In vivo Estudio en tiempo real de los efectos de los fármacos sobre el flujo sanguíneo carotídeo en el feto ovino

Resumen

El presente protocolo describe un método para administrar fármacos y agentes modificadores de la expresión génica por vía perivascular en un feto en desarrollo intrauterino . Es importante destacar que el efecto de los fármacos/agentes sobre el flujo sanguíneo puede medirse con la progresión del embarazo.

Resumen

La capacidad de un organismo para mantener un flujo sanguíneo constante al cerebro en respuesta a aumentos repentinos de la presión arterial sistémica (PA) se conoce como autorregulación cerebral (CAR), que se produce en la arteria carótida. A diferencia de los recién nacidos a término, los recién nacidos prematuros son incapaces de reducir el flujo sanguíneo cerebral (CBF) en respuesta al aumento de la presión arterial sistémica. En los recién nacidos prematuros, esto expone los frágiles vasos cerebrales a altas presiones de perfusión, lo que lleva a su ruptura y daño cerebral. Los estudios ex vivo que utilizan miografía en alambre han demostrado que las arterias carótidas de fetos a corto plazo se contraen en respuesta a la activación de los receptores alfa1 adrenérgicos. Esta respuesta se ve atenuada en el feto prematuro. Por lo tanto, para examinar el papel de alfa1-AR in vivo, se presenta aquí un enfoque innovador para determinar los efectos de los fármacos en un segmento arterial carotídeo in vivo en un feto ovino durante la progresión del desarrollo de la gestación. Los datos presentados demuestran la medición simultánea del flujo sanguíneo fetal y la presión arterial. El sistema de administración perivascular se puede utilizar para realizar un estudio a largo plazo durante varios días. Las aplicaciones adicionales de este método podrían incluir sistemas de administración viral para alterar la expresión de genes en un segmento de la arteria carótida. Estos métodos podrían aplicarse a otros vasos sanguíneos en el organismo en crecimiento en el útero , así como en organismos adultos.

Introducción

El parto causa estrés al feto, y hay un aumento considerable en los niveles de catecolaminas, la principal hormona del estrés ^1,2. Esto eleva la PA sistémica, y si esta presión se transmite a los frágiles capilares cerebrales a través de las arterias carótidas, esto puede llevar a su ruptura ^3,4,5. Los aumentos repentinos de la presión arterial sistémica evitan que lleguen al cerebro mediante la constricción de las arterias carótidas en el feto a término. Sin embargo, este mecanismo no está desarrollado en el feto prematuro, y esto es responsable de la probabilidad significativamente mayor de daño cerebral en los fetos prematuros ^4,5.

En la actualidad, no existe un método adecuado para examinar la maduración de las vías implicadas en la regulación del flujo sanguíneo carotídeo en fetos en desarrollo. Estos estudios sobre el flujo sanguíneo carotídeo y la vasorreactividad son cruciales tanto desde el punto de vista de la ciencia básica como desde el punto de vista clínico. Actualmente, para determinar las vías moleculares implicadas en la regulación de la contractilidad arterial, el método estándar consiste en aislar los segmentos arteriales postmortem. A continuación, los experimentos se llevan a cabo mediante miografía en alambre para determinar la vasocontractilidad de diferentes moléculas farmacológicas que definen las vías reguladoras implicadas en la contractilidad arterial ^6,7. Cabe destacar que los hallazgos ex vivo no son capaces de replicar completamente el entorno in vivo debido a la regulación del flujo sanguíneo aguas arriba y aguas abajo de la arteria carótida. Por lo tanto, el presente estudio tuvo como objetivo desarrollar una técnica que pueda determinar los efectos de sustancias químicas o agentes vasosensibles sobre el flujo sanguíneo en una arteria in vivo.

La metodología de administración perivascular descrita en este artículo proporciona un enfoque in vivo para estudiar el efecto de la manipulación farmacológica o genética de las vías de señalización en diferentes segmentos arteriales. Con este método, se puede manipular la presión arterial fetal y el flujo sanguíneo carotídeo. Además, se demuestran experimentos con fetos de ovejas para estudiar los efectos de las moléculas de señalización en un feto en desarrollo. Es de esperar que la metodología detallada proporcionada conduzca a nuevas investigaciones en el campo de los estudios del flujo sanguíneo, especialmente en relación con la fisiología y la patología fetal.

