生体内 ヒツジ胎児の頸動脈血流に対する薬物効果のリアルタイム研究

要約

本プロトコルは、 子宮内 発育中の胎児に血管周囲に薬物および遺伝子発現修飾剤を送達する方法を記述する。重要なことは、血流に対する薬物/薬剤の効果は、妊娠の進行とともに測定できることです。

要約

全身血圧(BP)の急激な上昇に反応して脳への一定の血流を維持する生物の能力は、頸動脈で発生する脳の自己調節(CAR)として知られています。正期産の新生児とは対照的に、早産児は全身血圧の増加に反応して脳血流(CBF)を低下させることができません。早産児では、脆弱な脳血管が高い灌流圧にさらされ、破裂や脳の損傷につながります。ワイヤー筋造影を用いた ex vivo 研究では、早産胎児の頸動脈がアドレナリン作動性α1受容体の活性化に応答して収縮することが実証されています。この反応は早産児では鈍くなります。したがって、 in vivoでのα1-ARの役割を調べるために、妊娠の発達過程におけるヒツジ胎児の in vivo 頸動脈セグメントに対する薬物の効果を決定するための革新的なアプローチがここに提示されます。提示されたデータは、胎児の血流と血圧の同時測定を示しています。血管周囲送達システムは、数日間にわたる長期研究を実施するために使用できます。この方法のさらなる用途としては、頸動脈の一部における遺伝子の発現を変化させるウイルス送達システムが含まれる可能性があります。これらの方法は、成体だけでなく、 胎内で 成長する生物の他の血管にも適用できます。

概要

出産は胎児にストレスを与え、主要なストレスホルモンであるカテコールアミンのレベルがかなり上昇します^1,2。これにより全身血圧が上昇し、この圧力が頸動脈を介して脆弱な脳毛細血管に伝達されると、破裂につながる可能性があります^3,4,5。全身血圧の急増は、満期産の胎児の頸動脈の狭窄によって脳に到達するのを防ぎます。しかし、このメカニズムは早産児では発達しておらず、これが早産胎児の脳損傷の可能性が著しく高い原因となっています^4,5。

現在、発育中の胎児の頸動脈血流の調節に関与する経路の成熟を調べるための適切な方法は存在しません。頸動脈の血流と血管反応性に関するこれらの研究は、基礎科学と臨床の両方の観点から重要です。現在、動脈収縮性の調節に関与する分子経路を決定するために、標準的な方法は、死後に動脈セグメントを分離することを含む。次に、ワイヤー筋造影法を使用して実験を行い、動脈収縮性に関与する調節経路を定義するさまざまな薬理学的分子の血管収縮性を決定します^6,7。注目すべきは、ex vivoの所見は、頸動脈の上流と下流の血流調節のために、in vivo環境を完全に再現できないことです。そこで、本研究では、血管応答性化学物質や薬剤が生体内の動脈血流に及ぼす影響を判定する技術の開発を目指した。

本稿で説明する血管周囲送達法は、シグナル伝達経路の薬理学的または遺伝子操作がさまざまな動脈セグメントに及ぼす影響を研究するための in vivo アプローチを提供します。この方法を用いることで、胎児の血圧や頸動脈の血流を操作することができます。さらに、発育中の胎児におけるシグナル伝達分子の影響を研究するために、羊の胎児を用いた実験が実証されています。うまくいけば、提供された詳細な方法論は、特に胎児の生理学と病理学に関連して、血流研究の分野で新しい研究につながるでしょう。

プロトコル

本研究では、アリゾナ大学の動物管理委員会から動物実験の承認を得ました。2〜4歳の1回の交配、妊娠中のコロンビアランブイエの雌羊を本研究に使用しました。動物はアリゾナ大学羊ユニットから入手しました。

