquick Gel Extraction Kit (250)	Qiagen	28706	Gel purification
QIAquick PCR Purification Kit (250)	Qiagen	28106	PCR purification
rCutSmart Buffer	New England BioLabs	B6004S
SacI-HF	New England BioLabs	R3156S	Restriction enzyme
Synergy HTX Multi-Mode Reader	BioTek		Plate reader runs Gen5 software v3.08 (BioTek)
T4 DNA Ligase	New England BioLabs	M0202L	Ligase
TAE Buffer, Tris-Acetate-EDTA, 50x Solution, Electrophoresis	Fisher Scientific	BP13324
Tissue Culture Plate 96 wells, Flat Bottom	Fisherbrand	FB012931
UltraPure Ethidium Bromide Solution	Invitrogen by Thermo Fisher Scientific	15585011
XmaI	New England BioLabs	R0180S	Restriction enzyme