ב Vivo מחקר בזמן אמת של השפעות התרופות על זרימת הדם התרדמה בעובר השחלה

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה להעברת תרופות וחומרים משני ביטוי גנים באופן פריווסקולרי בעובר מתפתח ברחם . חשוב לציין, ניתן למדוד את ההשפעה של תרופות/סוכנים על זרימת הדם עם התקדמות ההריון.

Abstract

יכולתו של אורגניזם לשמור על זרימת דם קבועה למוח בתגובה לעליות פתאומיות בלחץ הדם המערכתי (BP) ידועה בשם ויסות עצמי מוחי (CAR), המתרחש בעורק התרדמה. בניגוד ליילודים במועד מלא, יילודים מוקדמים אינם מסוגלים להפחית את זרימת הדם במוח (CBF) בתגובה לעלייה בBP המערכתי. אצל פגים, זה חושף את כלי הדם המוחיים השבירים ללחצי זילוח גבוהים, מה שמוביל לקרע שלהם ולנזק מוחי. מחקרי Ex vivo באמצעות מיוגרפיה של חוטים הראו כי עורקי התרדמה מעוברים בטווח הקרוב מתכווצים בתגובה להפעלת קולטני אלפא 1 אדרנרגיים. תגובה זו קהה בעובר הפג. לפיכך, כדי לבחון את התפקיד של alpha1-AR in vivo, מוצגת כאן גישה חדשנית לקביעת ההשפעות של תרופות על מקטע עורקי התרדמה in vivo בעובר שחלתי במהלך ההתקדמות ההתפתחותית של ההריון. הנתונים המוצגים מדגימים מדידה בו זמנית של זרימת הדם ולחץ הדם בעובר. מערכת המסירה ההיקפית יכולה לשמש לביצוע מחקר ארוך טווח במשך מספר ימים. יישומים נוספים לשיטה זו יכולים לכלול מערכות העברת נגיפים כדי לשנות את ביטוי הגנים בקטע של עורק התרדמה. שיטות אלה יכולות להיות מיושמות על כלי דם אחרים באורגניזם הגדל ברחם , כמו גם באורגניזמים בוגרים.

Introduction

לידה גורמת ללחץ על העובר, ויש עלייה ניכרת ברמות קטכולאמין, הורמון הלחץ העיקרי ^1,2. זה מעלה את BP המערכתי, ואם לחץ זה מועבר לנימי המוח השבירים דרך עורקי התרדמה, זה יכול להוביל לקרע^{שלהם 3,4,5}. נחשולים ב- BP מערכתי נמנעים מלהגיע למוח על ידי התכווצות עורקי התרדמה בעובר לטווח מלא. עם זאת, מנגנון זה אינו מפותח בפגים, וזה אחראי לסבירות גבוהה משמעותית לנזק מוחי בפגים ^4,5.

כיום לא קיימת שיטה מתאימה לבחינת הבשלת המסלולים המעורבים בוויסות זרימת הדם התרדמתי עם עוברים מתפתחים. מחקרים אלה על זרימת דם התרדמה ו vasoresponsiveness הם חיוניים הן מנקודת מבט מדעית בסיסית והן מנקודת מבט קלינית. כיום, כדי לקבוע את המסלולים המולקולריים המעורבים בוויסות התכווצות העורקים, השיטה הסטנדרטית כוללת בידוד מקטעי העורקים לאחר המוות. לאחר מכן, הניסויים נערכים באמצעות מיוגרפיה של חוטים כדי לקבוע את התכווצות כלי הדם של מולקולות פרמקולוגיות שונות המגדירות את מסלולי הבקרה המעורבים בהתכווצות עורקים ^6,7. יש לציין כי ממצאי ex vivo אינם מסוגלים לשכפל באופן מלא את סביבת in vivo בגלל ויסות זרימת הדם במעלה ובמורד הזרם של עורק התרדמה. לפיכך, המחקר הנוכחי נועד לפתח טכניקה שיכולה לקבוע את ההשפעות של כימיקלים או חומרים vasoresponsive על זרימת הדם בעורק in vivo.