1.動物のメンテナンス

1. 羊の牧場から動物を手に入れる。
2. 在胎週数(dGA)の105日±5日から137日±5日で雌羊を実験室に輸送します。羊を周囲湿度で22°C±1°Cの温度に保ちます。アルファルファペレット( 材料表を参照)、塩、水を 適宜提供してください。

2. 材料の準備

1. 血管周囲カテーテルシステムを構築します。
   1. 4フィートのタイゴンチューブの一端を2cmのマニホールドポンプチューブ(MPT)に結合します( 材料表を参照)。2cmMPTのもう一方の端を別の4フィートのタイゴンチューブに取り付けます。
   2. MPTに小さなスリットを入れて、液剤が血管周囲腔に出てくるようにします。
2. フロープローブ( 材料表を参照)、カテーテル、および小型ドライバーをガス滅菌法で滅菌します。

3.術前動物の調製

1. 動物実験の許可を動物実験委員会から取得する。
2. 手術の前に、雌羊を 24時間ゼロ/os (NPO)フードと16時間NPOの水に保ちます。手術当日は、雌羊の顔をパッドで包み、目を保護します。首の左側を剃って頸静脈を露出させ、ポビドンヨードと70%エタノールを使用して皮膚をきれいにします。
   1. 雌羊の頸静脈に静脈内(IV)カテーテルを留置し、防水テープと創傷クリップで皮膚に固定します( 材料表を参照)。
3. ジアゼパム(0.15 mg / kg)と塩酸ケタミン(16 mg / kg)のIV投与で雌羊に麻酔をかけます。.ペニシリンGプロカイン懸濁液(25,000 I / kg)とIVケトプロフェン(2.2 mg / kg)のIM注射を投与します( 材料表を参照)。
4. 羊の切開部位とその周辺(腹部、脇腹、鼠径部)を#10の刃切りで削ります。ウールが完全に取り除かれるように、#40ブレードでその部分を削り直します。削った部分を殺菌クレンザー( 材料表を参照)と水で洗います。使い捨てナプキンで乾かします。
5. 麻酔の深さ(皮膚のつまみ、角膜反射、顎の緊張の評価に対する反応によって決定され、維持される)を確認し、内径6.5〜7.5 mmの気管内チューブ( 材料表を参照)で雌羊を挿管し、チューブを所定の位置に固定します。雌羊を横臥位のリフトテーブルに置き、仰臥位のV字型手術台に移します。
   1. 雌羊の手足をV字型の手術台に固定します。雌羊をトレンデレンブルグ体位にして、胎児胎盤ユニットへの圧力を緩和します。
6. パルスオキシメータプローブ( 材料表を参照)を雌羊の舌/耳に取り付けて、オキシヘモグロビン飽和度と心拍数を継続的に監視します。雌羊の舌の下に温度計を置き、温度を監視します。
   1. 気管内チューブを麻酔器の呼吸回路に接続し、呼気_CO2を監視しながら機械的換気を開始します。
7. 手術中、イソフルランを2.5%〜4%の間で調整することにより、麻酔を維持します。耳をつまんで、動物に十分な麻酔がかけられていることを確認します。ステップ3.2.1で配置した頸動脈カテーテルを使用して、バランスの取れたポリイオン(生理食塩水0.9%w / v)溶液を5 mL / kg / hで投与します。
8. 滅菌スクラブを実行します。腹部と脇腹にポビドン溶液(10%ヨウ素溶液)をスプレーします。ヨウ素を染み込ませたガーゼで、切開部位から外側に向かってこすり、外側にこすった後、中心に戻らないようにします。
   1. 次に、エタノール(70%エタノールw/v)をスプレーし、ポビドンでこすり洗いするのと同様の方法で、エタノールに浸したガーゼでこすります。このプロセス全体を3回繰り返します。その部分にポビドン溶液をスプレーします。
9. 生理食塩水を滅菌容器で温め、37°Cにする。 これを手術台の近くに保管してください。焼灼を接続します( 材料表を参照)。
10. 手術チームのメンバーに帽子、フェイスマスク、靴カバーを着用し、手を洗い(手術用スクラブ)、滅菌済みの手術用ガウンと手袋を着用してもらいます。この時点から、厳格な無菌手術の実践に従わなければなりません。
11. 滅菌した羊の腹部を滅菌タオルで覆います。

