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Resumen

En la infección por Mycoplasma pneumoniae, las pruebas serológicas pueden generar buenos resultados, pero con baja especificidad debido a la reacción inmunológica cruzada. El ELISA interno de captura de antígeno, descrito en este documento, garantiza una alta especificidad de la especie y ha demostrado ser una prueba de detección confiable para el diagnóstico preciso de M. pneumoniae.

Resumen

Mycoplasma pneumoniae es un procariota deficiente en la pared celular, conocido principalmente por colonizar el tracto respiratorio humano y ser endémico, con picos epidémicos cada 6 años, en niños mayores y adultos jóvenes. El diagnóstico de M. pneumoniae es difícil debido a la naturaleza fastidiosa del patógeno y la posibilidad de transporte asintomático. El diagnóstico de laboratorio de la infección por M. pneumoniae basado en la titulación de anticuerpos en las muestras de suero de los pacientes sigue siendo el método más practicado. Debido al problema potencial de la reactividad cruzada inmunológica con el uso de suero policlonal para M. pneumoniae, se ha desarrollado un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas de captura de antígeno (ELISA) para mejorar la especificidad del diagnóstico serológico. Las placas ELISA están recubiertas con anticuerpos policlonales de M. pneumoniae, criados en conejos y específicos después de la adsorción contra un panel de bacterias heterólogas que comparten antígenos con especies de M. pneumoniae y / o se sabe que colonizan el tracto respiratorio . Los antígenos homólogos de M. pneumoniae reaccionados se reconocen específicamente por sus anticuerpos correspondientes en las muestras de suero. Una mayor optimización de los parámetros fisicoquímicos a los que se somete el ELISA de captura de antígeno condujo a un ELISA altamente específico, sensible y reproducible.

Introducción

Los micoplasmas se encuentran entre los procariotas más pequeños y simples conocidos. Se distinguen principalmente de otras bacterias por la falta de una estructura de pared celular. Por lo tanto, los micoplasmas se clasificaron en una clase separada llamada Mollicutes1. La deficiencia de la pared celular confiere resistencia intrínseca a estos microorganismos contra algunos agentes antimicrobianos y es en gran parte responsable de su polimorfismo. Los micoplasmas tienen un genoma pequeño y un tamaño reducido, lo que limita sus capacidades metabólicas y biosintéticas y explica su naturaleza parasitaria y saprofita1.

Mycoplasma pneumoniae es uno de los Mycoplasmas que infectan al hombre y se cree que es el más virulento2. M. pneumoniae coloniza el tracto respiratorio superior, lo que lleva a neumonía atípica en niños y adultos jóvenes. Los signos clínicos engendrados por la infección por M. pneumoniae son similares a la gripe, con dolor de cabeza, fiebre y tos3. La citadherencia de M. pneumoniae a las células huésped está mediada por un orgánulo de unión que incluye la adhesión mayor P1 y varias proteínas accesorias 4,5. Pueden ocurrir más manifestaciones clínicas debido a la inflamación local y la estimulación del sistema inmune del huésped resultante de la adhesión íntima de M. pneumoniae a la mucosa de la vía aérea6. A pesar de que la neumonía es un sello distintivo de la infección por M. pneumoniae, se ha revelado que la infección con esta bacteria también puede ser responsable de un amplio espectro de manifestaciones no pulmonares en diferentes sitios anatómicos como el sistema nervioso central, corazón, piel y articulaciones7.

Como para todas las especies de Mycoplasma, el diagnóstico de M. pneumoniae es un desafío. Los signos clínicos que evocan micoplasmosis son en su mayoría inaparentes y no característicos8. Dado que es muy difícil diagnosticar la infección por M. pneumoniae basándose únicamente en las manifestaciones clínicas y los síntomas, el cribado de laboratorio es de particular interés9. La detección de colonias de M. pneumoniae por cultivo es el método estándar de oro para un diagnóstico adecuado. Sin embargo, los exigentes requerimientos de crecimiento y el largo tiempo necesario para la entrega de resultados definitivos (1-2 semanas) complican el cultivo, y por lo tanto significa que rara vez se utiliza para el diagnóstico de rutina10. Las tecnologías de amplificación de ácidos nucleicos se validaron en términos de velocidad y eficiencia, aunque debido a su costo relativamente alto y la falta de disponibilidad en algunos centros de salud, estas técnicas moleculares no se consideran pruebas diagnósticas de primera línea. Es cierto que las pruebas PCR comerciales se utilizan ampliamente para diagnosticar infecciones por M. pneumoniae, pero aún no pueden reemplazar la serología. Además, la frecuente aparición de resultados falsos negativos y falsos positivos ha limitado el uso de la PCR9. Rutinariamente, la serología sigue siendo la más practicada en los laboratorios para el diagnóstico de la infección por M. pneumoniae. Se han reportado varios enfoques serológicos durante décadas, como las hemaglutininas frías, la prueba de fijación del complemento 11, la prueba de hemaglutinación indirecta12, la inmunofluorescencia 13 y la tecnología de ELISA, que se aplicó por primera vez a la serología de micoplasmas a principios de la década de 198014,15,16. Uno de los principales problemas encontrados al realizar el serodiagnóstico ELISA de la infección por M. pneumoniae son las reacciones cruzadas, lo que reduce considerablemente la especificidad de la técnica. Se informó previamente de adsorción inespecífica de sueros humanos con antígenos de M. pneumoniae; de hecho, muchos de los anticuerpos detectados por ELISA en sueros humanos no siempre pueden estar unidos a antígenos micoplasmáticos 17, debido a la similitud de M. pneumoniae con algunas bacterias18,19 y algunos tejidos animales y humanos20.