מתודולוגיית המסירה הפריווסקולרית המתוארת במאמר זה מספקת גישה in vivo לחקר ההשפעה של מניפולציה פרמקולוגית או גנטית של מסלולי איתות על מקטעי עורקים שונים. בשיטה זו ניתן לתמרן את לחץ הדם של העובר ואת זרימת הדם של התרדמה. בנוסף, ניסויים בעוברי כבשים מודגמים לחקר ההשפעות של מולקולות איתות בעובר מתפתח. יש לקוות שהמתודולוגיה המפורטת שתוצג תוביל למחקרים חדשים בתחום מחקרי זרימת הדם, במיוחד ביחס לפיזיולוגיה ופתולוגיה של העובר.

Protocol

לצורך המחקר הנוכחי התקבל אישור לניסויים בבעלי חיים מהוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת אריזונה. במחקר הנוכחי נעשה שימוש באבני קולומביה-רמבוייה בהריון בגילאי 2-4 שנים. החיות נלקחו מיחידת הכבשים של אוניברסיטת אריזונה.

1. תחזוקת בעלי חיים

1. להשיג בעלי חיים מכל חוות כבשים.
2. להעביר את הביצים למעבדה ב 105 ימים ± 5 ימים עד 137 ימים ± 5 ימים של גיל ההריון (dGA). שמור על הכבשים בטמפרטורה של 22 ° C ± 1 °C (75 °F) בלחות הסביבה. ספקו כדורי אספסת (ראו טבלת חומרים), מלחים ומים עד ליביטום.

2. הכנת החומר

1. בניית מערכת הצנתרים הפריווסקולרית.
   1. חברו קצה אחד של צינורות טייגון באורך 1.4 מטרים לצינורות משאבת סעפת בקוטר 2 ס"מ (MPT) (ראו טבלת חומרים). חבר את הקצה השני של MPT 2 ס"מ לעוד 4 רגל של צינור טייגון.
   2. צור חריץ קטן ב- MPT כך שהנוזל / סוכנים יוכלו לצאת לחלל הפריווסקולרי.
2. חיטוי בדיקות הזרימה (ראה טבלת חומרים), קטטרים ומברג קטן בשיטת עיקור הגז.