4.外科的処置

1. 胎児の外在化
   1. 十分な麻酔深度を確保した後、メス(#20ブレード)を使用して、臍から乳房の頭蓋部分までアルバ線上に10cmの標準的な開腹術切開を行います。焼灼で切開しながら出血をコントロールします(パワー設定:カット50、凝固25)。
      1. 皮膚切開の下の体壁の正中線を小さく切開し、メッツェンバウムのハサミを使用して腹腔を開きます( 材料表を参照)。
   2. 胎児を含む子宮を腹壁から外装し、その下(母体の腹部と子宮の間)に滅菌手術用タオルを置きます。子宮を触診して、胎児の位置と子葉を決定します。焼灼を使用して、目に見える血管や胎盤を避けて、頭の背側に大きな湾曲で子宮壁を~10cm切開します。
   3. 4つのバブコッククランプ( 材料表を参照)を使用して子宮と胎盤の膜を固定し、バブコッククランプを反対側の4つの角で引っ張って胎児の頭が見えるようにします。この切開部から胎児の頭蓋半分を外部化し、胎児の頭を温かい滅菌生理食塩水(37°C)で満たされた滅菌の非ラテックス手袋で覆い、呼吸の開始を防ぎます。
2. 頸動脈血管周囲カテーテルのインスツルメンテーション
   1. 胎児の頭を子宮から取り出すときは、羊水の損失を最小限に抑えるために、助手にバブコック鉗子をそっと直立させてもらいます。胎児の頸部を露出させた状態で、中央部の首の片側にある胸鎖乳突筋(SCM)の前縁に沿って3〜3.5cmの斜めの皮膚切開を行い、蚊の鉗子で筋膜を分離します。
      1. 腱を分割し、SCM筋の内側境界に沿って、その腱の上から下顎舌骨筋のレベルまでを解剖する。SCMを引っ込めると、表面的に薄肉の内頸静脈を含む頸動脈シートが露出し、その下には厚壁の血管としての頸動脈があります。
      2. バブコッククランプで皮膚を引っ込め、鈍解剖を行って頸動脈を周囲の組織と頸動脈シートから解放します。
   2. 滅菌パックから3mmフロープローブ( 材料表を参照)を取り出し、プローブのバッキングプレートを緩め、スライドさせて開いてLブラケットを露出させます。頸動脈を慎重に持ち上げ、血管との接触を避けながら、ブラケットを血管の下にそっと引っ掛けます。
      1. 鉗子を使用して、バッキングプレートを閉じた位置にそっとスライドさせ、フロープローブブラケットを閉じます。フロープローブのバックネジを締めて、フロープローブブラケットを固定します。このプロセスを容易にするには、ネジを締めている間、フロープローブの端を鉗子でそっとつかんでフロープローブを安定させます。
   3. 血管周囲カテーテルを事前に洗い流し、フロープローブの近位の頸動脈のすぐ近くに配置します。血管周囲カテーテルの開いたスリットが頸動脈のすぐ近くにあることを確認してください。
      1. 3-0シルクの非吸収性縫合糸を使用して、血管周囲系の近位端と遠位端、およびフロープローブを近くの間質組織に固定します。連続縫合で切開部位を閉じ、3-0の絹の非吸収性縫合糸で胎児の皮膚を閉じ、縫合糸をカテーテルに3回巻き付けてカテーテルを皮膚に固定します。手袋を外し、胎児の頭を子宮に戻します。
3. 胎児四肢カテーテル検査
   1. 胎児の後ろ足を外装します。脚を持ち、横に回して太ももの内側を視覚化します。滅菌ガーゼで患部を洗浄し、2cmの切開を行い、大腿動脈を露出させます。頸動脈の場合と同様の手順に従ってフロープローブを配置して固定し、切開部を閉じます。
   2. 脛骨の内側に沿って2cm~膝から0.5cm遠位まで切開します。後脛骨動脈(厚壁)と伏在静脈(薄壁)を露出させます。ポリビニルカテーテル(外径:1.4 mm、内径:0.9 mm)を後脛骨動脈と伏在静脈に挿入します。
      1. 鈍い解剖で目的の容器を解放します。3-0の絹縫合糸(針なし)で血管の遠位部を3スローの四角い結び目を使用して結紮します。血管の近位部(血管の下)に2番目のシルクフリーのネクタイを事前に置きますが、結紮糸は結紮を解いたままにしておきます。カストロビエホはさみ( 材料表を参照)を使用して、遠位結紮の近位2mmの血管に小さな横方向の切り込みを入れます。切断の長さは、容器の直径の~25%である必要があります。
      2. 近位のほどかれた縫合糸をそっと引き上げて、血管の血流を制限します。カテーテルを滅菌ヘパリン化生理食塩水で満たします。カテーテルの斜めの端を挿入し、先端を胎児血管に20cm進めます。
      3. 助手が近位シルクフリータイ縫合糸を結び、血管をカテーテルに固定している間、鉗子でカテーテルを所定の位置に保持します。挿入部位から2mmの四角い結び目を使用して、挿入されたカテーテルの周囲に血管を完全に結紮し、3回スローします。遠位結紮糸を近位タイに結び、血管をカテーテルに固定します。
   3. 連続縫合パターンを使用した3-0シルク非吸収性縫合糸を使用して皮膚切開を閉じます。抜いた場合に血流が制限されないように、縫合糸がカテーテルの周りに結ばれていることを確認してください。事前に洗い流したカテーテルを子宮に挿入し、3-0の非吸収性シルク縫合糸を使用して縫合糸で胎児に固定します。

