In vivo Исследование в режиме реального времени влияния препарата на сонный кровоток у овечьего плода

Резюме

В настоящем протоколе описан способ периваскулярной доставки лекарственных препаратов и агентов, модифицирующих экспрессию генов, внутриутробно развивающемуся плоду. Важно отметить, что влияние лекарств/агентов на кровоток можно измерить по мере прогрессирования беременности.

Аннотация

Способность организма поддерживать постоянный приток крови к мозгу в ответ на внезапные скачки системного артериального давления (АД) известна как церебральная ауторегуляция (CAR), которая происходит в сонной артерии. В отличие от доношенных новорожденных, недоношенные новорожденные не способны снижать мозговой кровоток (КБК) в ответ на повышение системного АД. У недоношенных новорожденных это подвергает хрупкие сосуды головного мозга высокому перфузионному давлению, что приводит к их разрыву и повреждению мозга. Исследования ex vivo с использованием проволочной миографии продемонстрировали, что сонные артерии недоношенного плода сужаются в ответ на активацию адренергических альфа1-рецепторов. Эта реакция притупляется у недоношенного плода. Таким образом, для изучения роли альфа1-АР in vivo представлен инновационный подход к определению влияния лекарственных препаратов на сегмент сонной артерии in vivo у овцевидного плода в период развития гестации. Представленные данные свидетельствуют об одновременном измерении внутриутробного кровотока плода и артериального давления. Периваскулярная система доставки может быть использована для проведения длительного исследования в течение нескольких дней. Дополнительные применения этого метода могут включать системы доставки вируса для изменения экспрессии генов в сегменте сонной артерии. Эти методы могут быть применены к другим кровеносным сосудам в растущем организме внутриутробно , а также во взрослом организме.

Введение

Рождение вызывает стресс у плода, и происходит значительное повышение уровня катехоламина, основного гормона стресса ^1,2. Это повышает системное АД, и если это давление передается в хрупкие капилляры головного мозга через сонные артерии, это может привести к их разрыву ^3,4,5. Скачки системного АД не достигают головного мозга из-за сужения сонных артерий у доношенного плода. Однако этот механизм не развит у недоношенного плода, и это ответственно за значительно более высокую вероятность поражения головного мозга у недоношенных плодов ^4,5.

В настоящее время не существует подходящего метода для изучения созревания путей, участвующих в регуляции сонного кровотока у развивающихся плодов. Эти исследования сонного кровотока и вазочувствительности имеют решающее значение как с фундаментальной научной, так и с клинической точки зрения. В настоящее время для определения молекулярных путей, участвующих в регуляции сократимости артерий, стандартный метод предполагает посмертную изоляцию артериальных сегментов. Затем проводятся эксперименты с использованием проволочной миографии для определения вазосократимости различных фармакологических молекул, определяющих регуляторные пути, участвующие в артериальной сократимости ^6,7. Следует отметить, что результаты ex vivo не способны полностью воспроизвести среду in vivo из-за регуляции кровотока вверх и вниз по течению от сонной артерии. Таким образом, целью настоящего исследования была разработка методики, позволяющей определять влияние вазочувствительных химических веществ или агентов на кровоток в артерии in vivo.

Методология периваскулярной доставки, описанная в данной статье, обеспечивает подход in vivo для изучения влияния фармакологических или генетических манипуляций сигнальных путей на различные артериальные сегменты. С помощью этого метода можно манипулировать артериальным давлением плода и сонным кровотоком. Кроме того, демонстрируются эксперименты с зародышами овец для изучения эффектов сигнальных молекул в развивающемся плоде. Будем надеяться, что представленная подробная методология приведет к новым исследованиям в области изучения кровотока, особенно в отношении физиологии и патологии плода.

протокол

Для настоящего исследования было получено разрешение на проведение экспериментов на животных от Комитета по уходу за животными и их использованию Университета Аризоны. Для настоящего исследования были использованы беременные овцы породы Колумбия-Рамбуйе в возрасте от 2 до 4 лет. Животные были получены из овцеводческого подразделения Университета Аризоны.