3. הכנת בעלי חיים טרום כירורגיים

1. קבלת אישור לניסויים בבעלי חיים מהוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים.
2. לפני הניתוח, יש לשמור את הביצים על מזון אפסי לכל מערכת הפעלה (NPO) למשך 24 שעות ומי NPO למשך 16 שעות. ביום הניתוח, עטפו את פניה של אווה בפד כדי להגן על עיניה. יש לגלח את הצד השמאלי של הצוואר כדי לחשוף את הווריד הצווארי, ולנקות את העור באמצעות פובידון-יוד ואתנול 70%.
   1. הניחו צנתר תוך-ורידי (IV) בווריד הצוואר של ה-ewe, והצמידו אותו לעור בעזרת סרט דבק עמיד למים ואטבי פצעים (ראו טבלת חומרים).
3. מרדימים את הביצים במתן עירוי של דיאזפם (0.15 מ"ג/ק"ג) וקטמין הידרוכלוריד (16 מ"ג/ק"ג). מתן הזרקת IM של תרחיף פניצילין G פרוקאין (25,000 I / kg) ו ketoprofen IV (2.2 מ"ג / ק"ג) (ראה טבלה של חומרים).
4. לגלח את אתר החתך של הכבשה ואת האזורים שמסביב (בטן, אגפים, ומפשעה) עם #10 קוצץ להבים. כדי להבטיח שהצמר יוסר לחלוטין, יש לגלח מחדש את האזור עם להב #40. שטפו את האזור המגולח בתכשיר ניקוי חיידקי (ראו טבלת חומרים) ובמים. יבש עם פד חד פעמי.
5. יש לאשר את עומק ההרדמה (שנקבע ומתוחזק על ידי תגובה לצביטת העור, רפלקס הקרנית והערכת טונוס הלסת), ולאחר מכן לבצע אינטובציה עם צינור אנדוטרכאלי בקוטר פנימי של 6.5-7.5 מ"מ (ראה טבלת חומרים), ולאבטח את הצינור למקומו. הניחו את ה-ewe על שולחן הרמה במצב שכיבה רוחבי, והעבירו לשולחן ניתוחים V-top במצב שכיבה.
   1. הצמידו את הגפיים של ה-ewe לשולחן הניתוחים V-top עם קשירה כירורגית. הביאו את ה- ewe למצב Trendelenburg כדי להקל על הלחץ על יחידת השליה-עובר.
6. חברו בדיקת דופק אוקסימטר (ראו טבלת חומרים) ללשון/אוזן כדי לנטר ברציפות את רוויית האוקסיהמוגלובין ואת קצב הלב. הניחו מדחום מתחת ללשון של ewe כדי לפקח על הטמפרטורה.
   1. חבר את הצינור האנדוטרכאלי למעגל הנשימה של מכונת ההרדמה, והתחל אוורור מכני תוך ניטור CO₂ שפג תוקפו.
7. לשמור על ההרדמה על ידי התאמת האיזופלורן בין 2.5%-4% במהלך הניתוח. ודא שהחיה מורדמת כראוי על ידי צביטת האוזן. יש לתת תמיסת פולי-יונית מאוזנת (מי מלח 0.9% w/v) במהירות של 5 מ"ל/ק"ג/שעה באמצעות הצנתר הצווארי הממוקם בשלב 3.2.1.
8. בצע קרצוף סטרילי. רססו את אזור הבטן ואת האגפים בתמיסת פובידון (תמיסת יוד 10%). יש לקרצף את האזור עם גזה ספוגה ביוד החל ממקום החתך ולעבוד כלפי חוץ, תוך הקפדה לא לחזור למרכז לאחר הקרצוף החוצה.
   1. לאחר מכן, רססו את האזור באתנול (70% אתנול w/v), וקרצפו עם גזה ספוגה באתנול באופן דומה לקרצוף עם פובידון. חזור על התהליך כולו שלוש פעמים. רססו את האזור בתמיסת פובידון.
9. חם מלוחים במיכל סטרילי, ולהביא אותו ל 37 °C (77 °F). שמור את זה ליד שולחן הניתוחים. חבר את הצוואר (ראה טבלת חומרים).
10. בקש מחברי הצוות הכירורגי להתלבש בכובעים, מסכות פנים וכיסויי נעליים, לשטוף ידיים (קרצוף כירורגי), וללבוש שמלות כירורגיות מעוקרות וכפפות. מנקודה זו ואילך יש להקפיד על פרקטיקה כירורגית סטרילית קפדנית.
11. עטפו את אזור הבטן של הכבשה המעוקרת במגבות סטריליות.