Protocolo

Para el presente estudio, se obtuvo la aprobación de los experimentos con animales por parte del Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Arizona. Para el presente estudio se utilizaron ovejas Columbia-Rambouillet preñadas de entre 2 y 4 años de edad. Los animales fueron obtenidos de la Unidad de Ovejas de la Universidad de Arizona.

1. Mantenimiento de los animales

1. Consigue animales de cualquier rancho de ovejas.
2. Transportar las ovejas al laboratorio a los 105 días ± 5 días a los 137 días ± 5 días de edad gestacional (dGA). Mantener las ovejas a una temperatura de 22 °C ± 1 °C en humedad ambiente. Proporcione gránulos de alfalfa (consulte la Tabla de materiales), sales y agua ad libitum.

2. Preparación del material

1. Construir el sistema de catéter perivascular.
   1. Conecte un extremo de 4 pies de tubería Tygon a una tubería de bomba de colector (MPT) de 2 cm (consulte la Tabla de materiales). Conecte el otro extremo del MPT de 2 cm a otros 4 pies de tubo Tygon.
   2. Haga una pequeña hendidura en el MPT para que el líquido/agentes puedan salir al espacio perivascular.
2. Esterilice las sondas de flujo (consulte la Tabla de materiales), los catéteres y un destornillador pequeño utilizando el método de esterilización por gas.

3. Preparación prequirúrgica de los animales

1. Obtener la aprobación para experimentos con animales del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales.
2. Antes de la cirugía, mantenga a las ovejas con comida sin alcohol (NPO) durante 24 h y agua NPO durante 16 h. El día de la cirugía, envuelva la cara de la oveja con una almohadilla para proteger sus ojos. Afeitar el lado izquierdo del cuello para exponer la vena yugular y limpiar la piel con povidona yodada y etanol al 70%.
   1. Coloque un catéter intravenoso (IV) en la vena yugular de la oveja y fíjelo a la piel con cinta impermeable y clips para heridas (consulte la Tabla de materiales).
3. Anestesiar a las ovejas con una administración intravenosa de diazepam (0,15 mg/kg) y clorhidrato de ketamina (16 mg/kg). Administrar una inyección IM de penicilina G procaína en suspensión (25.000 I/kg) y ketoprofeno IV (2,2 mg/kg) (ver Tabla de Materiales).
4. Afeite el sitio de la incisión de la oveja y las áreas circundantes (abdomen, flancos e ingle) con una tijera de cuchillas # 10. Para asegurarte de que la lana se haya eliminado por completo, vuelve a afeitar el área con una cuchilla #40. Lave el área afeitada con un limpiador germicida (consulte la Tabla de materiales) y agua. Secar con una almohadilla desechable.
5. Confirme la profundidad de la anestesia (determinada y mantenida por la respuesta al pellizco de la piel, el reflejo corneal y la evaluación del tono de la mandíbula) y luego intuble a la oveja con un tubo endotraqueal de 6,5-7,5 mm de diámetro interior (ver Tabla de materiales) y asegure el tubo en su lugar. Coloque a la oveja en una mesa elevadora en decúbito lateral y transfiérala a una mesa quirúrgica en decúbito supino a una mesa quirúrgica con tapa en V.
   1. Asegure las extremidades de la oveja a la mesa quirúrgica V-top con amarres quirúrgicos. Coloque a la oveja en la posición de Trendelenburg para aliviar la presión sobre la unidad fetal-placentaria.
6. Coloque una sonda de oxímetro de pulso (consulte la Tabla de materiales) en la lengua/oído de la oveja para controlar continuamente la saturación de oxihemoglobina y la frecuencia cardíaca. Coloque un termómetro debajo de la lengua de la oveja para controlar la temperatura.
   1. Conecte el tubo endotraqueal al circuito respiratorio de la máquina de anestesia e inicie la ventilación mecánica mientras monitorea el_CO2 espirado.
7. Mantenga la anestesia ajustando el isoflurano entre 2,5% y 4% durante toda la cirugía. Asegúrese de que el animal esté adecuadamente anestesiado pellizcando la oreja. Administrar una solución poliiónica balanceada (solución salina al 0,9% p/v) a 5 mL/kg/h utilizando el catéter yugular colocado durante el paso 3.2.1.
8. Realice un lavado estéril. Pulverizar la zona abdominal y los flancos con solución de povidona (solución de yodo al 10%). Frote el área con una gasa empapada en yodo comenzando desde el sitio de la incisión y trabajando hacia afuera, asegurándose de no volver al centro después de frotar hacia afuera.
   1. A continuación, rocíe el área con etanol (70% de etanol p/v) y frote con una gasa empapada en etanol de manera similar al fregado con povidona. Repite todo el proceso tres veces. Rocíe el área con una solución de povidona.
9. Calentar solución salina en un recipiente estéril y llevarla a 37 °C. Manténgalo cerca de la mesa quirúrgica. Conecte el cauterio (consulte la Tabla de materiales).
10. Haga que los miembros del equipo quirúrgico se vistan con gorros, mascarillas y cubrezapatos, que se laven las manos (bata quirúrgica) y que se pongan batas y guantes quirúrgicos esterilizados. A partir de este momento, se debe seguir una estricta práctica quirúrgica estéril.
11. Cubra el área abdominal de la oveja esterilizada con toallas estériles.

