In vivo Küçükbaş Fetüste Karotis Kan Akışı Üzerindeki İlaç Etkilerinin Gerçek Zamanlı Çalışması

Özet

Bu protokol, in utero gelişmekte olan bir fetüste perivasküler olarak ilaç ve gen ekspresyon modifiye edici ajanların verilmesi için bir yöntemi tanımlamaktadır. Daha da önemlisi, ilaçların/ajanların kan akışı üzerindeki etkisi gebeliğin ilerlemesi ile ölçülebilir.

Özet

Bir organizmanın sistemik kan basıncındaki (BP) ani dalgalanmalara yanıt olarak beyne sabit bir kan akışını sürdürme yeteneği, karotis arterde meydana gelen serebral otoregülasyon (CAR) olarak bilinir. Tam süreli yenidoğanların aksine, preterm yenidoğanlar artmış sistemik BP'ye yanıt olarak serebral kan akışını (CBF) azaltamazlar. Preterm yenidoğanlarda bu, kırılgan serebral damarları yüksek perfüzyon basınçlarına maruz bırakarak yırtılmalarına ve beyin hasarına yol açar. Tel miyografi kullanılarak yapılan ex vivo çalışmalar, yakın dönem fetüslerden alınan karotis arterlerin adrenerjik alfa1 reseptörlerinin aktivasyonuna yanıt olarak daraldığını göstermiştir. Bu yanıt preterm fetüste körelir. Bu nedenle, alfa1-AR'nin in vivo rolünü incelemek, burada sunulan, gebeliğin gelişimsel ilerlemesi sırasında ilaçların in vivo bir karotis arter segmenti üzerindeki etkilerini belirlemek için yenilikçi bir yaklaşımdır. Sunulan veriler, fetal kan akışının ve kan basıncının aynı anda ölçüldüğünü göstermektedir. Perivasküler dağıtım sistemi, birkaç gün boyunca uzun süreli bir çalışma yapmak için kullanılabilir. Bu yöntem için ek uygulamalar, karotis arterin bir segmentindeki genlerin ekspresyonunu değiştirmek için viral dağıtım sistemlerini içerebilir. Bu yöntemler, yetişkin organizmaların yanı sıra uteroda büyüyen organizmadaki diğer kan damarlarına da uygulanabilir.

Giriş

Doğum, fetüste strese neden olur ve ana stres hormonu^{olan katekolamin} seviyelerinde önemli bir artış olur ^1,2. Bu, sistemik kan basıncını yükseltir ve bu basınç karotis arterler yoluyla kırılgan beyin kılcal damarlarına iletilirse, bu onların yırtılmasına yol açabilir ^3,4,5. Sistemik BP'deki dalgalanmaların, tam süreli fetüste karotis arterlerin daralması ile beyne ulaşması engellenir. Bununla birlikte, bu mekanizma preterm fetüste gelişmemiştir ve bu, preterm fetüslerde beyin hasarı olasılığının önemli ölçüde daha yüksek olmasından sorumludur ^4,5.

Şu anda, gelişmekte olan fetüslerle karotis kan akışını düzenlemede yer alan yolların olgunlaşmasını incelemek için uygun bir yöntem yoktur. Karotis kan akımı ve vazosensitivite üzerine yapılan bu çalışmalar hem temel bilim hem de klinik açıdan çok önemlidir. Günümüzde, arteriyel kontraktilitenin düzenlenmesinde rol oynayan moleküler yolakları belirlemek için standart yöntem, postmortem arter segmentlerinin izole edilmesini içermektedir. Daha sonra, arteriyel kontraktilitede yer alan düzenleyici yolları tanımlayan farklı farmakolojik moleküllerin vazokontraktilitesini belirlemek için tel miyografi kullanılarak deneyler yapılır ^6,7. Dikkat çekici bir şekilde, ex vivo bulgular, karotis arterin yukarı ve aşağı akışındaki kan akışı regülasyonu nedeniyle in vivo ortamı tam olarak kopyalayamıyor. Bu nedenle, bu çalışma, vazosensitif kimyasalların veya ajanların bir arterdeki kan akışı üzerindeki etkilerini in vivo olarak belirleyebilecek bir teknik geliştirmeyi amaçlamıştır.