5.胎児を元に戻し、傷口を閉じる

1. 胎児を子宮に戻します。連続的なロック(クッシング)パターンを備えた3-0の非吸収性シルク縫合糸を使用して胎児膜を縫合します。3-0の非吸収性シルク縫合糸を使用して子宮の筋肉層を閉じます。
2. 18インチのステンレス鋼の外科用ロッドを腹壁に沿って肋骨傍領域まで皮下に挿入します。1cmの切開を行うことにより、ロッドの近位端を肋骨傍部位から出させます。
   1. 外科用ロッドの遠位端にカテーテルを取り付け、アシスタントにカテーテルとフロープローブケーブルを肋骨傍開口部から完全に押し込むことにより、肋骨傍出口部位に通してもらいます。
3. すべてのカテーテルとフロープローブケーブルを肋骨傍切開部位に固定します。防水テープで固定し、雌羊の皮膚にカテーテルを縫合します。プラスチック製のメッシュポーチを雌羊の外側に縫合し、カテーテルを保管するためのプローブをカテーテルの上に貼り付けます。
   1. 1-0モノフィラメントの合成吸収性縫合糸材料を使用して、リネアアルバを連続パターンで固定します。外科用ステープルで皮膚層を固定します。
4. 全身麻酔を中止し、喉頭反射が正常なベースラインに戻ったら雌羊を抜管します。.動物が完全に意識を取り戻すまで、動物を放置しないでください。雌羊を代謝カートに移し、全身麻酔後に安定したら、雌羊を代謝カートに移します。麻酔から完全に回復した後、動物を術後実験室に戻します。
5. 術後鎮痛薬(10 mg / kg /日フェニルブタゾン)を3日間静脈内投与します。血管カテーテルをヘパリン化生理食塩水(0.9%NaCl溶液中の100 U / mLヘパリン)で毎日洗い流します。

