Um método escalável baseado em células para a avaliação funcional de variantes do Ube3a

Resumo

Um método simples e escalável foi desenvolvido para avaliar o significado funcional de variantes missense em Ube3a, um gene cuja perda e ganho de função estão ligados à síndrome de Angelman e ao transtorno do espectro do autismo.

Resumo

O aumento do uso de sequenciamento na medicina identificou milhões de variantes codificadoras no genoma humano. Muitas dessas variantes ocorrem em genes associados a distúrbios do neurodesenvolvimento, mas o significado funcional da grande maioria das variantes permanece desconhecido. O presente protocolo descreve o estudo de variantes para Ube3a, um gene que codifica uma ubiquitina ligase E3 ligada ao autismo e à síndrome de Angelman. A duplicação ou triplicação de Ube3a está fortemente ligada ao autismo, enquanto sua deleção causa a síndrome de Angelman. Assim, a compreensão da valência das alterações na atividade da proteína UBE3A é importante para os desfechos clínicos. Aqui, um método rápido, baseado em células, que emparelha variantes Ube3a com um repórter de via Wnt é descrito. Este ensaio simples é escalável e pode ser usado para determinar a valência e a magnitude das mudanças de atividade em qualquer variante do Ube3a . Além disso, a facilidade deste método permite a geração de uma riqueza de informações estrutura-função, que podem ser usadas para obter insights profundos sobre os mecanismos enzimáticos da UBE3A.

Introdução

Avanços tecnológicos recentes têm tornado rotineiro o sequenciamento de exomas e genomas em ambientes clínicos ^1,2. Isso levou à descoberta de um grande número de variantes genéticas, incluindo milhões de variantes missense que normalmente mudam um aminoácido em uma proteína. Compreender o significado funcional dessas variantes continua sendo um desafio, e apenas uma pequena fração (~2%) das variantes de missense conhecidas tem uma interpretação clínica ^1,3.

Um exemplo proeminente desse problema é o Ube3a, um gene que codifica uma ligase de ubiquitina E3 que tem como alvo proteínas de substrato para degradação⁴. Ube3a reside no cromossomo 15q11-13 e é expresso exclusivamente a partir do alelo herdado maternalmente ^5,6,7. Observações da genética da doença sugerem fortemente que a atividade insuficiente ou excessiva da enzima UBE3A causa distúrbios distintos do neurodesenvolvimento. A deleção do cromossomo materno 15q11-13 causa síndrome de Angelman (EA)8, distúrbio caracterizado por deficiência intelectual grave, comprometimento motor, convulsões, comportamento feliz com sorriso frequente e características faciais dismórficas ^8,9,10. Em contraste, a duplicação ou triplicação do cromossomo materno 15q11-13 causa a síndrome de Dup15q, uma condição heterogênea reconhecida como uma das formas sindrômicas mais prevalentes de autismo^11,12,13. Além disso, existem centenas de variantes missense identificadas no Ube3a, a maioria das quais são consideradas variantes de significado incerto (USV), pois seu significado funcional e clínico são desconhecidos. Assim, há um interesse considerável no desenvolvimento de métodos que possam avaliar empiricamente as variantes do Ube3a para determinar se elas contribuem para a doença do neurodesenvolvimento.

A enzima UBE3A pertence à família de domínios HECT (homóloga ao E6-AP C-terminus) de ligases E3 ubiquitina que possuem o domínio homônimo HECT, que contém o maquinário bioquímico necessário para aceitar ubiquitina ativada de enzimas E2 e transferi-la para proteínas de substrato¹⁴. Historicamente, a caracterização das enzimas E3 tem se baseado em sistemas in vitro reconstituídos que requerem um conjunto de proteínas purificadas 4,15,16. Tais métodos são lentos e trabalhosos e não são passíveis de avaliar a atividade de um grande número de variantes. Em trabalhos anteriores, o UBE3A foi identificado para ativar a via Wnt em células HEK293T, modulando a função do proteassoma para retardar a degradação da β-catenina¹⁷. Essa percepção permite o uso de repórteres de via Wnt como um método eficiente e rápido para identificar variantes de perda e ganho de função do Ube3a¹⁸. O protocolo abaixo descreve em detalhes um método para gerar variantes Ube3a, bem como um repórter baseado em luciferase para avaliar mudanças na atividade de variantes Ube3a.