Bu makalede açıklanan perivasküler dağıtım metodolojisi, sinyal yolaklarının farmakolojik veya genetik manipülasyonunun farklı arteriyel segmentler üzerindeki etkisini incelemek için in vivo bir yaklaşım sağlar. Bu yöntemi kullanarak, fetal kan basıncını ve karotis kan akışını manipüle edebilirsiniz. Ek olarak, gelişmekte olan bir fetüste sinyal moleküllerinin etkilerini incelemek için koyun fetüsleri ile yapılan deneyler gösterilmiştir. Umarım, sağlanan ayrıntılı metodoloji, özellikle fetal fizyoloji ve patoloji ile ilgili olarak kan akışı çalışmaları alanında yeni araştırmalara yol açacaktır.

Protokol

Bu çalışma için Arizona Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nden hayvan deneyleri için onay alınmıştır. Bu çalışma için 2-4 yaşları arasında bir kez çiftleşmiş, gebe Columbia-Rambouillet koyunları kullanıldı. Hayvanlar Arizona Üniversitesi Koyun Birimi'nden elde edildi.

1. Hayvan bakımı

1. Herhangi bir koyun çiftliğinden hayvanlar alın.
2. Koyunları 5 gün ± 137 gün ± 5 günlük gebelik yaşı (dGA) ile 105 gün arasında laboratuvara taşıyın. Koyunları ortam neminde 22 °C ± 1 °C sıcaklıkta muhafaza edin. Yonca peletleri (Malzeme Tablosuna bakınız), tuzlar ve su ad libitum sağlayın.

2. Malzeme hazırlığı

1. Perivasküler kateter sistemini oluşturun.
   1. 4 ft'lik Tygon hortumunun bir ucunu 2 cm'lik bir manifold pompa borusuna (MPT) birleştirin ( Malzeme Tablosuna bakın). 2 cm'lik MPT'nin diğer ucunu başka bir 4 ft Tygon tüpüne takın.
   2. MPT'de küçük bir yarık açın, böylece sıvı / ajanlar perivasküler boşluğa çıkabilir.
2. Gaz sterilizasyon yöntemini kullanarak akış problarını (bkz. Malzeme Tablosu), kateterleri ve küçük bir tornavidayı sterilize edin.