Debido a las altas lecturas de fondo observadas en la prueba ELISA convencional que se practicó en el laboratorio, la interpretación de los resultados a menudo era complicada y, por lo tanto, la entrega de un diagnóstico adecuado de M. pneumoniae era una tarea difícil. Mientras enfrentábamos este problema, optamos por mejorar el ELISA de M. pneumoniae eliminando reacciones inespecíficas de antígenos de M. pneumoniae con anticuerpos para ser probados. Para ello, se trabajó en el agotamiento selectivo de los antígenos inespecíficos de M. pneumoniae mediante la técnica de adsorción. De hecho, el objetivo principal del ELISA de captura de antígeno es detectar específicamente la inmunoglobulina (Ig) G de M. pneumoniae en muestras de suero humano. El concepto de este ELISA consiste principalmente en la captura selectiva de antígenos específicos de M. pneumoniae, antes de añadir las muestras de suero humano. Esta selectividad se asegura incubando el antígeno crudo de M. pneumoniae con un antisuero policlonal de M. pneumoniae, producido en conejos en el laboratorio y haciéndolo específico de la especie por adsorción contra un panel de bacterias heterólogas, pertenecientes o no a la clase Mollicutes, que comparten antígenos con M . pneumoniae especies y/o conocidas por colonizar las vías respiratorias. El procedimiento de adsorción se repitió tres veces, y su eficacia para eliminar la reactividad cruzada se probó mediante inmunotransferencia. El ensayo ELISA desarrollado es una combinación de ELISA sándwich e indirecto. Brevemente, los pocillos de la placa ELISA se recubren primero con un antisuero policlonal específico para M. pneumoniae. Luego, se agrega el antígeno de M. pneumoniae y queda atrapado entre el antisuero y los anticuerpos presentes en la muestra de suero que se va a analizar. El complejo inmunológico formado es detectado por un anticuerpo secundario conjugado con enzimas (IgG conjugada con peroxidasa). Las reacciones se visualizan mediante la adición de sustrato cromogénico, y la absorbancia se mide espectrofotométricamente. Este ELISA interno se presenta esquemáticamente en la Figura 1. El ELISA casero demostró ser eficiente en la detección específica de la infección por M. pneumoniae y actualmente es una de las pruebas más practicadas en la actividad diagnóstica de rutina.

Protocolo

El presente estudio se ha realizado de conformidad con los aspectos éticos establecidos por el comité de ética del Instituto Pasteur de Túnez.