6. 術後 in vivo 実験

1. ヘパリン処理生理食塩水(75 U / ml)で毎日カテーテルを洗い流します。測定を行う前に72時間待ちます。血流を測定するには、血管周囲フローモジュールで胎児に挿入したフロープローブをPowerLabと付属のコンピューターに取り付けます。
   注意: 記録は、PowerLabソフトウェア( 材料表を参照)で行って、頸動脈と大腿骨の血流を測定できます。ベースライン測定を30分間行います。
2. 動脈カテーテルと羊水カテーテルを、A/Dコンバーターに取り付けられたブリッジアンプに取り付けます( 資料表を参照)。10 μM フェニレフリンの 1 mL ボーラスを胎児に静脈内投与し、頸動脈と大腿骨の流れを 15 分間測定します。その後、30分間、または血流がベースラインに戻るまで待ちます。
3. 1 mL の 10 μM フェニレフリンを血管周囲カテーテルに注入し、血流を 15 分間測定します。血管周囲カテーテルから5 mLの温かい生理食塩水を投与してフェニレフリンを洗い流します。.その後、30分間、または血流がベースラインに戻るまで待ちます。

結果

局所的なin vivoでの血流操作を調べるために、α 1-ARアゴニストであるフェニレフリン(10μM)1mLを外部注入カテーテルで頸動脈の血管周囲腔に投与し、局所頸動脈血流への影響と全身血圧への影響を測定しました。図1Aは、近産の胎児ヒツジの全身血圧に何の影響も及ぼさずに頸動脈血流が有意に減少することを示しています。図1Bは、?...

ディスカッション

現在のところ、薬物化合物や遺伝子操作に応答した血管の収縮性や拡張を in vivo で調べる方法は存在しません。現場での標準として、 in vivo の血流量は、ドップラーフロープローブ、マイクロスフェア、およびトリチウム水などの放射性分子によって測定されます。しかし、受容体の機能や下流のシグナル伝達を操作するために、動物を犠牲にし、動脈セグメントを分離した後?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aaron Bovie Electrosurgical Cautery	Henry Schein, Inc	5905974
Aaron Bovie Electrosurgical Generator	Henry Schein, Inc	1229913
Alfalfa Pellets	Sacate Pellet Mills, Inc. Maricopa AZ	100-80
Analog to Digital Converter	ADI Instruments	Powerlab
Babcock forceps	Roboz Surgicals	RS8020
Bridge Amplifier	ADI Instruments	Bridge Amplifier
Castroviejo scissors	Roboz Surgicals	RS5650SC
Diazepam	Henry Schein, Inc	1278188
Endotracheal Tube	Henry Schein, Inc	7020408
Flow Probes	Transonic Systems Inc.	MC2PSS-JS-WC100-CRS10-GC, MC3PSS-LS-WC100-CRS10-GC
Heparin	Henry Schein, Inc	1162406
Isoflurane	Henry Schein, Inc	1182097
Ketamine	Henry Schein, Inc	1273383
Ketoprofen	Zoetis Inc., Kalamazoo, MI	Ketofen
Manifold Pump Tubing	Fisher Scientific	14-190-508
Metzenbaum scissors	Roboz Surgicals	RS6010
Narkomed 4 Anesthesia Machine	North American Dräger	Narkomed 4
Normal Saline	Fisher Scientific	Z1376
penicillin G procaine suspension	Henry Schein, Inc	7455874
phenylbutazone	VetOne Boise, ID	510226
Phenylephrine	Sigma Aldrich Inc.	P1240000
Pivodine Scrub	VetOne	510094	Germicidal cleanser
PowerLab	ADInstruments		Data acquisition hardware device
Pulse Oximeter	Amazon Inc.	UT100V
Tygon Tubing	Fisher Scientific	ND-100-80
V-Top Surgical Table	VetLine Veterinary Classic Surgery	TSP-4010
Wound Clips	Fisher Scientific	10-001-024