3. Ameliyat öncesi hayvan hazırlığı

1. Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nden hayvan deneyleri için onay alın.
2. Ameliyattan önce, koyunları 24 saat boyunca sıfır ( NPO) yem ve 16 saat NPO su ile tutun. Ameliyat günü, gözlerini korumak için koyunun yüzünü bir ped ile sarın. Şah damarını ortaya çıkarmak için boynun sol tarafını tıraş edin ve cildi povidon-iyot ve% 70 etanol kullanarak temizleyin.
   1. Koyunun juguler venine intravenöz (IV) bir kateter yerleştirin ve su geçirmez bant ve yara klipsleri ile cilde sabitleyin (bkz.
3. Koyunları IV diazepam (0.15 mg / kg) ve ketamin hidroklorür (16 mg / kg) uygulaması ile uyuşturun. Penisilin G prokain süspansiyonu (25.000 I / kg) ve IV ketoprofen (2.2 mg / kg) IM enjeksiyonu uygulayın (bkz.
4. Koyunların kesi bölgesini ve çevresini (karın, yanlar ve kasık) #10 bıçak makası ile tıraş edin. Yünün tamamen çıkarıldığından emin olmak için, alanı #40 bıçakla yeniden tıraş edin. Tıraşlı bölgeyi mikrop öldürücü bir temizleyici (Malzeme Tablosuna bakınız) ve su ile yıkayın. Tek kullanımlık bir ped ile kurulayın.
5. Anestezi derinliğini onaylayın (cilt sıkışması, kornea refleksi ve çene tonusunun değerlendirilmesine yanıt olarak belirlenir ve sürdürülür) ve ardından koyunu 6.5-7.5 mm iç çaplı bir endotrakeal tüp ile entübe edin (bkz. Koyunu yanal yaslanmış pozisyonda bir kaldırma masasına yerleştirin ve sırtüstü pozisyonda bir V-top ameliyat masasına aktarın.
   1. Koyunun uzuvlarını cerrahi bağlamalarla V üstü ameliyat masasına sabitleyin. Fetal plasental ünite üzerindeki baskıyı hafifletmek için koyunu Trendelenburg pozisyonuna getirin.
6. Oksihemoglobin doygunluğunu ve kalp atış hızını sürekli olarak izlemek için koyunun diline/kulağına bir nabız oksimetresi probu ( Malzeme Tablosuna bakın) takın. Sıcaklığı izlemek için koyunun dilinin altına bir termometre yerleştirin.
   1. Endotrakeal tüpü anestezi makinesinin solunum devresine bağlayın ve süresi dolmuş CO_2'yi izlerken mekanik ventilasyonu başlatın.
7. Ameliyat boyunca izofluranı %2,5-%4 arasında ayarlayarak anesteziyi koruyun. Kulağı sıkıştırarak hayvanın yeterince uyuşturulduğundan emin olun. Adım 3.2.1 sırasında yerleştirilen juguler kateteri kullanarak 5 mL/kg/s'de dengeli bir poli-iyonik (salin% 0.9 a/h) solüsyon uygulayın.
8. Steril bir fırçalama yapın. Karın bölgesine ve yanlara povidon çözeltisi (% 10 iyot çözeltisi) püskürtün. Kesi bölgesinden başlayarak ve dışa doğru çalışarak bölgeyi iyotla ıslatılmış bir gazlı bezle ovalayın, dışa doğru fırçaladıktan sonra merkeze geri dönmemeye dikkat edin.
   1. Ardından, bölgeye etanol püskürtün (% 70 etanol w / v) ve etanole batırılmış bir gazlı bezle povidon ile ovmaya benzer şekilde ovalayın. Tüm işlemi üç kez tekrarlayın. Bölgeye povidon çözeltisi püskürtün.
9. Tuzlu suyu steril bir kapta ısıtın ve 37 °C'ye getirin. Bunu ameliyat masasının yakınında tutun. Koteri bağlayın (Malzeme Tablosuna bakın).
10. Cerrahi ekip üyelerinin şapka, yüz maskesi ve galoş giymelerini, ellerini yıkamalarını (cerrahi fırçalama) ve sterilize edilmiş cerrahi önlük ve eldiven giymelerini sağlayın. Bu noktadan itibaren sıkı bir steril cerrahi uygulama izlenmelidir.
11. Sterilize edilmiş koyunların karın bölgesini steril havlularla örtün.