1. Pasos previos a ELISA: requisitos previos y preprocesamiento

  1. Cepas bacterianas y medios de crecimiento
    NOTA: Las especies de Mollicutes y las bacterias amuralladas utilizadas en el presente estudio y sus medios de crecimiento se enumeran en la Tabla 1.
    1. Crecimiento de especies de Mollicutes
      1. Inocular 200 μL del stock de glicerol de cada especie en 1.800 μL del medio.
      2. Cultivar especies de Mollicutes estáticamente a 37 °C con 5% deCO2 durante 2-4 días hasta que se observe un cambio de pH (el indicador de pH es rojo fenol).
      3. Amplíe los cultivos a 10 ml agregando una dilución de 1/10del cultivo a los medios y permita que crezcan nuevamente en las mismas condiciones.
        NOTA: De acuerdo con el metabolismo, algunas especies humanas de Mollicutes (M. pneumoniae, M. genitalium y M. fermentans) acidifican el medio debido a la fermentación de la glucosa, y algunas otras (M. hominis y Ureaplasma) alcalinizan el medio por hidrólisis de arginina o hidrólisis de urea, respectivamente. En cuanto a los micoplasmas aviares, la acidificación del medio de Frey demuestra la presencia de M. gallisepticum, mientras que su alcalinización demuestra el crecimiento de M. imitans.
      4. Extienda 50 μL de los cultivos en placas de agar para confirmar el crecimiento de la bacteria. Mantener las placas de agar a 37 °C con un 5% deCO2 y observarlas regularmente bajo el microscopio para detectar la aparición de colonias típicas de huevos fritos (Mycoplasmas) y colonias de erizos oscuros (Ureaplasmas).
    2. Crecimiento de especies no mollicutes
      1. Cultivar las bacterias no Mollicutes en 3 ml del medio a 37 °C durante la noche (agitar a 200 rpm).
      2. Comparar la turbidez de los cultivos con los medios de control para confirmar el crecimiento.
      3. Amplíe los cultivos a 10 ml agregando una dilución de 1/100del cultivo a los medios y permita que crezcan nuevamente en las mismas condiciones.
  2. Preparación de antígenos
    1. Preparación de antígenos de especies de Mollicutes
      1. Recolectar las proteínas enteras (presentes en cultivos confirmados de M. pneumoniae y las otras especies de Mollicutes) por centrifugación a 40.000 x g a 4 °C durante 30 min.
      2. Desechar el sobrenadante y lavar los gránulos tres veces con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS, pH 7.4) mediante una serie de tres centrifugaciones con las mismas condiciones.
      3. Resuspender cada antígeno en 500 μL de PBS.
    2. Preparación de antígenos de especies no mollicutes
      1. Centrifugar los cultivos cultivados durante la noche de las bacterias no Mollicutes a 1.500 x g durante 15 min.
      2. Resuspender cada pellet bacteriano en 500 μL de PBS.
        NOTA: La concentración de proteína se determina utilizando el método clásico de cuantificación de Bradford con albúmina sérica bovina como estándar21. La concentración proteica de las especies de Mollicutes suele oscilar entre 0,7-4,8 mg/ml. Para las otras especies bacterianas, la concentración de proteína puede alcanzar 20 mg / ml. Todos los antígenos se almacenan a -20 °C hasta su uso posterior.
  3. Cribado de reactividad cruzada mediante inmunotransferencia
    1. Desnaturalice las proteínas bacterianas mezclando 8 μL de cada antígeno con un volumen igual de tampón de muestra (0,5 M Tris-HCl; pH 6,8, 10% de glicerol [v/v], 10% de SDS [p/v] y 0,2% de azul de bromofenol), incubar la mezcla a 100 °C durante 5 min.
      NOTA: La desnaturalización se realiza para cubrir las proteínas con carga negativa y romper sus estructuras secundarias, lo que les permite correr a través del gel de poliacrilamida y separarse según sus pesos moleculares.
    2. Someter las proteínas desnaturalizadas (100 μg de proteína/pocillo) a electroforesis en gel de dodecil sulfato-poliacrilamida de sodio (SDS-PAGE) por el método 22 de Laemmli con12 % de gel separador y 5% de gel de apilado. Después de eso, transfiera las proteínas electroforéticamente a la membrana de nitrocelulosa por el método23 de Towbin et al.
    3. Sumerja la membrana de nitrocelulosa en leche descremada al 5% en PBS durante 30 minutos para bloquear las superficies desocupadas. Incubar los coágulos de proteína a temperatura ambiente durante 2 h con antisuero policlonal de M. pneumoniae de conejo (producido en el Instituto Pasteur de Túnez) diluido a 1/200 en PBS-Tween 20, luego con IgG anti-conejo conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP) diluida a 1/2.000 en PBS-Tween 20 durante 1 h a temperatura ambiente.
    4. Lavar los anticuerpos no unidos con PBS y obtener los resultados exponiendo la lámina de nitrocelulosa a la solución de sustrato (4-cloro-1-naftol,H2O2). Detenga la reacción agregando agua después de 5-15 min.
  4. Procedimiento de adsorción
    NOTA: Para eliminar las reacciones cruzadas entre el antisuero policlonal M. pneumoniae y los antígenos heterólogos de las bacterias, se emplea el procedimiento de adsorción descrito previamente por Ben Abdelmoumen y Roy24 .
    1. Preparar un conjunto de antígenos de las 12 bacterias heterólogas (se sospecha que comparten antígenos con M. pneumoniae), mezclarlo en un tubo de microcentrífuga y ajustar la concentración de proteína correspondiente a la mitad del antisuero que se adsorberá en el experimento.
      NOTA: El volumen y la concentración varían entre los diferentes ensayos. Este paso depende principalmente de la concentración del anticuerpo a adsorber. Por ejemplo, si la concentración de anticuerpos = 3,56 mg/ml, la concentración del conjunto de antígenos (compuesto por las 12 bacterias heterólogas) debe ser de 1,78 mg/ml (por lo tanto, aproximadamente 0,148 mg de cada antígeno).
    2. Centrifugar la mezcla de antígenos a 14.000 x g durante 10 min a 4 °C, recoger el pellet agrupado e incubarlo con la IgG policlonal purificada anti-M. pneumoniae durante 2 h a 37 °C con agitación lenta.
    3. Después de la incubación, centrifugar la suspensión a 14.000 x g durante 10 min a 4 °C y recuperar el sobrenadante (que corresponde al antisuero policlonal específico de M. pneumoniae ).
      NOTA: Para asegurar la especificidad del antisuero policlonal M. pneumoniae , repita el procedimiento de adsorción tres veces. Antes de que pueda usarse en el ensayo ELISA, el antisuero policlonal adsorbido de M. pneumoniae debe probarse mediante inmunotransferencia para detectar la ausencia de reacciones cruzadas contra el conjunto de bacterias incluido.

