Im lebenden Organismus Echtzeitstudie zu Arzneimittelwirkungen auf den Karotisblutfluss beim Schaffötus

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur perivaskulären Verabreichung von Medikamenten und Genexpressionsmodifizierungsmitteln in einem sich in utero entwickelnden Fötus. Wichtig ist, dass die Wirkung von Medikamenten / Wirkstoffen auf den Blutfluss mit dem Fortschreiten der Schwangerschaft gemessen werden kann.

Zusammenfassung

Die Fähigkeit eines Organismus, als Reaktion auf plötzliche Anstiege des systemischen Blutdrucks (BP) einen konstanten Blutfluss zum Gehirn aufrechtzuerhalten, wird als zerebrale Autoregulation (CAR) bezeichnet, die in der Halsschlagader auftritt. Im Gegensatz zu Vollzeit-Neugeborenen sind Frühgeborene nicht in der Lage, den zerebralen Blutfluss (CBF) als Reaktion auf einen erhöhten systemischen Blutdruck zu reduzieren. Bei Frühgeborenen werden die fragilen Hirngefäße dadurch einem hohen Perfusionsdruck ausgesetzt, was zu ihrem Bruch und Hirnschäden führt. Ex-vivo-Studien mit Drahtmyographie haben gezeigt, dass sich die Halsschlagadern von kurzfristigen Föten als Reaktion auf die Aktivierung adrenerger alpha1-Rezeptoren verengen. Diese Reaktion ist beim Frühgeborenen abgestumpft. Um die Rolle von alpha1-AR in vivo zu untersuchen, wird hier ein innovativer Ansatz vorgestellt, um die Auswirkungen von Medikamenten auf ein Halsschlagadersegment in vivo bei einem Schaffötus während des Entwicklungsverlaufs der Trächtigkeit zu bestimmen. Die vorgestellten Daten zeigen die gleichzeitige Messung des fetalen Blutflusses und des Blutdrucks. Mit dem perivaskulären Verabreichungssystem kann eine Langzeitstudie über mehrere Tage durchgeführt werden. Weitere Anwendungen für diese Methode könnten virale Verabreichungssysteme sein, um die Expression von Genen in einem Segment der Halsschlagader zu verändern. Diese Methoden könnten sowohl auf andere Blutgefäße im wachsenden Organismus in utero als auch auf erwachsene Organismen angewendet werden.

Einleitung

Die Geburt verursacht Stress für den Fötus, und es kommt zu einem erheblichen Anstieg des Katecholaminspiegels, des wichtigsten Stresshormons ^1,2. Dies erhöht den systemischen Blutdruck, und wenn dieser Druck über die Halsschlagadern auf die empfindlichen Hirnkapillaren übertragen wird, kann dies zu deren Ruptur führen ^3,4,5. Anstiege des systemischen Blutdrucks werden durch die Verengung der Halsschlagadern beim Vollzeitfötus daran gehindert, das Gehirn zu erreichen. Dieser Mechanismus ist jedoch beim Frühgeborenen nicht entwickelt, und dies ist für die signifikant höhere Wahrscheinlichkeit von Hirnschäden bei Frühgeborenen verantwortlich ^4,5.

Derzeit gibt es keine geeignete Methode, um die Reifung der Signalwege zu untersuchen, die an der Regulierung des Karotisblutflusses mit sich entwickelnden Föten beteiligt sind. Diese Studien zum Karotisblutfluss und zur Vasoreagibilität sind sowohl aus grundlagenwissenschaftlicher als auch aus klinischer Sicht von entscheidender Bedeutung. Um die molekularen Signalwege zu bestimmen, die an der Regulation der arteriellen Kontraktilität beteiligt sind, besteht die Standardmethode derzeit darin, die arteriellen Segmente post mortem zu isolieren. Anschließend werden die Experimente mit Hilfe der Drahtmyographie durchgeführt, um die Vasokontraktilität verschiedener pharmakologischer Moleküle zu bestimmen, die die an der arteriellen Kontraktilität beteiligten Regulationswege definieren ^6,7. Bemerkenswert ist, dass die Ex-vivo-Befunde aufgrund der Blutflussregulierung stromaufwärts und stromabwärts der Halsschlagader nicht in der Lage sind, die In-vivo-Umgebung vollständig zu replizieren. Daher zielte die vorliegende Studie darauf ab, eine Technik zu entwickeln, mit der die Auswirkungen von vasoresponsiven Chemikalien oder Wirkstoffen auf den Blutfluss in einer Arterie in vivo bestimmt werden können.