4. Procedimiento quirúrgico

1. Exteriorización del feto
   1. Después de asegurar una profundidad adecuada de anestesia, realice una incisión de laparotomía estándar de 10 cm con un bisturí (hoja #20) sobre la línea alba desde el ombligo hasta la porción craneal de la ubre. Controle el sangrado mientras realiza una incisión con una cauterización (ajustes de potencia: 50 de corte y 25 de coagulación).
      1. Haga una pequeña incisión a través de la línea media de la pared del cuerpo debajo de la incisión en la piel y abra la cavidad abdominal con unas tijeras Metzenbaum (consulte la tabla de materiales).
   2. Exteriorizar el útero que contiene al feto a través de la pared abdominal mientras se colocan toallas quirúrgicas estériles debajo (entre el abdomen materno y el útero). Palpar el útero para determinar la posición fetal y los cotiledones. Con una cauterización, haga una incisión de ~ 10 cm a través de la pared uterina con una gran curvatura sobre el dorso de la cabeza, evitando los vasos sanguíneos y los placentomas visibles.
   3. Utilice cuatro pinzas Babcock (consulte la tabla de materiales) para asegurar el útero y las membranas placentarias, y tire de las pinzas Babcock en las cuatro esquinas opuestas para que la cabeza del feto sea visible. Exteriorice la mitad craneal del feto a través de esta incisión y cubra la cabeza fetal con un guante estéril sin látex lleno de solución salina tibia y estéril (37 °C) para evitar el inicio de la respiración.
2. Instrumentación del catéter perivascular de la arteria carótida
   1. Al extraer la cabeza fetal del útero, pídale a un asistente que sostenga suavemente las pinzas de Babcock en posición vertical para minimizar la pérdida de líquido amniótico. Con el cuello del feto expuesto, realice una incisión cutánea oblicua de 3-3,5 cm a lo largo del borde anterior del músculo esternocleidomastoideo (SCM) en un lado del cuello en la región media, y separe la fascia con pinzas para mosquitos.
      1. Divida el platisma y realice una disección a lo largo del borde medial del músculo SCM desde su tendón superior hasta el nivel del músculo omohioideo inferiormente. La retracción del SCM expondrá la lámina carotídea, que superficialmente contiene una vena yugular interna de paredes delgadas, y debajo de ella estará la arteria carótida como un vaso de paredes gruesas.
      2. Retraiga la piel con pinzas Babcock y realice una disección roma para liberar la arteria carótida del tejido circundante y de la lámina carotídea.
   2. Tome la sonda de flujo de 3 mm (consulte la Tabla de materiales) del paquete estéril, desenrosque la placa de respaldo de la sonda y deslícela para abrirla para exponer el soporte en L. Levante con cuidado la arteria carótida y enganche suavemente el bracket debajo del vaso mientras evita el contacto con el vaso.
      1. Use pinzas para cerrar el soporte de la sonda de flujo deslizando suavemente la placa de respaldo a una posición cerrada. Asegure el soporte de la sonda de flujo apretando el tornillo de respaldo de la sonda de flujo. Para facilitar este proceso, sujete suavemente los extremos de la sonda de flujo con pinzas para estabilizar la sonda de flujo mientras se aprieta el tornillo.
   3. Enjuague previamente el catéter perivascular y colóquelo en las proximidades de la arteria carótida proxima a la sonda de flujo. Asegúrese de que la hendidura abierta del catéter perivascular esté muy cerca de la arteria carótida.
      1. Con una sutura no absorbible de seda 3-0, asegure los extremos proximal y distal del sistema perivascular y la sonda de flujo al tejido intersticial cercano. Cierre el sitio de la incisión con un punto de sutura continuo, cierre la piel fetal con una sutura no absorbible de seda 3-0 y asegure los catéteres a la piel envolviendo la sutura alrededor del catéter tres veces. Retire el guante y vuelva a colocar la cabeza del feto en el útero.
3. Cateterismo de extremidades fetales
   1. Exteriorizar la pata trasera del feto. Sostenga la pierna y gírela hacia los lados para visualizar el área interna del muslo. Limpie el área con una gasa estéril, realice una incisión de 2 cm y exponga la arteria femoral. Coloque y asegure la sonda de flujo siguiendo un procedimiento similar al que se realiza con la carótida, y luego cierre la incisión.
   2. Hacer una incisión de 2 cm a lo largo de la cara medial de la tibia ~0,5 cm distal a la rodilla. Exponga la arteria tibial posterior (de paredes gruesas) y la vena safena (de paredes delgadas). Inserte catéteres de polivinilo (diámetro exterior: 1,4 mm y diámetro interior: 0,9 mm) en la arteria tibial posterior y la vena safena utilizando una técnica de corte estándar, como se menciona a continuación:
      1. Libere el vaso de interés con una disección roma. Ligar la porción distal del vaso con una sutura de seda 3-0 (sin aguja) usando un nudo cuadrado con tres lanzamientos. Coloque previamente una segunda atadura sin seda en la cara proximal del vaso (debajo del vaso), pero deje la ligadura desatada. Con las tijeras Castroviejo (ver Tabla de Materiales), realizar una pequeña incisión transversal en el vaso 2 mm proximal a la ligadura distal. La longitud del corte debe ser ~25% del diámetro del recipiente.
      2. Restrinja el flujo sanguíneo de los vasos tirando suavemente hacia arriba de la sutura proximal desatada. Llene el catéter con solución salina heparinizada estéril. Inserte el extremo biselado del catéter y avance la punta 20 cm dentro del vaso fetal.
      3. Sostenga el catéter en su lugar con fórceps mientras un asistente ata la sutura de seda proximal para asegurar el vaso al catéter; Ligar el vaso completamente alrededor del catéter insertado con nudos cuadrados a 2 mm del sitio de inserción con tres lanzamientos. Amarre la ligadura distal proximal a la ligadura proximal que asegura el vaso al catéter.
   3. Cierre la incisión en la piel con una sutura de seda no absorbible 3-0 con un patrón de sutura continua. Asegúrese de que las suturas estén atadas alrededor de los catéteres para evitar restringir el flujo sanguíneo si se tira. Coloque un catéter previamente enjuagado en el útero y asegúrelo al feto mediante una sutura con una sutura de seda no absorbible 3-0.

