In vivo Estudo em Tempo Real dos Efeitos de Drogas no Fluxo Sanguíneo Carotídeo no Feto Ovino

Resumo

O presente protocolo descreve um método para administrar drogas e agentes modificadores da expressão gênica perivascularmente em um feto em desenvolvimento intra-utero . É importante ressaltar que o efeito de drogas/agentes sobre o fluxo sanguíneo pode ser medido com a progressão da gravidez.

Resumo

A capacidade de um organismo de manter um fluxo sanguíneo constante para o cérebro em resposta a picos súbitos de pressão arterial sistêmica (PA) é conhecida como autoregulação cerebral (RCA), que ocorre na artéria carótida. Ao contrário dos recém-nascidos a termo, os prematuros são incapazes de reduzir o fluxo sanguíneo cerebral (FSC) em resposta ao aumento da PA sistêmica. Em neonatos prematuros, isso expõe os frágeis vasos cerebrais a altas pressões de perfusão, levando à sua ruptura e dano cerebral. Estudos ex vivo usando miografia com fio demonstraram que as artérias carótidas de fetos próximos ao termo se contraem em resposta à ativação de receptores alfa1 adrenérgicos. Essa resposta é atenuada no feto prematuro. Assim, para examinar o papel da alfa1-RA in vivo, apresenta-se aqui uma abordagem inovadora para determinar os efeitos de drogas em um segmento arterial carotídeo in vivo em um feto ovino durante a progressão do desenvolvimento da gestação. Os dados apresentados demonstram a mensuração simultânea do fluxo sanguíneo fetal e da pressão arterial. O sistema de liberação perivascular pode ser usado para realizar um estudo de longo prazo durante vários dias. Aplicações adicionais para este método poderiam incluir sistemas de liberação viral para alterar a expressão de genes em um segmento da artéria carótida. Estes métodos podem ser aplicados a outros vasos sanguíneos no organismo em crescimento no útero , bem como em organismos adultos.

Introdução

O nascimento causa estresse ao feto, e há um aumento considerável nos níveis de catecolaminas, o principal hormônio do estresse ^1,2. Isso eleva a PA sistêmica e, se essa pressão for transmitida aos frágeis capilares cerebrais através das artérias carótidas, pode levar à sua ruptura ^3,4,5. Surtos na PA sistêmica são impedidos de atingir o cérebro pela constrição das artérias carótidas no feto a termo. Entretanto, esse mecanismo não está desenvolvido no feto prematuro, sendo responsável pela probabilidade significativamente maior de lesão cerebral em fetos prematuros ^4,5.

Atualmente, não existe um método adequado para examinar a maturação das vias envolvidas na regulação do fluxo sanguíneo carotídeo em fetos em desenvolvimento. Esses estudos sobre fluxo sanguíneo carotídeo e vasorresponsividade são cruciais tanto do ponto de vista científico quanto clínico. Atualmente, para determinar as vias moleculares envolvidas na regulação da contratilidade arterial, o método padrão envolve o isolamento dos segmentos arteriais post-mortem. Em seguida, os experimentos são conduzidos por meio de miografia com fio para determinar a vasocontratilidade de diferentes moléculas farmacológicas que definem as vias regulatórias envolvidas na contratilidade arterial ^6,7. É importante notar que os achados ex vivo não são capazes de replicar totalmente o ambiente in vivo devido à regulação do fluxo sanguíneo a montante e a jusante da artéria carótida. Assim, o presente estudo teve como objetivo desenvolver uma técnica que possa determinar os efeitos de substâncias químicas ou agentes vasorresponsivos sobre o fluxo sanguíneo em uma artéria in vivo.

A metodologia de liberação perivascular descrita neste artigo fornece uma abordagem in vivo para estudar o efeito da manipulação farmacológica ou genética de vias de sinalização em diferentes segmentos arteriais. Usando este método, pode-se manipular a pressão arterial fetal e o fluxo sanguíneo carotídeo. Adicionalmente, experimentos com fetos ovinos são demonstrados para estudar os efeitos de moléculas sinalizadoras em um feto em desenvolvimento. Espera-se que a metodologia detalhada fornecida leve a novas investigações no campo dos estudos do fluxo sanguíneo, especialmente em relação à fisiologia e patologia fetal.