2. Pasos ELISA: El ensayo en sí

  1. Recubrimiento de microplacas con el anticuerpo de captura
    1. Diluir el anticuerpo de captura (antisuero policlonal preadsorbido de M. pneumoniae ) a una concentración de 10 μg/ml en tampón carbonato-bicarbonato 0,1 M (pH 9,6).
    2. Cubra la placa ELISA de 96 pocillos agregando 100 μL del anticuerpo de captura diluido a cada pocillo.
    3. Después de la incubación nocturna a 4 °C, retire la solución de recubrimiento y lave la placa cinco veces con el tampón de lavado (composición [por L]: 146,29 g de NaCl, 39,4 g de Tris-HCl, 0,2 g de timerosal y 0,5 ml de Tween 20; pH 7,3).
  2. Bloqueante
    1. Bloquee las superficies de unión restantes de los pocillos recubiertos agregando 100 μL de la solución de bloqueo (0,5% de caseína en PBS) a cada pocillo.
    2. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente.
    3. Retire la solución de bloqueo con una pipeta y lave la placa cinco veces con el tampón de lavado.
  3. Aplicación del antígeno
    1. Añadir una cantidad igual de proteínas enteras de M. pneumoniae a todos los pocillos recubiertos (10 ng/pocillo).
    2. Dejar que la reacción tenga lugar durante 2 h a temperatura ambiente.
    3. Retire el exceso de la solución de antígeno y lave la placa cinco veces con el tampón de lavado.
  4. Aplicación de las muestras de ensayo y los controles
    1. Diluir las muestras de prueba (sueros humanos) y los controles (sueros positivos y negativos de referencia) a 1/200, 1/400 y 1/800 en PBS-Tween 20.
    2. Añadir 100 μL de las muestras diluidas y los controles en los pocillos apropiados. Llevar a cabo cada reacción por duplicado. Marque los pocillos que no contienen antígeno ni sueros como en blanco.
    3. Después de incubar la placa durante 90 minutos a temperatura ambiente, retire las soluciones de suero y lave la placa cinco veces con el tampón de lavado.
  5. Aplicación del anticuerpo de detección conjugado enzimático
    1. Diluir los anticuerpos de detección conjugados con enzimas, anticonejo conjugado con HRP e IgG antihumana a 1/10,000 en PBS-Tween 20.
    2. Pipetear 100 μL del anticuerpo de detección adecuadamente diluido para cada pocillo.
    3. Después de incubar la placa durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad, retire los anticuerpos de detección no unidos y lave la placa cinco veces con el tampón de lavado.
  6. Detección y análisis de datos
    1. Añadir 100 μL de la solución cromógena de 3,3', 5,5' tetrametilbencidina (TMB) para visualizar la unión antígeno-anticuerpo.
    2. Deje que la placa se desarrolle durante 30 minutos a temperatura ambiente y luego agregue 100 μL de la solución de parada (7.5% H2SO4) para detener la reacción enzimática.
    3. Lea la absorbancia a una longitud de onda de 450 nm utilizando el lector de microplacas y clasifique los resultados en función del cálculo del índice de positividad (IP).
      IP = Absorbancia del suero probado / Absorbancia del corte
      IP < 0.7: Resultado negativo
      IP = 0.7: La prueba debe repetirse dentro de 2 semanas
      IP > 0.7: Resultado positivo
      NOTA: La fórmula IP se concibe en el laboratorio y el valor 0,7 se configura después de la optimización. Para reacciones duplicadas, se calcula el valor medio de absorbancia. La dilución sérica óptima y la concentración de antígenos se establecen mediante el método de titulación del tablero de ajedrez ELISA (datos no mostrados). Valor de corte = DO (densidad óptica) de un suero positivo de referencia (diluido a la misma dilución que la muestra). Este DO debe ser al menos tres veces mayor que el valor de DO del control negativo.