4. Cerrahi prosedür

1. Fetüsün dışsallaştırılması
   1. Yeterli anestezi derinliğini sağladıktan sonra, göbekten memenin kraniyal kısmına kadar linea alba üzerinde bir neşter (#20 bıçak) kullanarak 10 cm'lik standart bir laparotomi kesisi yapın. Koter ile kesi yaparken kanamayı kontrol edin (güç ayarları: 50 kesi ve 25 pıhtılaşma).
      1. Cilt kesisinin altındaki vücut duvarının orta hattından küçük bir kesi yapın ve Metzenbaum makası kullanarak karın boşluğunu açın (bkz.
   2. Altına (maternal karnı ile uterus arasına) steril cerrahi havlular yerleştirirken fetüsü içeren uterusu karın duvarından dışarı çıkarın. Fetal pozisyonu ve kotiledonları belirlemek için uterusu palpe edin. Bir koter kullanarak, görünür kan damarlarından ve plasentamlardan kaçınarak, başın sırtı üzerinde büyük bir eğrilik ile uterus duvarından ~ 10 cm'lik bir kesi yapın.
   3. Rahim ve plasenta zarlarını sabitlemek için dört Babcock kelepçesi kullanın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve fetal başı görünür hale getirmek için Babcock kelepçelerini dört zıt köşeden çekin. Bu kesiden fetüsün kafatası yarısını dıştan çıkarın ve solunumun başlamasını önlemek için fetal başını ılık, steril salin (37 °C) ile doldurulmuş steril, lateks olmayan bir eldivenle örtün.
2. Karotis arter perivasküler kateterinin enstrümantasyonu
   1. Fetal başı uterustan çıkarırken, amniyotik sıvı kaybını en aza indirmek için bir asistanın Babcock forsepslerini hafifçe dik tutmasını sağlayın. Fetüsün boynu açıktayken, orta bölgede boynun bir tarafındaki sternokleidomastoid (SCM) kasının ön sınırı boyunca 3-3,5 cm'lik eğik bir cilt kesisi yapın ve fasyayı sivrisinek forseps ile ayırın.
      1. Platizmayı bölün ve SCM kasının medial sınırı boyunca tendonundan aşağı omohyoid kas seviyesine kadar bir diseksiyon yapın. SCM'nin geri çekilmesi, yüzeysel olarak ince duvarlı bir iç juguler ven içeren karotis tabakasını ortaya çıkaracak ve altında kalın duvarlı bir damar olarak karotis arter olacaktır.
      2. Cildi Babcock kelepçeleriyle geri çekin ve karotis arteri çevreleyen dokudan ve karotis tabakasından kurtarmak için künt bir diseksiyon yapın.
   2. 3 mm'lik akış probunu ( Malzeme Tablosuna bakın) steril paketten alın, probun destek plakasını sökün ve L braketini ortaya çıkarmak için kaydırarak açın. Karotis arteri dikkatlice kaldırın ve damarla temastan kaçınırken braketi damarın altına hafifçe asın.
      1. Destek plakasını yavaşça kapalı bir konuma kaydırarak akış probu braketini kapatmak için forseps kullanın. Akış probunun destek vidasını sıkarak akış probu braketini sabitleyin. Bu işlemi kolaylaştırmak için, vida sıkılırken akış probunu stabilize etmek için akış probunun uçlarını forseps ile hafifçe kavrayın.
   3. Perivasküler kateteri önceden yıkayın ve akış probunun proksimalindeki karotis arterin yakın çevresine yerleştirin. Perivasküler kateterin açık yarığının karotis artere yakın olduğundan emin olun.
      1. 3-0 ipek emilmeyen sütür ile perivasküler sistemin proksimal ve distal uçlarını ve akış probunu yakındaki interstisyel dokuya sabitleyin. Kesi bölgesini sürekli bir dikiş kullanarak kapatın, fetal cildi 3-0 ipek emilmeyen bir sütür ile kapatın ve sütürü kateterin etrafına üç kez sararak kateterleri cilde sabitleyin. Eldiveni çıkarın ve fetal kafayı uterusa geri yerleştirin.
3. Fetal ekstremite kateterizasyonu
   1. Fetüsün arka ayağını dışsallaştırın. Bacağınızı tutun ve iç uyluk bölgesini görselleştirmek için yana doğru çevirin. Alanı steril gazlı bezle temizleyin, 2 cm'lik bir kesi yapın ve femoral arteri açığa çıkarın. Karotis ile yapılana benzer bir prosedür izleyerek akış probunu yerleştirin ve sabitleyin ve ardından insizyonu kapatın.
   2. Tibianın medial yönü boyunca diz ~ 0.5 cm distalinde 2 cm'lik bir kesi yapın. Posterior tibial arteri (kalın duvarlı) ve safen veni (ince duvarlı) ortaya çıkarın. Polivinil kateterleri (dış çap: 1,4 mm ve iç çap: 0,9 mm) posterior tibial artere ve safen venine aşağıda belirtildiği gibi standart bir kesme tekniği kullanarak yerleştirin:
      1. Künt diseksiyon ile ilgilenilen gemiyi serbest bırakın. Damarın distal kısmını 3-0 ipek dikişle (iğnesiz) üç atışlı kare bir düğüm kullanarak bağlayın. Damarın proksimal yönüne (damarın altına) ikinci bir ipeksiz kravat yerleştirin, ancak bağı çözülmemiş halde bırakın. Castroviejo makası kullanarak (Malzeme Tablosuna bakınız), damarda distal ligatüre 2 mm proksimalde küçük, enine bir kesim yapın. Kesimin uzunluğu, kap çapının ~%25'i kadar olmalıdır.
      2. Yakın, bağlanmamış dikişi hafifçe yukarı çekerek damar kan akışını kısıtlayın. Kateteri steril heparinize salin ile doldurun. Kateterin eğimli ucunu yerleştirin ve ucu fetal damarın içine 20 cm ilerletin.
      3. Bir asistan damarı katetere sabitlemek için proksimal ipek serbest kravat sütürünü bağlarken kateteri forseps ile yerinde tutun; Yerleştirme bölgesinden 2 mm uzakta kare düğümler kullanarak damarı takılan kateterin etrafına tamamen bağlayın. Distal ligatürü proksimal, damarı katetere sabitleyen proksimal bağa bağlayın.
   3. Cilt kesisini 3-0 ipek emilmeyen sütür kullanarak sürekli dikiş deseni kullanarak kapatın. Çekildiğinde kan akışını kısıtlamamak için dikişlerin kateterlerin etrafına bağlandığından emin olun. Uterusa önceden yıkanmış bir kateter yerleştirin ve 3-0 emilmeyen ipek sütür kullanarak bir dikişle fetüse sabitleyin.