Protocolo

Para o presente estudo, a aprovação para os experimentos com animais foi obtida do Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Arizona. Foram utilizadas ovelhas Columbia-Rambouillet, gestantes com idade entre 2 e 4 anos de idade, acasaladas temporalmente. Os animais foram obtidos da Unidade de Ovinos da Universidade do Arizona.

1. Manutenção de animais

1. Obter animais de qualquer fazenda de ovelhas.
2. Transportar as ovelhas para o laboratório aos 105 dias ± 5 dias a 137 dias ± 5 dias de idade gestacional (dGA). Manter os ovinos a uma temperatura de 22 °C ± 1 °C em humidade ambiente. Forneça pellets de alfafa (consulte Tabela de Materiais), sais e água ad libitum.

2. Preparação do material

1. Construir o sistema de cateteres perivasculares.
   1. Junte uma extremidade de 4 pés de tubulação Tygon a um tubo de bomba coletora (MPT) de 2 cm (consulte a Tabela de Materiais). Conecte a outra extremidade do MPT de 2 cm a outro tubo Tygon de 4 pés.
   2. Faça uma pequena fenda no TMF para que o líquido/agentes possam sair para o espaço perivascular.
2. Esterilize as sondas de fluxo (ver Tabela de Materiais), cateteres e uma pequena chave de fenda usando o método de esterilização de gás.

3. Preparo pré-cirúrgico do animal

1. Obter aprovação para experimentação animal do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais.
2. Antes da cirurgia, manter as ovelhas em ração zero per os (NPO) por 24 h e água NPO por 16 h. No dia da cirurgia, envolva o rosto da ovelha com um absorvente para proteger os olhos. Raspar o lado esquerdo do pescoço para expor a veia jugular e limpar a pele com iodopovidona e etanol 70%.
   1. Coloque um cateter intravenoso (IV) na veia jugular da ovelha e fixe-o à pele com fita adesiva impermeável e clipes da ferida (ver Tabela de Materiais).
3. Anestesiar as ovelhas com administração IV de diazepam (0,15 mg/kg) e cloridrato de cetamina (16 mg/kg). Administrar uma injeção IM de penicilina G procaína suspensão (25.000 I/kg) e cetoprofeno IV (2,2 mg/kg) (ver Tabela de Materiais).
4. Faça a barba no local da incisão da ovelha e nas áreas circundantes (abdômen, flancos e virilha) com cortadores de lâmina #10. Para garantir que a lã seja completamente removida, raspe a área com uma lâmina #40. Lave a área raspada com um limpador germicida (ver Tabela de Materiais) e água. Seque com uma almofada descartável.
5. Confirme a profundidade da anestesia (determinada e mantida pela resposta ao pinçamento cutâneo, reflexo corneano e avaliação do tônus mandibular) e, em seguida, intube a ovelha com um tubo endotraqueal de 6,5-7,5 mm de diâmetro interno (ver Tabela de Materiais) e fixe o tubo no lugar. Coloque a ovelha em uma mesa de elevação na posição lateral recumbente e transfira para uma mesa cirúrgica V-top na posição supina.
   1. Fixe os membros da ovelha à mesa cirúrgica V-top com amarrações cirúrgicas. Traga a ovelha para a posição de Trendelenburg para aliviar a pressão sobre a unidade feto-placentária.
6. Anexe uma sonda de oxímetro de pulso (ver Tabela de Materiais) à língua/ouvido da ovelha para monitorizar continuamente a saturação da oxihemoglobina e a frequência cardíaca. Coloque um termômetro sob a língua da ovelha para monitorar a temperatura.
   1. Conecte o tubo endotraqueal ao circuito respiratório do aparelho de anestesia e inicie a ventilação mecânica enquanto monitora o CO₂ expirado.
7. Manter a anestesia ajustando o isoflurano entre 2,5%-4% durante toda a cirurgia. Certifique-se de que o animal está adequadamente anestesiado, apertando a orelha. Administrar uma solução poli-iónica balanceada (solução salina a 0,9% p/v) a 5 ml/kg/h utilizando o cateter jugular colocado durante o passo 3.2.1.
8. Realizar uma esfoliação estéril. Borrifar a área abdominal e os flancos com solução de povidona (solução de iodo a 10%). Esfregue a área com uma gaze embebida em iodo a partir do local da incisão e trabalhando para fora, certificando-se de não voltar ao centro depois de esfregar para fora.
   1. Em seguida, borrife a área com etanol (etanol 70% p/v) e esfregue com gaze embebida em etanol de forma semelhante à lavagem com povidona. Repita todo o processo três vezes. Borrife a área com solução de povidona.
9. Aqueça o soro fisiológico em um recipiente estéril e leve a 37 °C. Mantenha-o próximo à mesa cirúrgica. Conecte o cautério (ver Tabela de Materiais).
10. Peça aos membros da equipe cirúrgica que se vistam com bonés, máscaras faciais e capas de sapato, lavem as mãos (esfoliação cirúrgica) e coloquem aventais e luvas cirúrgicas esterilizadas. A partir daí, uma prática cirúrgica estéril rigorosa deve ser seguida.
11. Drape a área abdominal da ovelha esterilizada com toalhas estéreis.