3. Pasos post-ELISA: Evaluación de resultados y validación de pruebas

  1. La capacidad del ELISA interno para diagnosticar específicamente la infección por M. pneumoniae en los pacientes analizados se evalúa a través de inmunoblots suplementarios utilizando antígenos de M. pneumoniae y las bacterias heterólogas para confirmar la positividad de los sueros humanos probados en anticuerpos contra M. pneumoniae y su negatividad en las otras bacterias sospechosas (datos no mostrados).

Resultados

La actividad inmunoblotting del antisuero policlonal Mycoplasma pneumoniae no adsorbido a bacterias heterólogas
La reactividad cruzada existe, como se muestra en los resultados de inmunotransferencia (Figura 2) y, en comparación con el control positivo (Carril 1), algunos de los antígenos de M. pneumoniae se comparten con las bacterias examinadas. La intensidad de estas reacciones cruzadas fue variable. Por ejemplo, ...

Discusión

Este documento presenta una descripción general de un ELISA interno desarrollado principalmente para garantizar la detección específica de M. pneumoniae Infección. Se proporcionan los detalles sobre el protocolo del ensayo ELISA en sí, así como algunos pasos previos y posteriores al procesamiento. La especificidad de este ensayo está garantizada por la técnica de adsorción. Este procedimiento fue descrito previamente en pruebas ELISA desarrolladas para el diagnóstico de humanos y aves Mycoplasmas

Divulgaciones

Los autores declaran que no hay intereses contrapuestos.

Agradecimientos

Este estudio fue financiado por el Ministerio de Salud de Túnez y el Ministerio de Educación Superior e Investigación Científica de Túnez.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
4-chloro-1-naphtolSigma-AldrichC6788-50 TAB
Bacto peptoneBD211677
Bacto tryptoneBD211705
Bovine serum albuminSigma-AldrichA9647-50 G
Carbonate bicarbonate bufferSigma-AldrichC3041-50 Cap
CaseinSigma-AldrichC7078-1 KG
CMRL1066 VWRP0058-N1L
D-GlucoseSigma-AldrichG7528-1KG
Difco PPLO BrothBD255420Frey media
ELISA plate-ReaderMULTISKAN GO, Thermo ScientificRef: 51119200
Fetal bovine serumCapricorn ScientificFBS-12A
Goat peroxidase-conjugated anti-human IgGAbcamab6759
Goat peroxidase-conjugated anti-rabbit IgGLife Technologies656120
Hydrochloric Acid 37%Prolab2025.290
Hydrogen peroxide (H2O2), solution 30%ScharlauHI01361000
L-argininSigma-AldrichA5006-1KG
LB brothPrepared in Pasteur Institute of TunisProvided by the laboratory of bacteriology of the Pasteur Institute of Tunis
Mycoplasma pneumoniae polyclonal antiserum produced in rabbitProduced in Pasteur Institute of TunisSerum was produced by rabbit immunization at the Pasteur Institute of Tunis
Nicotinamide adenine dinucleotideSigma-AldrichN7004-10G
Nunc Maxisorp flat-bottom 96-well microtiter plate Invitrogen44-2404-21
Penicillin G sodium (1 MIU)PANPHARMA
Phenol redfluka chemika77660
Skim milkMP Biomedicals902887
Sodium bicarbonate Sigma-AldrichS6297-1KG
Sodium carbonateSigma-AldrichS7795-1KG
Sodium chloride (NaCl)NovachimPS02805
Sulfuric acid (H2SO4) 95-97%Merck1007311011
ThimerosalUSB22215
TMB substrate (3,3’, 5,5’ TetraMethyl-Benzidine solution)Abcamab142042
Trizma baseSigma-AldrichT6791-1 KG
Tween 20Sigma-Aldrich1379-500 ML
Yeast extract, powder, UltrapureThermo Scientific J23547 

Referencias

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