5. Fetüsün geri yerleştirilmesi ve yaranın kapatılması

1. Fetusu uterusa geri getirin. Fetal membranları 3-0 emilmeyen ipek sütürler kullanarak sürekli kilitleme (Cushing) deseni ile dikin. 3-0 emilmeyen ipek sütür kullanarak uterus kas tabakasını kapatın.
2. Karın duvarı boyunca parakostal bölgeye kadar deri altından 18 inç paslanmaz çelik cerrahi çubuk yerleştirin. Çubuğun proksimal ucunun 1 cm'lik bir kesi yaparak parakostal bölgeden çıkmasına izin verin.
   1. Kateterleri cerrahi çubuğun distal ucuna takın ve bir asistanın kateterleri beslemesini ve çubuğu parakostal açıklıktan tamamen iterek probu kablosunu parakostal çıkış bölgesinden geçirmesini sağlayın.
3. Tüm kateterleri ve akış probu kablolarını parakostal insizyon bölgesinde sabitleyin. Su geçirmez bantla yerleştirin ve kateterleri koyun derisine dikin. Kateterlerin üzerine koyunun dışına plastik bir ağ kese dikin ve kateterleri saklamak için sondalayın.
   1. 1-0 monofilament sentetik emilebilir sütür materyali kullanarak, linea alba'yı kesintisiz bir desenle sabitleyin. Cilt tabakasını cerrahi zımbalarla sabitleyin.
4. Genel anesteziyi durdurun ve laringeal refleksler normal taban çizgisine döndüğünde koyunu ekstübe edin. Tam bilinci yerine gelene kadar hayvanı gözetimsiz bırakmayın. Genel anesteziyi takiben stabil hale geldiğinde koyunu metabolik arabaya taşıyın. Anesteziden tamamen iyileştikten sonra hayvanı ameliyat sonrası deney odasına geri koyun.
5. Ameliyat sonrası analjezikleri 3 gün boyunca intravenöz olarak (10 mg / kg / gün fenilbutazon) uygulayın. Vasküler kateterleri her gün heparinize salin solüsyonu (%0.9 NaCl solüsyonunda 100 U/mL heparin) ile yıkayın.