5. Volver a colocar el feto y cerrar la herida

1. Regrese el feto al útero. Suturar las membranas fetales utilizando suturas de seda no absorbibles 3-0 con un patrón de bloqueo continuo (Cushing). Cierre la capa muscular uterina con una sutura de seda no absorbible 3-0.
2. Inserte una varilla quirúrgica de acero inoxidable de 18 pulgadas por vía subcutánea a lo largo de la pared abdominal hasta la región paracostal. Deje que el extremo proximal de la varilla salga del sitio paracostal realizando una incisión de 1 cm.
   1. Coloque los catéteres en el extremo distal de la varilla quirúrgica y pídale a un asistente que alimente los catéteres y el cable de la sonda de flujo a través del sitio de salida paracostal empujando la varilla completamente a través de la abertura paracostal.
3. Asegure todos los catéteres y los cables de la sonda de flujo en el sitio de la incisión paracostal. Colocar con cinta impermeable, y suturar los catéteres a la piel de la oveja. Suturar una bolsa de malla de plástico en el exterior de la oveja sobre los catéteres y la sonda para almacenar los catéteres.
   1. Usando un material de sutura absorbible sintético monofilamento 1-0, asegure la línea alba con un patrón continuo. Asegure la capa de piel con grapas quirúrgicas.
4. Detenga la anestesia general y extube a la oveja una vez que los reflejos laríngeos hayan vuelto a la línea de base normal. No deje al animal desatendido hasta que haya recuperado la conciencia por completo. Mueva a la oveja al carro metabólico una vez que esté estable después de la anestesia general. Regrese el animal a la sala de experimentos postoperatorios después de recuperarse completamente de la anestesia.
5. Administrar analgésicos postoperatorios por vía intravenosa (10 mg/kg/día de fenilbutazona) durante 3 días. Enjuague los catéteres vasculares diariamente con solución salina heparinizada (100 U/ml de heparina en solución de NaCl al 0,9%).