Die in diesem Artikel beschriebene perivaskuläre Verabreichungsmethodik bietet einen In-vivo-Ansatz , um die Wirkung der pharmakologischen oder genetischen Manipulation von Signalwegen auf verschiedene arterielle Segmente zu untersuchen. Mit dieser Methode kann man den fetalen Blutdruck und den Karotisblutfluss manipulieren. Zusätzlich werden Experimente mit Schafföten demonstriert, um die Wirkung von Signalmolekülen in einem sich entwickelnden Fötus zu untersuchen. Es bleibt zu hoffen, dass die detaillierte Methodik zu neuen Untersuchungen auf dem Gebiet der Blutflussstudien führen wird, insbesondere in Bezug auf die Physiologie und Pathologie des Fötus.

Protokoll

Für die vorliegende Studie wurde die Genehmigung für die Tierversuche vom Animal Care and Use Committee der University of Arizona eingeholt. Für die vorliegende Studie wurden trächtige, trächtige Columbia-Rambouillet-Mutterschafe im Alter von 2-4 Jahren verwendet. Die Tiere wurden von der University of Arizona Sheep Unit bezogen.

1. Tierhaltung

1. Besorge dir Tiere von einer Schaffarm.
2. Transportieren Sie die Mutterschafe mit 105 Tagen ± 5 Tagen bis 137 Tagen ± 5 Tagen Gestationsalter (dGA) ins Labor. Halten Sie die Schafe bei einer Temperatur von 22 °C ± 1 °C bei Umgebungsfeuchtigkeit. Stellen Sie Luzernepellets (siehe Materialtabelle), Salze und Wasser ad libitum zur Verfügung.

2. Materialvorbereitung

1. Konstruieren Sie das perivaskuläre Kathetersystem.
   1. Verbinden Sie ein Ende von 4 Fuß Tygon-Schlauch mit einem 2 cm langen Verteilerpumpenschlauch (MPT) (siehe Materialtabelle). Befestigen Sie das andere Ende des 2 cm MPT an einem weiteren 4 Fuß langen Tygon-Rohr.
   2. Machen Sie einen kleinen Schlitz in das MPT, damit die Flüssigkeit/Wirkstoffe in den perivaskulären Raum austreten können.
2. Sterilisieren Sie die Durchflusssonden (siehe Materialtabelle), Katheter und einen kleinen Schraubendreher mit der Gassterilisationsmethode.