1. Содержание животных

1. Добывайте животных с любого овечьего ранчо.
2. Транспортировать овец в лабораторию на 105 день ± 5 дней до 137 дней ± 5 дней гестационного возраста (dGA). Содержать овец при температуре 22 °C ± 1 °C при влажности окружающей среды. Обеспечьте гранулы люцерны (см. Таблицу материалов), соли и воду вволю.

2. Подготовка материала

1. Сконструировать периваскулярную катетерную систему.
   1. Присоедините один конец 4-футовой трубки Tygon к 2-сантиметровой трубке коллекторного насоса (MPT) (см. Таблицу материалов). Прикрепите другой конец 2-сантиметрового MPT к еще одной 4-футовой трубке Tygon.
   2. Сделайте небольшую щель в МФТ, чтобы жидкость/агенты могли выйти в периваскулярное пространство.
2. Стерилизуйте датчики потока (см. Таблицу материалов), катетеры и маленькую отвертку методом газовой стерилизации.

3. Предоперационная подготовка животных

1. Получите разрешение на проведение экспериментов на животных от Комитета по уходу за животными и их использованию.
2. Перед операцией содержать овец на корме nil per os (NPO) в течение 24 ч и NPO в воде в течение 16 ч. В день операции оберните лицо овцематки подушечкой, чтобы защитить глаза. Побрейте левую сторону шеи, чтобы обнажить яремную вену, и очистите кожу с помощью повидон-йода и 70% этанола.
   1. Поместите внутривенный (ВВ) катетер в яремную вену овцы и закрепите его на коже с помощью водонепроницаемой ленты и раневых зажимов (см. Таблицу материалов).
3. Обезболивайте овец внутривенным введением диазепама (0,15 мг/кг) и кетамина гидрохлорида (16 мг/кг). Вводят внутримышечную инъекцию суспензии прокаина пенициллина G (25 000 в/кг) и внутривенно кетопрофена (2,2 мг/кг) (см. таблицу материалов).
4. Побрейте место разреза овцы и прилегающие области (живот, бока и пах) ножницами #10. Чтобы убедиться, что шерсть полностью удалена, побрейте участок лезвием #40. Вымойте выбритый участок бактерицидным очищающим средством (см. Таблицу материалов) и водой. Высушите одноразовой салфеткой.
5. Подтвердите глубину анестезии (определяемую и поддерживаемую реакцией на защемление кожи, рефлекс роговицы и оценку тонуса челюсти), а затем интубируйте овцу эндотрахеальной трубкой с внутренним диаметром 6,5-7,5 мм (см. Таблицу материалов) и закрепите трубку на месте. Поместите овцу на подъемный стол в положении лежа на боку и переложите на хирургический стол с V-образным верхом в положении лежа на спине.
   1. Закрепите конечности овцематки на хирургическом столе с помощью хирургических креплений. Переведите овцу в положение Тренделенбурга, чтобы уменьшить давление на плодно-плацентарный отдел.
6. Прикрепите датчик пульсоксиметра (см. Таблицу материалов) к языку/уху овцы, чтобы постоянно контролировать насыщение оксигемоглобином и частоту сердечных сокращений. Поместите термометр под язык овцы, чтобы контролировать температуру.
   1. Подключите эндотрахеальную трубку к дыхательному контуру наркозного аппарата и начните искусственную вентиляцию легких, контролируя истекший уровень_СО2.
7. Поддерживайте анестезию, регулируя дозу изофлурана в пределах 2,5%-4% на протяжении всей операции. Убедитесь, что животное находится под адекватным наркозом, зажав ухо. Ввести сбалансированный полиионный (физиологический раствор 0,9% по массе) со скоростью 5 мл/кг/ч с помощью яремного катетера, установленного на этапе 3.2.1.
8. Выполните стерильный скраб. Опрыскать область живота и бока раствором повидона (10% раствор йода). Потрите область марлей, пропитанной йодом, начиная от места разреза и двигаясь наружу, следя за тем, чтобы не возвращаться к центру после скрабирования наружу.
   1. Затем опрыскайте участок этанолом (70% этанола с массой тела) и потрите марлей, пропитанной этанолом, аналогично скрабированию повидоном. Повторите весь процесс три раза. Опрыскайте участок раствором повидона.
9. Подогрейте физраствор в стерильной емкости и доведите его до 37 °C. Держите его рядом с операционным столом. Соедините прижигание (см. Таблицу материалов).
10. Попросите членов хирургической бригады одеться в шапочки, маски и бахилы, вымыть руки (хирургический скраб) и надеть стерилизованные хирургические халаты и перчатки. С этого момента необходимо соблюдать строгую стерильную хирургическую практику.
11. Простерилизованную область живота овцы накройте стерильными полотенцами.