6. Experimentos postoperatorios in vivo

1. Enjuague los catéteres todos los días con solución salina heparinizada (75 U/ml). Espere 72 h antes de realizar cualquier medición. Para medir el flujo sanguíneo, conecte las sondas de flujo insertadas en el feto con el módulo de flujo perivascular a PowerLab y a una computadora conectada.
   NOTA: Los registros se pueden realizar en el software PowerLab (consulte la Tabla de materiales) para medir el flujo sanguíneo carotídeo y femoral. Tome la medida de referencia durante 30 minutos.
2. Conecte los catéteres arteriales y amnióticos al amplificador de puente conectado a un convertidor de analógico a digital (consulte la Tabla de materiales). Administrar un bolo de 1 ml de fenilefrina de 10 uM al feto por vía intravenosa y medir el flujo carotídeo y femoral durante 15 min. Luego, espere 30 minutos o hasta que el flujo sanguíneo vuelva a la línea de base.
3. Infundir 1 ml de fenilefrina de 10 uM en el catéter perivascular y medir el flujo sanguíneo durante 15 minutos. Lave la fenilefrina administrando 5 ml de solución salina tibia a través del catéter perivascular. Luego, espere 30 minutos o hasta que el flujo sanguíneo vuelva a la línea de base.

Resultados

Para examinar la manipulación localizada in vivo del flujo sanguíneo, se administró 1 mL de fenilefrina (10 μM), un agonista α_1-AR, en el espacio perivascular de la arteria carótida mediante un catéter de infusión exteriorizado para determinar el efecto sobre el flujo sanguíneo carotídeo local y el efecto sobre la presión arterial sistémica. La figura 1A demuestra una reducción significativa del flujo sanguíneo carotídeo sin ningún efecto sobre la presión...

Discusión

En la actualidad, no existe ningún método para examinar la contractilidad y la dilatación de los vasos in vivo en respuesta a compuestos farmacológicos y manipulación génica. Como estándar en el campo, el flujo sanguíneo in vivo se mide mediante sondas de flujo Doppler, microesferas y moléculas radiactivas como el agua tritiada. Sin embargo, para manipular las funciones de los receptores o la señalización posterior, los animales son sacrificados y los experimentos se llevan a cabo in vitr...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aaron Bovie Electrosurgical Cautery	Henry Schein, Inc	5905974
Aaron Bovie Electrosurgical Generator	Henry Schein, Inc	1229913
Alfalfa Pellets	Sacate Pellet Mills, Inc. Maricopa AZ	100-80
Analog to Digital Converter	ADI Instruments	Powerlab
Babcock forceps	Roboz Surgicals	RS8020
Bridge Amplifier	ADI Instruments	Bridge Amplifier
Castroviejo scissors	Roboz Surgicals	RS5650SC
Diazepam	Henry Schein, Inc	1278188
Endotracheal Tube	Henry Schein, Inc	7020408
Flow Probes	Transonic Systems Inc.	MC2PSS-JS-WC100-CRS10-GC, MC3PSS-LS-WC100-CRS10-GC
Heparin	Henry Schein, Inc	1162406
Isoflurane	Henry Schein, Inc	1182097
Ketamine	Henry Schein, Inc	1273383
Ketoprofen	Zoetis Inc., Kalamazoo, MI	Ketofen
Manifold Pump Tubing	Fisher Scientific	14-190-508
Metzenbaum scissors	Roboz Surgicals	RS6010
Narkomed 4 Anesthesia Machine	North American Dräger	Narkomed 4
Normal Saline	Fisher Scientific	Z1376
penicillin G procaine suspension	Henry Schein, Inc	7455874
phenylbutazone	VetOne Boise, ID	510226
Phenylephrine	Sigma Aldrich Inc.	P1240000
Pivodine Scrub	VetOne	510094	Germicidal cleanser
PowerLab	ADInstruments		Data acquisition hardware device
Pulse Oximeter	Amazon Inc.	UT100V
Tygon Tubing	Fisher Scientific	ND-100-80
V-Top Surgical Table	VetLine Veterinary Classic Surgery	TSP-4010
Wound Clips	Fisher Scientific	10-001-024