3. Präoperative Tiervorbereitung

1. Holen Sie die Genehmigung für Tierversuche vom Institutional Animal Care and Use Committee ein.
2. Halten Sie die Mutterschafe vor der Operation 24 Stunden lang mit NPO-Futter und 16 Stunden mit NPO-Wasser. Wickeln Sie das Gesicht des Mutterschafs am Tag der Operation mit einem Pad ein, um seine Augen zu schützen. Rasieren Sie die linke Seite des Halses, um die Halsvene freizulegen, und reinigen Sie die Haut mit Povidon-Jod und 70% Ethanol.
   1. Legen Sie einen intravenösen (IV) Katheter in die Halsvene des Mutterschafs und befestigen Sie ihn mit wasserdichtem Klebeband und Wundclips auf der Haut (siehe Materialtabelle).
3. Betäuben Sie die Mutterschafe mit einer intravenösen Verabreichung von Diazepam (0,15 mg/kg) und Ketaminhydrochlorid (16 mg/kg). Verabreichen Sie eine IM-Injektion von Penicillin G-Procain-Suspension (25.000 I/kg) und IV-Ketoprofen (2,2 mg/kg) (siehe Materialtabelle).
4. Rasieren Sie die Schnittstelle des Schafs und die umliegenden Bereiche (Bauch, Flanken und Leiste) mit einer Messerschere #10. Um sicherzustellen, dass die Wolle vollständig entfernt wird, rasieren Sie den Bereich mit einer #40-Klinge erneut. Waschen Sie den rasierten Bereich mit einem keimtötenden Reinigungsmittel (siehe Materialtabelle) und Wasser. Mit einem Einwegpad trocknen.
5. Bestätigen Sie die Narkosetiefe (bestimmt und aufrechterhalten durch Reaktion auf das Einklemmen der Haut, den Hornhautreflex und die Beurteilung des Kiefertonus) und intubieren Sie dann das Mutterschaf mit einem Endotrachealtubus mit einem Innendurchmesser von 6,5 bis 7,5 mm (siehe Materialtabelle) und befestigen Sie den Schlauch. Legen Sie das Mutterschaf in der seitlichen Liegeposition auf einen Hubtisch und setzen Sie es in Rückenlage auf einen V-Top-Operationstisch.
   1. Befestigen Sie die Gliedmaßen des Mutterschafs mit chirurgischen Zurrgurten auf dem V-Top-Operationstisch. Bringen Sie das Mutterschaf in die Trendelenburg-Position, um den Druck auf die fetal-plazentare Einheit zu verringern.
6. Befestigen Sie eine Pulsoximetersonde (siehe Materialtabelle) an der Zunge/dem Ohr des Mutterschafs, um die Oxyhämoglobinsättigung und die Herzfrequenz kontinuierlich zu überwachen. Legen Sie ein Thermometer unter die Zunge des Mutterschafs, um die Temperatur zu überwachen.
   1. Schließen Sie den Endotrachealtubus an den Beatmungskreislauf des Anästhesiegeräts an und leiten Sie die mechanische Beatmung ein, während Sie das ausgeatmete CO_{2 überwachen}.
7. Halten Sie die Anästhesie aufrecht, indem Sie das Isofluran während der Operation zwischen 2,5 % und 4 % einstellen. Stellen Sie sicher, dass das Tier ausreichend betäubt ist, indem Sie das Ohr einklemmen. Eine ausgewogene polyionische Lösung (Kochsalzlösung 0,9 % w/v) mit 5 ml/kg/h mit dem Jugularkatheter in Schritt 3.2.1 verabreichen.
8. Führen Sie ein steriles Peeling durch. Besprühen Sie den Bauchbereich und die Flanken mit Povidonlösung (10% ige Jodlösung). Schrubben Sie den Bereich mit einer jodgetränkten Gaze, beginnend an der Inzisionsstelle und nach außen, und achten Sie darauf, nach dem Schrubben nach außen nicht in die Mitte zurückzukehren.
   1. Als nächstes besprühen Sie den Bereich mit Ethanol (70% Ethanol w/v) und schrubben Sie mit einer ethanolgetränkten Gaze ähnlich wie beim Schrubben mit Povidon. Wiederholen Sie den gesamten Vorgang dreimal. Besprühen Sie den Bereich mit Povidonlösung.
9. Kochsalzlösung in einem sterilen Behälter erwärmen und auf 37 °C bringen. Bewahren Sie dies in der Nähe des Operationstisches auf. Schließen Sie den Kauter an (siehe Materialtabelle).
10. Lassen Sie die Mitglieder des chirurgischen Teams Mützen, Gesichtsmasken und Schuhüberzieher anziehen, sich die Hände waschen (OP-Peeling) und sterilisierte OP-Kittel und Handschuhe anziehen. Von diesem Zeitpunkt an muss eine streng sterile chirurgische Praxis befolgt werden.
11. Den sterilisierten Bauchbereich des Schafs mit sterilen Handtüchern drapieren.