4. הליך כירורגי

1. יציאה החוצה של העובר
   1. לאחר הבטחת עומק הרדמה נאות, בצע חתך לפרוטומי סטנדרטי של 10 ס"מ באמצעות אזמל (להב #20) מעל linea alba מהטבור לחלק הגולגולתי של העטין. שליטה על הדימום תוך ביצוע חתך עם צוואר (הגדרות חשמל: 50 חתך ו 25 קרישה).
      1. יש לבצע חתך קטן דרך קו האמצע של דופן הגוף מתחת לחתך העור, ולפתוח את חלל הבטן באמצעות מספריים של מצנבאום (ראו טבלת חומרים).
   2. יש להוציא את הרחם המכיל את העובר דרך דופן הבטן תוך הנחת מגבות כירורגיות סטריליות מתחתיו (בין בטן האם לרחם). למשש את הרחם כדי לקבוע את המיקום העוברי ואת cotyledons. באמצעות צריבה, בצע חתך ~ 10 ס"מ דרך דופן הרחם עם עקמומיות גדולה מעל גבי הראש, תוך הימנעות מכל כלי דם גלויים ושליות.
   3. השתמש בארבעה מהדקי Babcock (ראה טבלת חומרים) כדי לאבטח את הרחם וקרומי השליה, ומשוך את מהדקי Babcock בארבע הפינות המנוגדות כדי להפוך את ראש העובר גלוי. יש להוציא את חצי הגולגולת של העובר דרך חתך זה, ולכסות את ראש העובר בכפפה סטרילית, ללא לטקס, מלאה במי מלח חמים וסטריליים (37°C) כדי למנוע התחלת נשימה.
2. מכשור של קטטר פריווסקולרי עורק התרדמה
   1. בעת הסרת ראש העובר מהרחם, בקש מעוזר להחזיק בעדינות את מלקחיים Babcock זקוף כדי למזער את אובדן מי השפיר. כאשר צוואר העובר חשוף, יש לבצע חתך עור אלכסוני בקוטר 3-3.5 ס"מ לאורך הגבול הקדמי של שריר הסטרנוקלידומסטואיד (SCM) בצד אחד של הצוואר באזור האמצעי, ולהפריד את הפאשיה בעזרת מלקחיים נגד יתושים.
      1. מחלקים את הפלטיזמה, ומבצעים דיסקציה לאורך הגבול המדיאלי של שריר ה-SCM מהגיד שלו בצורה עליונה לרמת שריר האומוהיואיד בנחיתות. משיכת ה-SCM תחשוף את יריעת התרדמה, המכילה באופן שטחי וריד ג'וגולרי פנימי בעל דופן דקה, ומתחתיו יהיה עורק התרדמה ככלי בעל דופן עבה.
      2. הסירו את העור עם מהדקי Babcock, ובצעו דיסקציה קהה כדי לשחרר את עורק התרדמה מהרקמה שמסביב ומיריעת התרדמה.
   2. קח את בדיקת הזרימה 3 מ"מ (ראה טבלת חומרים) מהחבילה הסטרילית, פתח את לוח הגב של הגשושית והחלק אותה כדי לחשוף את תושבת ה- L. בזהירות להרים את עורק התרדמה, בעדינות לחבר את התושבת מתחת לכלי תוך הימנעות ממגע עם כלי השיט.
      1. השתמש במלקחיים כדי לסגור את תושבת בדיקת הזרימה על ידי החלקת לוחית הגב בעדינות למצב סגור. אבטח את תושבת בדיקת הזרימה על ידי הידוק בורג הגיבוי של בדיקת הזרימה. כדי להקל על תהליך זה, אחזו בעדינות בקצוות בדיקת הזרימה עם מלקחיים כדי לייצב את בדיקת הזרימה בזמן הידוק הבורג.
   3. יש לשטוף מראש את הצנתר הפריווסקולרי, ולמקם אותו בקרבת עורק התרדמה פרוקסימלי לבדיקת הזרימה. ודא כי החריץ הפתוח של הצנתר perivascular הוא קרוב לעורק התרדמה.
      1. עם תפר משי 3-0 שאינו נספג, אבטח את הקצוות הפרוקסימליים והדיסטליים של המערכת הפרי-וסקולרית ואת בדיקת הזרימה לרקמה הבין-תאית הסמוכה. סגרו את מקום החתך באמצעות תפר רציף, סגרו את עור העובר בתפר משי 3-0 שאינו נספג, והצמידו את הצנתרים לעור על ידי כריכת התפר סביב הצנתר שלוש פעמים. הסירו את הכפפה, והחזירו את ראש העובר לרחם.
3. צנתור גפיים עובריות
   1. החלק החיצוני של הרגל האחורית של העובר. החזיקו את הרגל, וסובבו אותה הצידה כדי לדמיין את אזור הירך הפנימי. נקו את האזור בגזה סטרילית, בצעו חתך של 2 ס"מ וחשפו את עורק הירך. מניחים ומאבטחים את בדיקת הזרימה לאחר הליך דומה לזה שנעשה עם התרדמה, ולאחר מכן סוגרים את החתך.
   2. בצע חתך של 2 ס"מ לאורך האספקט המדיאלי של השוקה ~ 0.5 ס"מ דיסטלי עד הברך. יש לחשוף את העורק הטיביאלי האחורי (בעל דופן עבה) ואת הווריד הספני (בעל דופן דקה). החדרת צנתרי פוליוויניל (קוטר חיצוני: 1.4 מ"מ וקוטר פנימי: 0.9 מ"מ) לעורק הטיביאלי האחורי ולווריד הספנוס בטכניקת חיתוך סטנדרטית, כמפורט להלן:
      1. שחררו את כלי השיט מהעניין בדיסקציה בוטה. קשרו את החלק הדיסטלי של הכלי בתפר משי 3-0 (ללא מחט) באמצעות קשר מרובע עם שלוש זריקות. מניחים מראש עניבה שנייה ללא משי באספקט הפרוקסימלי של הכלי (מתחת לכלי), אך משאירים את הרצועה לא קשורה. באמצעות מספריים Castroviejo (ראה טבלה של חומרים), לעשות חתך קטן, רוחבי בכלי 2 מ"מ פרוקסימלי לליגטורה דיסטלית. אורך החתך צריך להיות ~ 25% מקוטר הכלי.
      2. להגביל את זרימת הדם בכלי הדם על ידי משיכה עדינה על התפר הפרוקסימלי, לא קשור. ממלאים את הצנתר במי מלח סטריליים. מכניסים את הקצה המשופע של הצנתר, ומקדמים את הקצה 20 ס"מ לתוך כלי הדם של העובר.
      3. להחזיק את הצנתר במקומו עם מלקחיים בזמן עוזר קושר את תפר המשי הפרוקסימלי כדי לאבטח את כלי הדם לצנתר; יש לסובב את כלי הדם לחלוטין סביב הצנתר המוחדר באמצעות קשרים מרובעים בקוטר 2 מ"מ מאתר ההחדרה בשלוש זריקות. קשרו את הליגטורה הדיסטלית פרוקסימלית לקשר הפרוקסימלי המאבטח את כלי הדם לצנתר.
   3. סגור את חתך העור באמצעות תפר משי 3-0 שאינו נספג באמצעות תבנית תפר רציפה. ודא שהתפרים קשורים סביב הצנתרים כדי למנוע הגבלת זרימת הדם אם הם נמשכים. הכניסו לרחם קטטר טרום סמוק, והצמידו אותו לעובר על ידי תפר באמצעות תפר משי 3-0 שאינו נספג.