Protocolo

1. Clonagem de mutagênese para gerar variantes do Ube3a

1. Clone todas as variantes de Ube3a no plasmídeo pCIG2 (Figura 1A), um vetor bicistrônico que contém um promotor de acetina β galinha e um local de entrada interno de ribossomo (IRES) para a expressão EGFP¹⁹. Construções Ube3a de comprimento total contêm uma sequência de N-terminal Myc-tag e são clonadas em pCIG2 usando um site SacI de 5' e um site XmaI de 3'. Além disso, os locais EcoRI, EcoRV e PstI que ocorrem naturalmente dentro da sequência de codificação Ube3a também são usados para subclonar fragmentos.
   NOTA: Variantes não identificadas para Ube3a podem ser obtidas através da literatura e em repositórios acessíveis ao público, como o banco de dados ClinVar¹. Variantes adicionais não relatadas podem ser obtidas através da comunicação pessoal com centros médicos.
2. Use um método de mutagênese megaprimer de duas etapas adaptado²⁰ para introduzir mutações no quadro de leitura do Ube3a . Na primeira etapa, projete o oligonucleotídeo mutagênico que contém a mutação desejada (o exemplo mostrado neste protocolo é gerar uma variante UBE3A Q588E) ladeado por pelo menos 30 pares de bases (pb) de homologia 5′ e 3′ à mutação (Figura 1B e Tabela 1).
3. Utilizar o oligonucleotídeo mutagênico juntamente com um oligonucleotídeo complementar para a primeira rodada de PCR para gerar um megaprimer de 200-400 pb contendo a mutação (Figura 1C; Tabela 2 e Tabela 3). Use todos os 50 μL do volume de reação de PCR para eletroforese em gel de agarose usando um gel a 1% e subsequente purificação em gel (Tabela de Materiais). Eluir o produto de PCR em 30 μL de H 2 O deionizado (diH₂O)para uso na segunda etapa de PCR abaixo da rodada.
4. Configure a segunda rodada de PCR conforme indicado (Figura 1C; Tabela 2 e Tabela 3). Esta etapa gerará fragmentos de DNA maiores (tipicamente ~1-1,5 kb de comprimento) contendo os locais de mutação e restrição terminal adequados para subclonagem (Figura 1C).
5. Após a conclusão da reação de PCR, purifice o produto resultante usando um kit de purificação de PCR (Tabela de Materiais). Eluir em 30 μL e digerir todo o produto purificado e o construto pCIG2 Ube3a WT com as enzimas de restrição apropriadas (o exemplo mostra a digestão com EcoRI e XmaI).
6. Após 2 h de digestão a 37 °C, resolver os produtos da digestão através da eletroforese em gel de agarose (gel a 1%) e purificar os produtos apropriados. Configure ligaduras de acordo com o protocolo do fabricante (Tabela de Materiais), transforme os produtos de ligadura em uma cepa bacteriana DH10B (Tabela de Materiais) e, em seguida, pratique com ampicilina (100 μg/mL) de seleção.
7. No dia seguinte, escolha de duas a quatro colônias para inocular 3 mL de culturas contendo caldo de Luria (LB) e 100 μg/mL de ampicilina. Deixe as culturas crescerem durante a noite a 37 °C em uma incubadora orbital com agitação (225 rpm).
8. No dia seguinte, use 1-1,5 mL da cultura bacteriana para minipreparar o DNA plasmidial (Tabela de Materiais). Salve a cultura restante colocando-a a 4 °C. Rastreie os plasmídeos minipreparados por sequenciamento de Sanger usando um oligonucleotídeo que se liga ~ 200 pb da mutação desejada.
9. Use as culturas bacterianas salvas a 4 °C para re-inocular 50 mL de culturas para midiprep o plasmídeo correto (Tabela de Materiais). Sequencie completamente a sequência de codificação Ube3a para validar a sequência correta do DNA.
10. Crie estoques de trabalho de plasmídeos variantes de Ube3a, bem como o repórter ativado por β-catenina (BAR)²¹, luciferase TK-Renilla, Ube3a morto de ligase (mutação UBE3A C820A) e vetor vazio pCIG2 a uma concentração de 100 ng/μL usando H₂O estéril para as etapas de transfecção subsequentes.