4. Chirurgischer Eingriff

1. Exteriorisierung des Fötus
   1. Nachdem Sie eine ausreichende Narkosetiefe sichergestellt haben, führen Sie einen 10 cm langen Standard-Laparotomieschnitt mit einem Skalpell (#20 Klinge) über die Linea alba vom Nabel bis zum kranialen Teil des Euters durch. Kontrollieren Sie die Blutung, während Sie einen Schnitt mit einem Kauter machen (Leistungseinstellungen: 50 Schnitt und 25 Koagulation).
      1. Machen Sie einen kleinen Schnitt durch die Mittellinie der Körperwand unter dem Hautschnitt und öffnen Sie die Bauchhöhle mit einer Metzenbaumschere (siehe Materialtabelle).
   2. Äußere die Gebärmutter, die den Fötus enthält, durch die Bauchdecke, während sterile chirurgische Handtücher darunter gelegt werden (zwischen mütterlichem Bauch und Gebärmutter). Palpieren Sie die Gebärmutter, um die Position des Fötus und die Keimblätter zu bestimmen. Machen Sie mit einem Kauter einen ~10 cm langen Schnitt durch die Gebärmutterwand mit einer großen Krümmung über den Rücken des Kopfes, wobei sichtbare Blutgefäße und Plazentome vermieden werden.
   3. Verwenden Sie vier Babcock-Klemmen (siehe Materialtabelle), um die Gebärmutter- und Plazentamembranen zu sichern, und ziehen Sie die Babcock-Klemmen an den vier gegenüberliegenden Ecken, um den Kopf des Fötus sichtbar zu machen. Äußere die kraniale Hälfte des Fötus durch diesen Schnitt und bedecken Sie den Kopf des Fötus mit einem sterilen, latexfreien Handschuh, der mit warmer, steriler Kochsalzlösung (37 °C) gefüllt ist, um die Einleitung der Atmung zu verhindern.
2. Instrumentierung des perivaskulären Katheters der Halsschlagader
   1. Wenn Sie den Kopf des Fötus aus der Gebärmutter entfernen, lassen Sie die Babcock-Pinzette vorsichtig von einem Assistenten aufrecht halten, um den Fruchtwasserverlust zu minimieren. Führen Sie bei freiliegendem Hals des Fötus einen 3-3,5 cm langen schrägen Hautschnitt entlang des vorderen Randes des Sternocleidomastoideus-Muskels (SCM) auf einer Seite des Halses im mittleren Bereich durch und trennen Sie die Faszie mit einer Mückenzange.
      1. Teilen Sie das Platysma und führen Sie eine Dissektion entlang der medialen Grenze des SCM-Muskels von seiner Sehne oberhalb bis zur Höhe des Omohyoidmuskels inferior durch. Durch das Zurückziehen des SCM wird das Halsschlagaderblatt freigelegt, das oberflächlich eine dünnwandige innere Halsvene enthält, und darunter befindet sich die Halsschlagader als dickwandiges Gefäß.
      2. Ziehen Sie die Haut mit Babcock-Klemmen zurück und führen Sie eine stumpfe Dissektion durch, um die Halsschlagader vom umgebenden Gewebe und der Halsschlagader zu befreien.
   2. Nehmen Sie die 3-mm-Durchflusssonde (siehe Materialtabelle) aus der sterilen Verpackung, schrauben Sie die Trägerplatte der Sonde ab und schieben Sie sie auf, um die L-Halterung freizulegen. Heben Sie die Halsschlagader vorsichtig an und haken Sie die Halterung vorsichtig unter dem Gefäß ein, während Sie den Kontakt mit dem Gefäß vermeiden.
      1. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Halterung der Durchflusssonde zu schließen, indem Sie die Trägerplatte vorsichtig in eine geschlossene Position schieben. Sichern Sie die Halterung der Durchflusssonde, indem Sie die Stützschraube der Durchflusssonde festziehen. Um diesen Vorgang zu erleichtern, fassen Sie die Enden der Durchflusssonde vorsichtig mit einer Pinzette, um die Durchflusssonde zu stabilisieren, während die Schraube angezogen wird.