6. Ameliyat sonrası in vivo deneyler

1. Kateterleri her gün heparinize salin (75 U/ml) ile yıkayın. Herhangi bir ölçüm yapmadan önce 72 saat bekleyin. Kan akışını ölçmek için, perivasküler akış modülü ile fetüse yerleştirilen akış problarını PowerLab'a ve bağlı bir bilgisayara takın.
   NOT: Kayıtlar, karotis ve femur kan akışını ölçmek için PowerLab yazılımında (Malzeme Tablosuna bakın) yapılabilir. 30 dakika boyunca taban çizgisi ölçümünü yapın.
2. Arteriyel ve amniyotik kateterleri, analogdan dijitale dönüştürücüye bağlı köprü amplifikatörüne takın (bkz. Fetüse intravenöz olarak 1 mL bolus 10 uM fenilefrin uygulayın ve 15 dakika boyunca karotis ve femoral akışı ölçün. Ardından, 30 dakika veya kan akışı taban çizgisine dönene kadar bekleyin.
3. Perivasküler katetere 1 mL 10 uM fenilefrin infüze edin ve 15 dakika boyunca kan akışını ölçün. Perivasküler kateterden 5 mL ılık salin uygulayarak fenilefrini yıkayın. Ardından, 30 dakika veya kan akışı taban çizgisine dönene kadar bekleyin.

Sonuçlar

Kan akımının lokalize in vivo manipülasyonunu incelemek için, bir α_1-AR agonisti olan 1 mL fenilefrin (10 μM), lokal karotis kan akımı üzerindeki etkisini ve sistemik kan basıncı üzerindeki etkisini belirlemek için eksternal bir infüzyon kateteri ile karotis arterin perivasküler boşluğuna uygulandı. Şekil 1A , yakın dönem fetal koyunlarda sistemik kan basıncı üzerinde herhangi bir etkisi olmaksızın karotis kan akışında önemli bir azalma oldu...

Tartışmalar

Şu anda, ilaç bileşiklerine ve gen manipülasyonuna yanıt olarak in vivo olarak damar kontraktilitesini ve dilatasyonunu incelemek için hiçbir yöntem yoktur. Sahada standart olarak, in vivo kan akışı, Doppler akış probları, mikro küreler ve tritiye su gibi radyoaktif moleküller ile ölçülür. Bununla birlikte, reseptörlerin işlevlerini veya aşağı akış sinyalizasyonunu manipüle etmek için hayvanlar kurban edilir ve arteriyel segmentlerin izolasyonunu takiben organ banyolarında ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aaron Bovie Electrosurgical Cautery	Henry Schein, Inc	5905974
Aaron Bovie Electrosurgical Generator	Henry Schein, Inc	1229913
Alfalfa Pellets	Sacate Pellet Mills, Inc. Maricopa AZ	100-80
Analog to Digital Converter	ADI Instruments	Powerlab
Babcock forceps	Roboz Surgicals	RS8020
Bridge Amplifier	ADI Instruments	Bridge Amplifier
Castroviejo scissors	Roboz Surgicals	RS5650SC
Diazepam	Henry Schein, Inc	1278188
Endotracheal Tube	Henry Schein, Inc	7020408
Flow Probes	Transonic Systems Inc.	MC2PSS-JS-WC100-CRS10-GC, MC3PSS-LS-WC100-CRS10-GC
Heparin	Henry Schein, Inc	1162406
Isoflurane	Henry Schein, Inc	1182097
Ketamine	Henry Schein, Inc	1273383
Ketoprofen	Zoetis Inc., Kalamazoo, MI	Ketofen
Manifold Pump Tubing	Fisher Scientific	14-190-508
Metzenbaum scissors	Roboz Surgicals	RS6010
Narkomed 4 Anesthesia Machine	North American Dräger	Narkomed 4
Normal Saline	Fisher Scientific	Z1376
penicillin G procaine suspension	Henry Schein, Inc	7455874
phenylbutazone	VetOne Boise, ID	510226
Phenylephrine	Sigma Aldrich Inc.	P1240000
Pivodine Scrub	VetOne	510094	Germicidal cleanser
PowerLab	ADInstruments		Data acquisition hardware device
Pulse Oximeter	Amazon Inc.	UT100V
Tygon Tubing	Fisher Scientific	ND-100-80
V-Top Surgical Table	VetLine Veterinary Classic Surgery	TSP-4010
Wound Clips	Fisher Scientific	10-001-024