2. Preparação e transfecção de células 293T embrionárias do rim humano (HEK293T)

1. Realizar os ensaios em células HEK293T cultivadas em meio Eagle modificado (DMEM) da Dulbecco pré-suplementado com glutamina, soro fetal bovino a 10% (FBS) e antibiótico-antimicótico, conforme descrito anteriormente¹⁷. Cultivar as células em uma incubadora estéril e umidificada a 37 °C com 5% de CO₂.
2. Usando um gabinete de biossegurança, primeiro coloque as células HEK293T suspensas em placas de fundo plano de 96 poços tratadas com cultura de tecidos a uma densidade de 2,2 × 10⁴ células por poço em 100 μL de meios de cultura e permita que elas cresçam durante a noite.
3. No segundo dia, transfectar as células em um gabinete de biossegurança com plasmídeos repórteres Firefly e Renilla luciferase (Tabela 4) e plasmídeos Ube3a em triplicado. Realizar as transfecções em 10 μL de volume total por poço utilizando uma proporção de 10:1:8 de plasmídeos (50 ng de BAR, 5 ng de TK-Renilla e 40 ng de plasmídeo Ube3a por poço, respectivamente), conforme descrito anteriormente¹⁸, e 0,4 μL de reagente de transfecção (Tabela 4).
   NOTA: Para cada experimento, um vetor vazio (somente GFP) e um plasmídeo codificando Ube3a morto por ligase também são transfectados para servir como controles negativos.
4. Criar uma mistura mestra para as transfecções para cada variante em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL (Tabela 4) e incubar à temperatura ambiente (RT) por 15 min. Após a incubação, agite suavemente a mistura de transfecção batendo no tubo e, em seguida, adicione 10 μL da mistura de transfecção diretamente ao meio de crescimento existente nos poços.
5. Depois, devolva as células à incubadora e permita que os plasmídeos se expressem por 48 h. A substituição do meio de crescimento não é necessária.
6. Monitore a eficiência da transfecção por fluorescência GFP usando um microscópio de fluorescência. As células HEK293T são eficientemente transfectadas por este método e >80% das células devem expressar GFP após 48 h.

3. Medição da atividade da luciferase

NOTA: A atividade da Luciferase é avaliada usando um sistema comercialmente disponível que ensaia a luciferase Firefly e Renilla (Tabela de Materiais) de acordo com o protocolo do fabricante.

1. Aspirar cuidadosamente o meio de cultura a partir de células HEK293T transfectadas e, em seguida, lavar as células com solução salina tamponada com fosfato frio (PBS). Aspirar o PBS e lisar as células adicionando 25 μL de tampão de lise não desnaturante e incubar por 15 min com balanço suave no gelo.
2. Posteriormente, adicione 20 μL do lisado resultante (nenhuma centrifugação é necessária) em uma nova placa de ensaio de 96 poços contendo 100 μL de um reagente de substrato de luciferase Firefly. Misture o prato suavemente batendo.
3. Carregue a placa em um leitor de placas e meça a luminescência usando um detector superior com uma altura de leitura de 1 mm e um tempo de integração de 1 s.
   NOTA: O ganho do detector pode precisar ser ajustado com base na força do sinal.
4. Imediatamente após a leitura da luminescência da luciferase Firefly, adicione 100 μL de substrato de luciferase Renilla aos poços. Este passo simultaneamente extingue a atividade da luciferase Firefly enquanto avalia a atividade da luciferase Renilla. Misture as amostras por agitação suave da placa e meça a luminescência novamente para avaliar a atividade da luciferase de Renilla .
   NOTA: Enquanto outras placas podem ser usadas para este ensaio, o uso de placas com quadros pretos e poços brancos fornecerá os resultados mais sensíveis, pois isso amplifica o sinal de luciferase, minimizando o ruído.
5. Quantifique as respostas do repórter como a razão Luciferase Firefly para Renilla luciferase (Firefly/Renilla) e calcule a média dos valores das medições triplicadas. Posteriormente, normalize o valor de Firefly/Renilla para cada variante em relação aos valores para células expressivas Ube3a do tipo selvagem (WT) para comparar a atividade relativa das proteínas variantes.