   3. Spülen Sie den perivaskulären Katheter vor und platzieren Sie ihn in unmittelbarer Nähe der Halsschlagader in der Nähe der Durchflusssonde. Stellen Sie sicher, dass sich der offene Schlitz des perivaskulären Katheters in unmittelbarer Nähe der Halsschlagader befindet.
      1. Befestigen Sie mit einer nicht resorbierbaren 3-0-Seidennaht die proximalen und distalen Enden des perivaskulären Systems und die Durchflusssonde am nahe gelegenen interstitiellen Gewebe. Schließen Sie die Inzisionsstelle mit einem durchgehenden Stich, schließen Sie die Haut des Fötus mit einer nicht resorbierbaren 3-0-Seidennaht und befestigen Sie die Katheter an der Haut, indem Sie die Naht dreimal um den Katheter wickeln. Entfernen Sie den Handschuh und setzen Sie den Kopf des Fötus wieder in die Gebärmutter ein.
3. Katheterisierung der fetalen Gliedmaßen
   1. Äußere das Hinterbein des Fötus. Halten Sie das Bein fest und drehen Sie es zur Seite, um den inneren Oberschenkelbereich zu visualisieren. Reinigen Sie den Bereich mit steriler Gaze, führen Sie einen 2 cm langen Schnitt durch und legen Sie die Oberschenkelarterie frei. Platzieren und sichern Sie die Durchflusssonde nach einem ähnlichen Verfahren wie bei der Halsschlagader und schließen Sie dann den Einschnitt.
   2. Machen Sie einen 2 cm langen Schnitt entlang der medialen Seite der Tibia ~0,5 cm distal zum Knie. Legen Sie die Arteria tibialis posterior (dickwandig) und die Vena saphena (dünnwandig) frei. Führen Sie Polyvinylkatheter (Außendurchmesser: 1,4 mm und Innendurchmesser: 0,9 mm) mit einer Standard-Cut-Down-Technik in die hintere Tibiaarterie und die Vena saphena ein, wie unten erwähnt:
      1. Befreien Sie das interessierende Gefäß durch stumpfes Sezieren. Lidaten Sie den distalen Teil des Gefäßes mit einer 3-0-Seidennaht (keine Nadel) mit einem quadratischen Knoten mit drei Würfen. Legen Sie eine zweite seidenfreie Krawatte an der proximalen Seite des Gefäßes (unter dem Gefäß) an, aber lassen Sie die Ligatur nicht gebunden. Machen Sie mit einer Castroviejo-Schere (siehe Materialtabelle) einen kleinen, quer verlaufenden Schnitt im Gefäß 2 mm proximal der distalen Ligatur. Die Länge des Schnitts sollte ~25% des Behälterdurchmessers betragen.
      2. Schränken Sie den Blutfluss des Gefäßes ein, indem Sie die proximale, nicht gebundene Naht vorsichtig nach oben ziehen. Füllen Sie den Katheter mit steriler heparinisierter Kochsalzlösung. Führen Sie das abgeschrägte Ende des Katheters ein und schieben Sie die Spitze 20 cm in das fötale Gefäß vor.
      3. Halten Sie den Katheter mit einer Pinzette fest, während ein Assistent die proximale Seidennaht bindet, um das Gefäß am Katheter zu befestigen. Ligatur des Gefäßes vollständig um den eingeführten Katheter mit quadratischen Knoten 2 mm von der Einführstelle entfernt mit drei Würfen. Binden Sie die distale Ligatur proximal an die proximale Bindung, mit der das Gefäß am Katheter befestigt ist.
   3. Schließen Sie den Hautschnitt mit einer nicht resorbierbaren 3-0-Seidennaht mit einem kontinuierlichen Nahtmuster. Stellen Sie sicher, dass die Nähte um die Katheter gebunden sind, um den Blutfluss beim Ziehen nicht einzuschränken. Legen Sie einen vorgespülten Katheter in die Gebärmutter und befestigen Sie ihn mit einer Naht mit einer nicht resorbierbaren 3-0-Seidennaht am Fötus.