4. Procedimento cirúrgico

1. Exteriorização do feto
   1. Depois de garantir uma profundidade adequada de anestesia, realizar uma incisão laparotomia padrão de 10 cm usando um bisturi (lâmina #20) sobre a linha alba do umbigo até a porção cranial do úbere. Controle o sangramento fazendo uma incisão com um cautério (ajustes de potência: corte 50 e coagulação 25).
      1. Faça uma pequena incisão através da linha média da parede do corpo abaixo da incisão da pele e abra a cavidade abdominal usando uma tesoura de Metzenbaum (ver Tabela de Materiais).
   2. Exteriorize o útero contendo o feto através da parede abdominal enquanto coloca toalhas cirúrgicas estéreis por baixo (entre o abdome materno e o útero). Palpar o útero para determinar a posição fetal e os cotilédones. Usando um cautério, faça uma incisão de ~10 cm através da parede uterina com uma grande curvatura sobre o dorso da cabeça, evitando quaisquer vasos sanguíneos visíveis e placentomas.
   3. Use quatro pinças de Babcock (consulte Tabela de Materiais) para fixar o útero e as membranas placentárias e puxe as pinças de Babcock nos quatro cantos opostos para tornar a cabeça fetal visível. Exteriorizar a metade cranial do feto através desta incisão e cobrir a cabeça fetal com uma luva estéril sem látex preenchida com soro fisiológico quente e estéril (37 °C) para evitar o início da respiração.
2. Instrumentação do cateter perivascular da artéria carótida
   1. Ao remover a cabeça fetal do útero, peça a um assistente que segure suavemente a pinça de Babcock na vertical para minimizar a perda de líquido amniótico. Com o colo do feto exposto, realizar uma incisão oblíqua de 3-3,5 cm na pele ao longo da borda anterior do músculo esternocleidomastoideo (ECM) em um lado do pescoço na região média e separar a fáscia com pinça de mosquito.
      1. Divida o platisma e realize uma dissecção ao longo da borda medial do músculo ECM de seu tendão superiormente ao nível do músculo omohioideo inferiormente. A retração do ECM exporá o lençol carotídeo, que contém superficialmente uma veia jugular interna de paredes finas, e abaixo dela estará a artéria carótida como um vaso de paredes espessas.
      2. Retrair a pele com pinças de Babcock e realizar uma dissecção romba para liberar a artéria carótida do tecido circundante e do lençol carotídeo.
   2. Retire a sonda de fluxo de 3 mm (consulte Tabela de Materiais) da embalagem estéril, desaparafuse a placa de apoio da sonda e deslize-a para abrir para expor o suporte em L. Levante cuidadosamente a artéria carótida e prenda suavemente o suporte sob o vaso, evitando o contato com o vaso.
      1. Use pinças para fechar o suporte da sonda de fluxo deslizando suavemente a placa de apoio para uma posição fechada. Fixe o suporte da sonda de fluxo apertando o parafuso de apoio da sonda de fluxo. Para facilitar esse processo, segure suavemente as extremidades da sonda de fluxo com pinças para estabilizar a sonda de fluxo enquanto o parafuso está sendo apertado.
   3. Pré-lave o cateter perivascular e coloque-o nas proximidades próximas da artéria carótida proximal à sonda de fluxo. Certifique-se de que a fenda aberta do cateter perivascular esteja próxima à artéria carótida.
      1. Com uma sutura inabsorvível de seda 3-0, fixe as extremidades proximal e distal do sistema perivascular e a sonda de fluxo ao tecido intersticial próximo. Fechar o local da incisão com um ponto contínuo, fechar a pele fetal com uma sutura inabsorvível de seda 3-0 e fixar os cateteres à pele envolvendo a sutura ao redor do cateter três vezes. Retire a luva e coloque a cabeça fetal de volta no útero.
3. Cateterismo do membro fetal
   1. Exteriorizar a pata traseira do feto. Segure a perna e vire-a para os lados para visualizar a área interna da coxa. Limpar a área com gaze estéril, realizar incisão de 2 cm e expor a artéria femoral. Coloque e fixe a sonda de fluxo seguindo um procedimento semelhante ao feito com a carótida e, em seguida, feche a incisão.
   2. Faça uma incisão de 2 cm ao longo da face medial da tíbia ~0,5 cm distal ao joelho. Expor a artéria tibial posterior (paredes espessas) e a veia safena (paredes finas). Inserir cateteres de polivinil (diâmetro externo: 1,4 mm e interno: 0,9 mm) na artéria tibial posterior e veia safena usando uma técnica de corte padrão, conforme mencionado abaixo:
      1. Liberte o vaso de interesse com dissecção romba. Amarrar a porção distal do vaso com uma sutura de seda 3-0 (sem agulha) usando um nó quadrado com três arremessos. Pré-coloque uma segunda gravata sem seda na face proximal do vaso (sob o vaso), mas deixe a ligadura desamarrada. Usando tesoura Castroviejo (ver Tabela de Materiais), faça um pequeno corte transversal no vaso 2 mm proximal à ligadura distal. O comprimento do corte deve ser de ~25% do diâmetro do vaso.
      2. Restrinja o fluxo sanguíneo do vaso puxando suavemente a sutura proximal e desamarrada. Preencher o cateter com soro fisiológico heparinizado estéril. Insira a extremidade chanfrada do cateter e avance a ponta 20 cm no vaso fetal.
      3. Segure o cateter no lugar com pinça enquanto um assistente amarra a sutura de seda proximal sem gravata para fixar o vaso ao cateter; Ligar o vaso completamente ao redor do cateter inserido usando nós quadrados a 2 mm do local de inserção com três arremessos. Amarre a ligadura distal proximal à ligação proximal prendendo o vaso ao cateter.
   3. Fechar a incisão da pele com fio inabsorvível de seda 3-0 com padrão de sutura contínua. Certifique-se de que as suturas estejam amarradas ao redor dos cateteres para evitar restringir o fluxo sanguíneo se puxadas. Coloque um cateter pré-lavado no útero e fixe-o ao feto por uma sutura usando uma sutura de seda inabsorvível 3-0.