4. Хирургическое вмешательство

1. Экстериоризация плода
   1. После обеспечения достаточной глубины анестезии выполните стандартный лапаротомический разрез длиной 10 см с помощью скальпеля (лезвие #20) по белой линии от пупка до черепной части вымени. Остановите кровотечение, сделав разрез с прижиганием (настройки мощности: 50 разрезов и 25 коагуляции).
      1. Сделайте небольшой разрез по средней линии стенки тела под разрезом кожи и вскройте брюшную полость ножницами Метценбаума (см. Таблицу материалов).
   2. Экстериоризируйте матку, содержащую плод, через брюшную стенку, подложив под нее стерильные хирургические полотенца (между брюшной полостью матери и маткой). Пальпируют матку для определения положения плода и семядолей. С помощью прижигания сделайте разрез ~10 см через стенку матки с большим изгибом над тыльной стороной головы, избегая видимых кровеносных сосудов и плацентомов.
   3. Используйте четыре зажима Бэбкока (см. Таблицу материалов), чтобы зафиксировать матку и плацентарные оболочки, и потяните зажимы Бэбкока за четыре противоположных угла, чтобы сделать головку плода видимой. Через этот разрез экстериоризируйте черепную половину плода и накройте голову плода стерильной безлатексной перчаткой, наполненной теплым стерильным физиологическим раствором (37 °C), чтобы предотвратить начало дыхания.
2. Инструментарий периваскулярного катетера сонной артерии
   1. При извлечении головки плода из матки попросите ассистента осторожно держать щипцы Бэбкока в вертикальном положении, чтобы свести к минимуму потерю околоплодных вод. При обнаженной шейке плода выполняют косой разрез кожи 3-3,5 см вдоль передней границы грудино-ключично-сосцевидной мышцы (СКМ) с одной стороны шеи в средней области и отделяют фасцию москитными щипцами.
      1. Разделяют платизму, и выполняют рассечение по медиальной границе СКМ мышцы от ее сухожилия сверху до уровня подъязычной мышцы снизу. Втягивание СКМ обнажит каротидный листок, который поверхностно содержит тонкостенную внутреннюю яремную вену, а под ней будет находиться сонная артерия в виде толстостенного сосуда.
      2. Втяните кожу с помощью зажимов Бэбкока и выполните тупое рассечение, чтобы освободить сонную артерию от окружающих тканей и сонной артерии.
   2. Извлеките из стерильной упаковки датчик расхода диаметром 3 мм (см. Таблицу материалов), отвинтите опорную пластину зонда и сдвиньте ее, чтобы обнажить L-образный кронштейн. Осторожно приподнимите сонную артерию и осторожно зацепите скобу под сосудом, избегая контакта с сосудом.
      1. С помощью щипцов закройте кронштейн датчика потока, осторожно сдвинув опорную пластину в закрытое положение. Закрепите кронштейн датчика расхода, затянув опорный винт датчика расхода. Чтобы облегчить этот процесс, осторожно возьмитесь щипцами за концы датчика потока, чтобы стабилизировать датчик потока во время затяжки винта.
   3. Предварительно промойте периваскулярный катетер и поместите его в непосредственной близости от сонной артерии проксимальнее датчика потока. Убедитесь, что открытый разрез периваскулярного катетера находится в непосредственной близости от сонной артерии.
      1. С помощью шелкового нерассасывающегося шва 3-0 закрепите проксимальный и дистальный концы периваскулярной системы и проточный зонд к близлежащей интерстициальной ткани. Закройте место разреза непрерывным швом, закройте кожу плода шелковым нерассасывающимся швом 3-0 и закрепите катетеры на коже, обернув шов вокруг катетера три раза. Снимите перчатку и поместите головку плода обратно в матку.
3. Катетеризация конечностей плода
   1. Экстериоризируйте заднюю ножку плода. Возьмитесь за ногу и поверните ее в сторону, чтобы визуализировать внутреннюю часть бедра. Очистите участок стерильной марлей, сделайте разрез 2 см и обнажите бедренную артерию. Поместите и закрепите датчик потока, выполнив процедуру, аналогичную той, что выполняется с сонной артерией, а затем закройте разрез.
   2. Сделайте разрез длиной 2 см вдоль медиальной поверхности большеберцовой кости ~0,5 см дистальнее колена. Обнажают заднюю большеберцовую артерию (толстостенную) и подкожную вену (тонкостенную). Введите поливиниловые катетеры (наружный диаметр: 1,4 мм и внутренний диаметр: 0,9 мм) в заднюю большеберцовую артерию и подкожную вену, используя стандартную технику разреза, как описано ниже:
      1. Освободите интересующий сосуд тупым рассечением. Перевязать дистальную часть сосуда шелковым швом 3-0 (без иглы) квадратным узлом с тремя бросками. Предварительно наложите вторую безшелковистую завязку на проксимальной стороне сосуда (под сосудом), но оставьте лигатуру незавязанной. Ножницами Кастровьехо (см. Таблицу материалов) сделайте небольшой поперечный надрез в сосуде на 2 мм проксимальнее дистальной лигатуры. Длина разреза должна составлять ~25% от диаметра сосуда.
      2. Ограничьте кровоток сосуда, осторожно потянув за проксимальный незавязанный шов. Наполните катетер стерильным гепаринизированным физиологическим раствором. Введите скошенный конец катетера и продвинуте наконечник на 20 см в сосуд плода.
      3. Удерживайте катетер на месте щипцами, пока ассистент завязывает проксимальный шелковый шов, чтобы зафиксировать сосуд на катетере; Полностью обвяжите сосуд вокруг введенного катетера с помощью квадратных узлов в 2 мм от места введения тремя бросками. Привяжите дистальную лигатуру проксимально к проксимальной связке, фиксирующей сосуд к катетеру.
   3. Закройте разрез кожи с помощью шелкового нерассасывающегося шва 3-0 с использованием непрерывного шовного рисунка. Убедитесь, что швы завязаны вокруг катетеров, чтобы избежать ограничения кровотока при растяжении. Поместите предварительно промытый катетер в матку и закрепите его на плоде с помощью нерассасывающегося шелкового шва 3-0.