5. Den Fötus zurücklegen und die Wunde schließen

1. Bringen Sie den Fötus in die Gebärmutter zurück. Vernähen Sie die fetalen Membranen mit 3-0 nicht resorbierbaren Seidennähten mit einem kontinuierlichen Verriegelungsmuster (Cushing). Schließen Sie die Uterusmuskelschicht mit einer nicht resorbierbaren 3-0-Seidennaht.
2. Führen Sie einen 18-Zoll-Operationsstab aus Edelstahl subkutan entlang der Bauchdecke bis zur Paracostalregion ein. Lassen Sie das proximale Ende des Stabes die Paracostalstelle verlassen, indem Sie einen 1 cm langen Schnitt durchführen.
   1. Befestigen Sie Katheter am distalen Ende des chirurgischen Stabs und lassen Sie einen Assistenten die Katheter und das Durchflusssondenkabel durch die Paracostalaustrittsstelle führen, indem Sie den Stab vollständig durch die Paracostalöffnung schieben.
3. Befestigen Sie alle Katheter und Durchflusssondenkabel an der paracostalen Inzisionsstelle. Legen Sie die Katheter mit wasserdichtem Klebeband an und nähen Sie die Katheter an die Haut des Mutterschafs. Nähen Sie einen Plastiknetzbeutel an der Außenseite des Mutterschafs über die Katheter und Sonden, um die Katheter aufzubewahren.
   1. Befestigen Sie die linea alba mit einem 1-0 monofilen synthetischen resorbierbaren Nahtmaterial mit einem durchgehenden Muster. Sichern Sie die Hautschicht mit chirurgischen Klammern.
4. Beenden Sie die Vollnarkose und extubieren Sie das Mutterschaf, sobald die Kehlkopfreflexe wieder zum normalen Ausgangswert zurückgekehrt sind. Lassen Sie das Tier nicht unbeaufsichtigt, bis es wieder vollständig bei Bewusstsein ist. Bringen Sie das Mutterkraut in den Stoffwechselwagen, sobald es nach der Vollnarkose stabil ist. Bringen Sie das Tier in den postoperativen Versuchsraum zurück, nachdem es sich vollständig von der Narkose erholt hat.
5. Postoperative Analgetika 3 Tage lang intravenös (10 mg/kg/Tag Phenylbutazon) verabreichen. Spülen Sie die Gefäßkatheter täglich mit heparinisierter Kochsalzlösung (100 U/ml Heparin in 0,9% NaCl-Lösung).