5. Colocar o feto de volta e fechar a ferida

1. Devolva o feto ao útero. Sutura das membranas fetais com fio de seda inabsorvível 3-0 com padrão de bloqueio contínuo (Cushing). Fechar a camada muscular uterina com fio de seda inabsorvível 3-0.
2. Inserir haste cirúrgica de aço inoxidável 18 no subcutâneo ao longo da parede abdominal até a região paracostal. Deixe a extremidade proximal da haste sair do local paracostal realizando uma incisão de 1 cm.
   1. Conecte os cateteres à extremidade distal da haste cirúrgica e faça com que um assistente alimente os cateteres e o cabo da sonda de fluxo através do local de saída paracostal, empurrando a haste totalmente através da abertura paracostal.
3. Fixe todos os cateteres e cabos de sonda de fluxo no local da incisão paracostal. Coloque com fita adesiva impermeável e suture os cateteres à pele da ovelha. Sutura uma bolsa de malha plástica para o exterior da ovelha sobre os cateteres e sonda para armazenar os cateteres.
   1. Usando um material de sutura absorvível sintético monofilamentar 1-0, fixe a linha alba com um padrão contínuo. Fixar a camada da pele com grampos cirúrgicos.
4. Interromper a anestesia geral e extubar a ovelha assim que os reflexos laríngeos voltarem aos valores basais normais. Não deixe o animal sozinho até que ele tenha recuperado a consciência completa. Mova a ovelha para o carrinho metabólico quando ela estiver estável após anestesia geral. Retornar o animal à sala de experimentação pós-operatória após a recuperação total da anestesia.
5. Administrar analgésicos no pós-operatório por via intravenosa (fenilbutazona 10 mg/kg/dia) por 3 dias. Lavar os cateteres vasculares diariamente com solução salina heparinizada (100 U/mL de heparina em solução de NaCl a 0,9%).