Resultados

A triagem funcional em larga escala de variantes de Missense do Ube3a identifica um amplo cenário de mutações de perda e ganho de função
Trabalhos anteriores com mutantes Ube3a sugeriram que a resposta Wnt pode servir como um repórter da atividade celular da proteína UBE3A. Essas observações foram expandidas e experimentos de validação adicionais foram realizados para investigar se o ensaio BAR é adequado para relatar uma série de atividades UBE3A na célula. Primeiro, a...

Discussão

O protocolo aqui descrito fornece um método eficiente e escalável para avaliar a atividade enzimática das variantes de Ube3a. Existem vários detalhes técnicos que merecem uma consideração cuidadosa ao usar este ensaio. Uma consideração é a escolha dos plasmídeos repórteres Wnt utilizados neste ensaio. O protocolo descrito aqui usa especificamente o β-catenin activated reporter (BAR)²¹, um reportador que contém um concatenador de 12 elementos de resposta do fator de células ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red	Gibco	25300-054
1 Kb DNA ladder	Lambda Biotech	M108-S
100 bp DNA Ladder	Lambda Biotech	M107
10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10 mM ATP	New England BioLabs	B0202A
5x Phusion HF Reaction Buffer	New England BioLabs	B0518S
Antibiotic-Antimycotic Solution	Corning	30004CI
Black/White Isoplate-96 Black Frame White Well plate	PerkinElmer	6005030
Carbenicillin Disodium Salt	Midwest Scientific	KCC46000-5
Countess cell counting chamber  slides	Invitrogen by Thermo Fisher Scientific	C10283
Countess II Automated Cell Counter	life technologies		Cell counting machine
Custom DNA oligos	Integrated DNA Technologies (IDT)
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix	New England BioLabs	N0447S
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate	Gibco	10569044	Basal medium for supporting the growth of HEK293T cell line
DPBS (1x)	Gibco	14190-136
Dual-Luciferase Reporter Assay System	Promega	E1910
EcoRI-HF	New England BioLabs	R3101S	Restriction enzyme
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated	Gibco	16140071	Fetal bovine serum
Fisherbrand Surface Treated Tissue Culture Dishes	Fisherbrand	FB012924
FuGENE 6 Transfection Reagent	Promega	E2691
Gel Loading Dye Purple (6x)	New England BioLabs	B7024A
HEK293T cells	ATCC	CRL-3216
High Efficiency ig 10B Chemically Competent Cells	Intact Genomics	1011-12	E. coli DH10B cells
HiSpeed Plasmid Midi Kit	Qiagen	12643	Midi prep
pCIG2 plasmid
pGL3 BAR plasmid
Phusion HF DNA Polymerase	New England BioLabs	M0530L	DNA polymerase
ProFlex 3 x 32 well PCR System	Applied biosystems by life technologies		Thermocycler
pTK Renilla plasmid
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)	Qiagen	27106	Mini prep
QIAquick Gel Extraction Kit (250)	Qiagen	28706	Gel purification
QIAquick PCR Purification Kit (250)	Qiagen	28106	PCR purification
rCutSmart Buffer	New England BioLabs	B6004S
SacI-HF	New England BioLabs	R3156S	Restriction enzyme
Synergy HTX Multi-Mode Reader	BioTek		Plate reader runs Gen5 software v3.08 (BioTek)
T4 DNA Ligase	New England BioLabs	M0202L	Ligase
TAE Buffer, Tris-Acetate-EDTA, 50x Solution, Electrophoresis	Fisher Scientific	BP13324
Tissue Culture Plate 96 wells, Flat Bottom	Fisherbrand	FB012931
UltraPure Ethidium Bromide Solution	Invitrogen by Thermo Fisher Scientific	15585011
XmaI	New England BioLabs	R0180S	Restriction enzyme