6. Postoperative In-vivo-Experimente

1. Spülen Sie die Katheter täglich mit heparinisierter Kochsalzlösung (75 U/ml). Warten Sie 72 Stunden, bevor Sie Messungen durchführen. Um den Blutfluss zu messen, schließen Sie die in den Fötus eingeführten Durchflusssonden mit dem perivaskulären Flussmodul an PowerLab und einen angeschlossenen Computer an.
   HINWEIS: Die Aufzeichnungen können mit der PowerLab-Software (siehe Materialtabelle) durchgeführt werden, um den Blutfluss der Halsschlagader und des Oberschenkels zu messen. Nehmen Sie die Basismessung für 30 Minuten vor.
2. Befestigen Sie die arteriellen und amniotischen Katheter an den Brückenverstärker, der an einen Analog-Digital-Wandler angeschlossen ist (siehe Materialtabelle). Verabreichen Sie dem Fötus intravenös einen 1 ml Bolus mit 10 μM Phenylephrin und messen Sie den Karotis- und Femurfluss für 15 Minuten. Warten Sie dann 30 Minuten oder bis der Blutfluss wieder auf den Ausgangswert zurückkehrt.
3. 1 ml 10 μM Phenylephrin in den perivaskulären Katheter geben und den Blutfluss 15 Minuten lang messen. Waschen Sie das Phenylephrin aus, indem Sie 5 ml warme Kochsalzlösung durch den perivaskulären Katheter verabreichen. Warten Sie dann 30 Minuten oder bis der Blutfluss wieder auf den Ausgangswert zurückkehrt.

Ergebnisse

Um die lokalisierte In-vivo-Manipulation des Blutflusses zu untersuchen, wurde 1 ml Phenylephrin (10 μM), ein α 1-AR-Agonist, über einen externen Infusionskatheter in den perivaskulären Raum der Halsschlagader verabreicht, um die Wirkung auf den lokalen Karotisblutfluss und die Wirkung auf den systemischen Blutdruck zu bestimmen. Abbildung 1A zeigt eine signifikante Verringerung des Karotisblutflusses ohne Auswirkungen auf den systemischen Blutdruck bei kurzzeitigen f...

Diskussion

Derzeit gibt es keine Methode, um die Kontraktilität und Dilatation von Gefäßen in vivo als Reaktion auf Arzneimittelverbindungen und Genmanipulation zu untersuchen. Als Standard im Feld wird der In-vivo-Blutfluss mit Doppler-Durchflusssonden, Mikrokugeln und radioaktiven Molekülen wie tritiiertem Wasser gemessen. Um jedoch die Funktionen der Rezeptoren oder die nachgeschaltete Signalübertragung zu manipulieren, werden die Tiere getötet und Experimente in vitro in Organbädern durchgefüh...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aaron Bovie Electrosurgical Cautery	Henry Schein, Inc	5905974
Aaron Bovie Electrosurgical Generator	Henry Schein, Inc	1229913
Alfalfa Pellets	Sacate Pellet Mills, Inc. Maricopa AZ	100-80
Analog to Digital Converter	ADI Instruments	Powerlab
Babcock forceps	Roboz Surgicals	RS8020
Bridge Amplifier	ADI Instruments	Bridge Amplifier
Castroviejo scissors	Roboz Surgicals	RS5650SC
Diazepam	Henry Schein, Inc	1278188
Endotracheal Tube	Henry Schein, Inc	7020408
Flow Probes	Transonic Systems Inc.	MC2PSS-JS-WC100-CRS10-GC, MC3PSS-LS-WC100-CRS10-GC
Heparin	Henry Schein, Inc	1162406
Isoflurane	Henry Schein, Inc	1182097
Ketamine	Henry Schein, Inc	1273383
Ketoprofen	Zoetis Inc., Kalamazoo, MI	Ketofen
Manifold Pump Tubing	Fisher Scientific	14-190-508
Metzenbaum scissors	Roboz Surgicals	RS6010
Narkomed 4 Anesthesia Machine	North American Dräger	Narkomed 4
Normal Saline	Fisher Scientific	Z1376
penicillin G procaine suspension	Henry Schein, Inc	7455874
phenylbutazone	VetOne Boise, ID	510226
Phenylephrine	Sigma Aldrich Inc.	P1240000
Pivodine Scrub	VetOne	510094	Germicidal cleanser
PowerLab	ADInstruments		Data acquisition hardware device
Pulse Oximeter	Amazon Inc.	UT100V
Tygon Tubing	Fisher Scientific	ND-100-80
V-Top Surgical Table	VetLine Veterinary Classic Surgery	TSP-4010
Wound Clips	Fisher Scientific	10-001-024