6. Experimentos in vivo pós-operatórios

1. Lave os cateteres todos os dias com soro fisiológico heparinizado (75 U/ml). Aguarde 72 h antes de fazer qualquer medição. Para medir o fluxo sanguíneo, conecte as sondas de fluxo inseridas no feto com o módulo de fluxo perivascular ao PowerLab e a um computador conectado.
   NOTA: Os registros podem ser feitos no software PowerLab (consulte Tabela de Materiais) para medir o fluxo sanguíneo carotídeo e femoral. Faça a medição basal por 30 min.
2. Conecte os cateteres arterial e amniótico ao amplificador de ponte conectado a um conversor analógico-digital (consulte a Tabela de Materiais). Administrar um bolus de 1 mL de fenilefrina 10 uM ao feto por via intravenosa e medir o fluxo carotídeo e femoral por 15 min. Em seguida, aguarde 30 min ou até que o fluxo sanguíneo retorne aos valores basais.
3. Infundir 1 mL de fenilefrina 10 uM no cateter perivascular e medir o fluxo sanguíneo por 15 min. Lave a fenilefrina administrando 5 mL de soro fisiológico morno através do cateter perivascular. Em seguida, aguarde 30 min ou até que o fluxo sanguíneo retorne aos valores basais.

Resultados

Para examinar a manipulação localizada in vivo do fluxo sanguíneo, 1 mL de fenilefrina (10 μM), um agonista α_1-AR, foi administrado no espaço perivascular da artéria carótida por um cateter de infusão exteriorizado para determinar o efeito sobre o fluxo sanguíneo carotídeo local e o efeito sobre a pressão arterial sistêmica. A Figura 1A demonstra uma redução significativa no fluxo sanguíneo carotídeo sem qualquer efeito sobre a pressão arterial sistêmic...

Discussão

Atualmente, não existe um método para examinar a contratilidade e dilatação vascular in vivo em resposta a compostos de drogas e manipulação gênica. Como padrão no campo, o fluxo sanguíneo in vivo é medido por sondas de fluxo Doppler, microesferas e moléculas radioativas, como água tritiada. No entanto, para manipular as funções dos receptores ou a sinalização a jusante, os animais são sacrificados, e experimentos são realizados in vitro em banhos de órgãos após o isolament...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aaron Bovie Electrosurgical Cautery	Henry Schein, Inc	5905974
Aaron Bovie Electrosurgical Generator	Henry Schein, Inc	1229913
Alfalfa Pellets	Sacate Pellet Mills, Inc. Maricopa AZ	100-80
Analog to Digital Converter	ADI Instruments	Powerlab
Babcock forceps	Roboz Surgicals	RS8020
Bridge Amplifier	ADI Instruments	Bridge Amplifier
Castroviejo scissors	Roboz Surgicals	RS5650SC
Diazepam	Henry Schein, Inc	1278188
Endotracheal Tube	Henry Schein, Inc	7020408
Flow Probes	Transonic Systems Inc.	MC2PSS-JS-WC100-CRS10-GC, MC3PSS-LS-WC100-CRS10-GC
Heparin	Henry Schein, Inc	1162406
Isoflurane	Henry Schein, Inc	1182097
Ketamine	Henry Schein, Inc	1273383
Ketoprofen	Zoetis Inc., Kalamazoo, MI	Ketofen
Manifold Pump Tubing	Fisher Scientific	14-190-508
Metzenbaum scissors	Roboz Surgicals	RS6010
Narkomed 4 Anesthesia Machine	North American Dräger	Narkomed 4
Normal Saline	Fisher Scientific	Z1376
penicillin G procaine suspension	Henry Schein, Inc	7455874
phenylbutazone	VetOne Boise, ID	510226
Phenylephrine	Sigma Aldrich Inc.	P1240000
Pivodine Scrub	VetOne	510094	Germicidal cleanser
PowerLab	ADInstruments		Data acquisition hardware device
Pulse Oximeter	Amazon Inc.	UT100V
Tygon Tubing	Fisher Scientific	ND-100-80
V-Top Surgical Table	VetLine Veterinary Classic Surgery	TSP-4010
Wound Clips	Fisher Scientific	10-001-024