5. Укладка плода обратно и закрытие раны

1. Верните плод в матку. Сшивают плодные оболочки с помощью 3-0 нерассасывающихся шелковых швов с непрерывным фиксирующим рисунком (по Цушингу). Закройте мышечный слой матки с помощью нерассасывающегося шелкового шва 3-0.
2. Введите хирургический стержень из нержавеющей стали 18 подкожно вдоль брюшной стенки до парареберной области. Дайте проксимальному концу стержня выйти из парареберного участка, выполнив разрез в 1 см.
   1. Прикрепите катетеры к дистальному концу хирургического стержня и попросите ассистента подать катетеры и продуть кабель зонда через место парареберного выхода, полностью протолкнув стержень через парареберное отверстие.
3. Закрепите все катетеры и кабели проточного зонда в месте парареберного разреза. Наложите водонепроницаемый скотч и пришите катетеры к коже овцы. Пришить пластиковый сетчатый мешочек к внешней стороне овцематки поверх катетеров и зонда для хранения катетеров.
   1. Используя монофиламентный синтетический рассасывающийся шовный материал 1-0, закрепите белую линию непрерывным рисунком. Закрепите слой кожи хирургическими скобами.
4. Прекратите общую анестезию и экстубируйте овцу, как только гортанные рефлексы вернутся к нормальному исходному уровню. Не оставляйте животное без присмотра до тех пор, пока оно не придет в полное сознание. Переместите овцу в метаболическую тележку, как только она станет стабильной после общей анестезии. Верните животное в комнату послеоперационного эксперимента после полного восстановления после наркоза.
5. Вводят послеоперационные анальгетики внутривенно (10 мг/кг/сут фенилбутазон) в течение 3 дней. Ежедневно промывать сосудистые катетеры гепаринизированным физиологическим раствором (100 ЕД/мл гепарина в 0,9% растворе NaCl).

