Mycoplasma pneumoniae'nin Spesifik Tespiti için Antijen Yakalama Enzimine Bağlı İmmünosorbent Testi

Özet

Mycoplasma pneumoniae enfeksiyonunda, seroloji testleri immünolojik çapraz reaksiyon nedeniyle düşük özgüllükle iyi sonuçlar verebilir. Bu yazıda açıklanan kurum içi antijen yakalama ELISA, yüksek tür özgüllüğünü garanti eder ve M. pneumoniae'nin doğru teşhisi için güvenilir bir tarama testi olduğu gösterilmiştir.

Özet

Mycoplasma pneumoniae, esas olarak insan solunum yollarını kolonize ettiği ve endemik olduğu bilinen, daha büyük çocuklarda ve genç erişkinlerde her 6 yılda bir epidemik zirvelere ulaşan, hücre duvarı eksikliği olan bir prokaryottur. M. pneumoniae'nin teşhisi, patojenin titiz doğası ve asemptomatik taşıma olasılığı nedeniyle zordur. M. pneumoniae enfeksiyonunun hastaların serum örneklerinde antikor titrasyonuna dayalı laboratuvar tanısı en çok uygulanan yöntem olmaya devam etmektedir. M. pneumoniae için poliklonal serum kullanımı ile immünolojik çapraz reaktivitenin potansiyel problemi nedeniyle, serolojik tanının özgüllüğünü arttırmak için antijen yakalama enzimine bağlı immünosorbent testi (ELISA) geliştirilmiştir. ELISA plakaları M. pneumoniae poliklonal antikorları ile kaplanır, tavşanlarda yetiştirilir ve M. pneumoniae türleri ile antijenleri paylaşan ve / veya solunum yollarını kolonize ettiği bilinen heterolog bakterilerden oluşan bir panele karşı adsorpsiyondan sonra spesifik hale getirilir. Reaksiyona giren M. pneumoniae homolog antijenleri daha sonra serum örneklerinde karşılık gelen antikorları tarafından özel olarak tanınır. Antijen yakalama ELISA'sının maruz kaldığı fizikokimyasal parametrelerin daha fazla optimizasyonu, oldukça spesifik, hassas ve tekrarlanabilir bir ELISA'ya yol açmıştır.

Giriş

Mikoplazmalar bilinen en küçük ve en basit prokaryotlar arasındadır. Esas olarak bir hücre duvarı yapısının olmaması ile diğer bakterilerden ayırt edilirler. Böylece, Mikoplazmalar Mollicutes¹ adlı ayrı bir sınıfta sınıflandırıldı. Hücre duvarı eksikliği, bazı antimikrobiyal ajanlara karşı bu mikroorganizmalara içsel direnç kazandırır ve polimorfizmlerinden büyük ölçüde sorumludur. Mikoplazmalar , metabolik ve biyosentetik yeteneklerini sınırlayan ve parazitik ve saprofitik doğalarını açıklayan küçük genoma ve küçültülmüş boyuta sahiptir¹.

Mycoplasma pneumoniae

Protokol

Bu çalışma, Tunus Pasteur Enstitüsü etik kurulu tarafından oluşturulan etik yönlere uygun olarak yürütülmüştür.

1. ELISA öncesi adımlar: Önkoşullar ve ön işleme

1. Bakteri suşları ve büyüme ortamı
   NOT: Bu çalışmada kullanılan Mollicutes türleri ve duvarlı bakteriler ile bunların büyüme ortamları Tablo 1'de listelenmiştir.
   1. Mollicutes türlerinin büyümesi
      1. Ortamın 1.800 μL'sinde her türün gliserol stoğundan 200 μL aşılayın.
      2. Mollicutes türlerini pH değişimi gözlenene kadar 2-4 gün boyunca% 5 CO₂ ile 37 ° C'de statik olarak büyütün (pH göstergesi fenol kırmızısıdır).....

Sonuçlar

Adsorbe edilmemiş poliklonal Mycoplasma pneumoniae antiserumunun heterolog bakterilere karşı immünoblotlama aktivitesi
Çapraz reaktivite, immünoblotlama sonuçlarında (Şekil 2) görüldüğü gibi gerçekten de mevcuttur ve pozitif kontrol (Şerit 1) ile karşılaştırıldığında, M. pneumoniae antijenlerinin bir kısmı taranan bakterilerle paylaşılmaktadır. Bu çapraz reaksiyonların yoğunluğu değişke.......

Tartışmalar

Bu makale, esas olarak spesifik taramayı sağlamak için geliştirilen kurum içi ELISA'nın genel bir tanımını sunmaktadır. M. pneumoniae enfeksiyon. ELISA testinin kendisinin protokolü ve bazı işlem öncesi ve sonrası adımlar hakkında ayrıntılar sağlanmaktadır. Bu tahlilin özgüllüğü adsorpsiyon tekniği ile sağlanır. Bu prosedür daha önce insan ve kuş tanısı için geliştirilen ELISA testlerinde tanımlanmıştır. Mycoplasmas^17,

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-chloro-1-naphtol	Sigma-Aldrich	C6788-50 TAB
Bacto peptone	BD	211677
Bacto tryptone	BD	211705
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A9647-50 G
Carbonate bicarbonate buffer	Sigma-Aldrich	C3041-50 Cap
Casein	Sigma-Aldrich	C7078-1 KG
CMRL1066	VWR	P0058-N1L
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G7528-1KG
Difco PPLO Broth	BD	255420	Frey media
ELISA plate-Reader	MULTISKAN GO, Thermo Scientific	Ref: 51119200
Fetal bovine serum	Capricorn Scientific	FBS-12A
Goat peroxidase-conjugated anti-human IgG	Abcam	ab6759
Goat peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG	Life Technologies	656120
Hydrochloric Acid 37%	Prolab	2025.290
Hydrogen peroxide (H2O2), solution 30%	Scharlau	HI01361000
L-arginin	Sigma-Aldrich	A5006-1KG
LB broth	Prepared in Pasteur Institute of Tunis		Provided by the laboratory of bacteriology of the Pasteur Institute of Tunis
Mycoplasma pneumoniae polyclonal antiserum produced in rabbit	Produced in Pasteur Institute of Tunis		Serum was produced by rabbit immunization at the Pasteur Institute of Tunis
Nicotinamide adenine dinucleotide	Sigma-Aldrich	N7004-10G
Nunc Maxisorp flat-bottom 96-well microtiter plate	Invitrogen	44-2404-21
Penicillin G sodium (1 MIU)	PANPHARMA
Phenol red	fluka chemika	77660
Skim milk	MP Biomedicals	902887
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6297-1KG
Sodium carbonate	Sigma-Aldrich	S7795-1KG
Sodium chloride (NaCl)	Novachim	PS02805
Sulfuric acid (H2SO4) 95-97%	Merck	1007311011
Thimerosal	USB	22215
TMB substrate (3,3’, 5,5’ TetraMethyl-Benzidine solution)	Abcam	ab142042
Trizma base	Sigma-Aldrich	T6791-1 KG
Tween 20	Sigma-Aldrich	1379-500 ML
Yeast extract, powder, Ultrapure	Thermo Scientific	J23547