5. הנחת העובר לאחור וסגירת הפצע

1. להחזיר את העובר לרחם. תפרו את קרומי העובר באמצעות 3-0 תפרי משי שאינם נספגים בתבנית נעילה רציפה (קושינג). סגור את שכבת שרירי הרחם באמצעות תפר משי 3-0 שאינו נספג.
2. יש להכניס מוט כירורגי מנירוסטה 18 אינץ' באופן תת עורי לאורך דופן הבטן עד לאזור הפרקוסטלי. תן לקצה הפרוקסימלי של המוט לצאת מהאתר הפרקוסטלי על ידי ביצוע חתך של 1 ס"מ.
   1. חבר צנתרים לקצה הדיסטלי של מוט הניתוח, ובקש מעוזר להזין את הצנתרים וכבל בדיקה זורם דרך אתר היציאה הפרקוסטלי על ידי דחיפת המוט במלואו דרך הפתח הפרקוסטלי.
3. אבטחו את כל הצנתרים וכבלי בדיקת הזרימה באתר החתך הפרקוסטלי. מניחים עם סרט עמיד למים, ותופרים את הצנתרים לעור של ewe. תפרו נרתיק רשת מפלסטיק לחלק החיצוני של ה-ewe מעל הצנתרים ובדקו כדי לאחסן את הצנתרים.
   1. באמצעות חומר תפר סינתטי נספג מונופילמנט 1-0, לאבטח את linea alba עם דפוס רציף. יש לאבטח את שכבת העור באמצעות סיכות כירורגיות.
4. יש להפסיק את ההרדמה הכללית, ולהוציא את ה-ewe ברגע שרפלקסי הגרון חזרו לקו הבסיס הרגיל. אל תשאירו את בעל החיים ללא השגחה עד שהוא חזר להכרה מלאה. העבר את ה- ewe לעגלה המטבולית ברגע שהיא יציבה לאחר הרדמה כללית. יש להחזיר את בעל החיים לחדר הניסויים שלאחר הניתוח לאחר החלמה מלאה מההרדמה.
5. ניהול משככי כאבים לאחר הניתוח תוך ורידי (10 מ"ג / ק"ג / יום phenylbutazone) במשך 3 ימים. יש לשטוף את צנתרי כלי הדם מדי יום בתמיסת מלח הפריניזציה (100 U/mL הפרין בתמיסת NaCl של 0.9%).