6. Послеоперационные эксперименты in vivo

1. Ежедневно промывайте катетеры гепаринизированным физиологическим раствором (75 ЕД/мл). Подождите 72 часа, прежде чем делать какие-либо измерения. Чтобы измерить кровоток, подключите датчики потока, введенные в плод с модулем периваскулярного потока, к PowerLab и подключенному компьютеру.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Запись может быть сделана в программном обеспечении PowerLab (см. Таблицу материалов) для измерения кровотока в сонной и бедренной артериях. Проводите базовое измерение в течение 30 минут.
2. Прикрепите артериальный и амниотический катетеры к мостовидному усилителю, подключенному к аналого-цифровому преобразователю (см. таблицу материалов). Внутривенно ввести плоду болюс объемом 1 мл 10 мкМ фенилэфрина и измерять сонный и бедренный кровоток в течение 15 минут. Затем подождите 30 минут или пока кровоток не вернется к исходному уровню.
3. Влить 1 мл 10 мкМ фенилэфрина в периваскулярный катетер и измерять кровоток в течение 15 минут. Смойте фенилэфрин, введя 5 мл теплого физиологического раствора через периваскулярный катетер. Затем подождите 30 минут или пока кровоток не вернется к исходному уровню.

Результаты

Для изучения локализованных манипуляций с кровотоком in vivo в периваскулярное пространство сонной артерии с помощью экстериоризованного инфузионного катетера вводили 1 мл фенилэфрина (10 мкМ), агониста_α 1-AR, чтобы определить влияние на местный сонный кровоток и влияние на сист?...

Обсуждение

В настоящее время не существует метода изучения сократимости и дилатации сосудов in vivo в ответ на лекарственные соединения и манипуляции с генами. В качестве стандарта в этой области кровоток in vivo измеряется с помощью допплеровских датчиков, микросфер и радиоактивных молекул,...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aaron Bovie Electrosurgical Cautery	Henry Schein, Inc	5905974
Aaron Bovie Electrosurgical Generator	Henry Schein, Inc	1229913
Alfalfa Pellets	Sacate Pellet Mills, Inc. Maricopa AZ	100-80
Analog to Digital Converter	ADI Instruments	Powerlab
Babcock forceps	Roboz Surgicals	RS8020
Bridge Amplifier	ADI Instruments	Bridge Amplifier
Castroviejo scissors	Roboz Surgicals	RS5650SC
Diazepam	Henry Schein, Inc	1278188
Endotracheal Tube	Henry Schein, Inc	7020408
Flow Probes	Transonic Systems Inc.	MC2PSS-JS-WC100-CRS10-GC, MC3PSS-LS-WC100-CRS10-GC
Heparin	Henry Schein, Inc	1162406
Isoflurane	Henry Schein, Inc	1182097
Ketamine	Henry Schein, Inc	1273383
Ketoprofen	Zoetis Inc., Kalamazoo, MI	Ketofen
Manifold Pump Tubing	Fisher Scientific	14-190-508
Metzenbaum scissors	Roboz Surgicals	RS6010
Narkomed 4 Anesthesia Machine	North American Dräger	Narkomed 4
Normal Saline	Fisher Scientific	Z1376
penicillin G procaine suspension	Henry Schein, Inc	7455874
phenylbutazone	VetOne Boise, ID	510226
Phenylephrine	Sigma Aldrich Inc.	P1240000
Pivodine Scrub	VetOne	510094	Germicidal cleanser
PowerLab	ADInstruments		Data acquisition hardware device
Pulse Oximeter	Amazon Inc.	UT100V
Tygon Tubing	Fisher Scientific	ND-100-80
V-Top Surgical Table	VetLine Veterinary Classic Surgery	TSP-4010
Wound Clips	Fisher Scientific	10-001-024