6. ניסויים in vivo לאחר הניתוח

1. לשטוף את הצנתרים כל יום עם מלוחים heparinized (75 U / ml). המתן 72 שעות לפני ביצוע מדידות. כדי למדוד את זרימת הדם, חבר את בדיקות הזרימה המוחדרות לעובר באמצעות מודול הזרימה הפריווסקולרית ל-PowerLab ולמחשב מחובר.
   הערה: ניתן לבצע את ההקלטות בתוכנת PowerLab (ראה טבלת חומרים) כדי למדוד את זרימת הדם של התרדמה ועצם הירך. בצעו את המדידה הבסיסית למשך 30 דקות.
2. חבר את הצנתרים העורקיים ומי השפיר למגבר הגשר המחובר לממיר אנלוגי-דיגיטלי (ראה טבלת חומרים). לתת בולוס 1 מ"ל של 10 uM phenylephrine לעובר תוך ורידי, ולמדוד את זרימת התרדמה ואת הירך במשך 15 דקות. לאחר מכן, המתן 30 דקות או עד שזרימת הדם תחזור לקו הבסיס.
3. להחדיר 1 מ"ל של 10 uM phenylephrine לתוך קטטר perivascular, ולמדוד את זרימת הדם במשך 15 דקות. לשטוף את phenylephrine על ידי מתן 5 מ"ל של מלוחים חמים דרך קטטר perivascular. לאחר מכן, המתן 30 דקות או עד שזרימת הדם תחזור לקו הבסיס.

תוצאות

כדי לבחון את המניפולציה המקומית in vivo של זרימת הדם, 1 מ"ל של פנילפרין (10 מיקרומטר), אגוניסט_{α 1-AR}, ניתן לחלל הפריווסקולרי של עורק התרדמה על ידי קטטר עירוי חיצוני כדי לקבוע את ההשפעה על זרימת הדם המקומית של התרדמה ואת ההשפעה על לחץ הדם המערכתי. איור 1A מדגים ירידה משמעות?...

Discussion

נכון לעכשיו, לא קיימת שיטה לבחינת התכווצות כלי הדם והתרחבותם in vivo בתגובה לתרכובות תרופות ומניפולציה גנטית. כסטנדרט בתחום, זרימת הדם in vivo נמדדת על ידי בדיקות זרימת דופלר, מיקרוספרות ומולקולות רדיואקטיביות כגון מים טריטיים. עם זאת, כדי לתפעל את תפקודי הקולטנים או את האיתות במורד הז...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aaron Bovie Electrosurgical Cautery	Henry Schein, Inc	5905974
Aaron Bovie Electrosurgical Generator	Henry Schein, Inc	1229913
Alfalfa Pellets	Sacate Pellet Mills, Inc. Maricopa AZ	100-80
Analog to Digital Converter	ADI Instruments	Powerlab
Babcock forceps	Roboz Surgicals	RS8020
Bridge Amplifier	ADI Instruments	Bridge Amplifier
Castroviejo scissors	Roboz Surgicals	RS5650SC
Diazepam	Henry Schein, Inc	1278188
Endotracheal Tube	Henry Schein, Inc	7020408
Flow Probes	Transonic Systems Inc.	MC2PSS-JS-WC100-CRS10-GC, MC3PSS-LS-WC100-CRS10-GC
Heparin	Henry Schein, Inc	1162406
Isoflurane	Henry Schein, Inc	1182097
Ketamine	Henry Schein, Inc	1273383
Ketoprofen	Zoetis Inc., Kalamazoo, MI	Ketofen
Manifold Pump Tubing	Fisher Scientific	14-190-508
Metzenbaum scissors	Roboz Surgicals	RS6010
Narkomed 4 Anesthesia Machine	North American Dräger	Narkomed 4
Normal Saline	Fisher Scientific	Z1376
penicillin G procaine suspension	Henry Schein, Inc	7455874
phenylbutazone	VetOne Boise, ID	510226
Phenylephrine	Sigma Aldrich Inc.	P1240000
Pivodine Scrub	VetOne	510094	Germicidal cleanser
PowerLab	ADInstruments		Data acquisition hardware device
Pulse Oximeter	Amazon Inc.	UT100V
Tygon Tubing	Fisher Scientific	ND-100-80
V-Top Surgical Table	VetLine Veterinary Classic Surgery	TSP-4010
Wound Clips	Fisher Scientific	10-001-024