Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Mycoplasma pneumoniae enfeksiyonunda, seroloji testleri immünolojik çapraz reaksiyon nedeniyle düşük özgüllükle iyi sonuçlar verebilir. Bu yazıda açıklanan kurum içi antijen yakalama ELISA, yüksek tür özgüllüğünü garanti eder ve M. pneumoniae'nin doğru teşhisi için güvenilir bir tarama testi olduğu gösterilmiştir.

Özet

Mycoplasma pneumoniae, esas olarak insan solunum yollarını kolonize ettiği ve endemik olduğu bilinen, daha büyük çocuklarda ve genç erişkinlerde her 6 yılda bir epidemik zirvelere ulaşan, hücre duvarı eksikliği olan bir prokaryottur. M. pneumoniae'nin teşhisi, patojenin titiz doğası ve asemptomatik taşıma olasılığı nedeniyle zordur. M. pneumoniae enfeksiyonunun hastaların serum örneklerinde antikor titrasyonuna dayalı laboratuvar tanısı en çok uygulanan yöntem olmaya devam etmektedir. M. pneumoniae için poliklonal serum kullanımı ile immünolojik çapraz reaktivitenin potansiyel problemi nedeniyle, serolojik tanının özgüllüğünü arttırmak için antijen yakalama enzimine bağlı immünosorbent testi (ELISA) geliştirilmiştir. ELISA plakaları M. pneumoniae poliklonal antikorları ile kaplanır, tavşanlarda yetiştirilir ve M. pneumoniae türleri ile antijenleri paylaşan ve / veya solunum yollarını kolonize ettiği bilinen heterolog bakterilerden oluşan bir panele karşı adsorpsiyondan sonra spesifik hale getirilir. Reaksiyona giren M. pneumoniae homolog antijenleri daha sonra serum örneklerinde karşılık gelen antikorları tarafından özel olarak tanınır. Antijen yakalama ELISA'sının maruz kaldığı fizikokimyasal parametrelerin daha fazla optimizasyonu, oldukça spesifik, hassas ve tekrarlanabilir bir ELISA'ya yol açmıştır.

Giriş

Mikoplazmalar bilinen en küçük ve en basit prokaryotlar arasındadır. Esas olarak bir hücre duvarı yapısının olmaması ile diğer bakterilerden ayırt edilirler. Böylece, Mikoplazmalar Mollicutes1 adlı ayrı bir sınıfta sınıflandırıldı. Hücre duvarı eksikliği, bazı antimikrobiyal ajanlara karşı bu mikroorganizmalara içsel direnç kazandırır ve polimorfizmlerinden büyük ölçüde sorumludur. Mikoplazmalar , metabolik ve biyosentetik yeteneklerini sınırlayan ve parazitik ve saprofitik doğalarını açıklayan küçük genoma ve küçültülmüş boyuta sahiptir1.

Mycoplasma pneumoniae, insanı enfekte eden Mikoplazmalardan biridir ve en virülan2 olduğu düşünülmektedir. M. pneumoniae, üst solunum yollarını kolonize ederek çocuklarda ve genç erişkinlerde atipik pnömoniye yol açar. M. pneumoniae enfeksiyonunun yol açtığı klinik bulgular grip benzeri, baş ağrısı, ateş ve öksürük3'tür. M. pneumoniae'nin konakçı hücrelere olan sitaderansına, P1 majör adezyonu ve birkaç aksesuar proteini içeren bir ataşman organeli aracılık eder 4,5. M. pneumoniae'nin hava yolu mukozasına yakın yapışmasından kaynaklanan lokal inflamasyon ve konakçı bağışıklık sisteminin uyarılması nedeniyle daha fazla klinik bulgu ortaya çıkabilir6. Pnömoni, M. pneumoniae enfeksiyonunun ayırt edici bir özelliği olmasına rağmen, bu bakteri ile enfeksiyonun, merkezi sinir sistemi, kalp, cilt ve eklemler gibi farklı anatomik bölgelerde geniş bir pulmoner olmayan bulgular spektrumundan da sorumlu olabileceği ortaya konmuştur7.

Tüm Mycoplasma türlerine gelince, M. pneumoniae'nin teşhisi zordur. Mikoplazmozu çağrıştıran klinik bulgular çoğunlukla görünmez ve karakteristik değildir8. M. pneumoniae enfeksiyonunu sadece klinik bulgulara ve semptomlara dayanarak teşhis etmek çok zor olduğundan, laboratuvar taraması özellikle ilgi çekicidir9. M. pneumoniae kolonilerinin kültür yoluyla saptanması doğru tanı için altın standart yöntemdir. Bununla birlikte, titiz büyüme gereksinimleri ve kesin sonuçların verilmesi için gereken uzun süre (1-2 hafta) kültürü karmaşıklaştırır ve bu nedenle rutin tanı için nadiren kullanıldığı anlamına gelir10. Nükleik asit amplifikasyon teknolojileri hız ve verimlilik açısından doğrulanmıştır, ancak bazı sağlık tesislerinde nispeten yüksek maliyetleri ve kullanılamamaları nedeniyle, bu moleküler teknikler birinci basamak tanı testleri olarak kabul edilmemektedir. Ticari PCR testlerinin M. pneumoniae enfeksiyonlarını teşhis etmek için yaygın olarak kullanıldığı doğrudur, ancak yine de serolojinin yerini alamazlar. Ayrıca, hem yanlış negatif hem de yanlış pozitif sonuçların sık görülmesi, PCR9'un kullanımını sınırlamıştır. Rutin olarak, seroloji, M. pneumoniae enfeksiyonunun teşhisi için laboratuvarlarda en çok uygulanan yöntem olmaya devam etmektedir. Soğuk hemaglutininler, kompleman fiksasyon testi11, dolaylı hemaglutinasyon testi 12, immünofloresan 13 ve ilk olarak 1980'lerin başında mikoplazma serolojisine uygulanan ELISA teknolojisi14,15,16 gibi çeşitli seroloji yaklaşımları on yıllardır bildirilmiştir. M. pneumoniae enfeksiyonunun ELISA serodiagnostiği yapılırken karşılaşılan en önemli sorunlardan biri, tekniğin özgüllüğünü önemli ölçüde azaltan çapraz reaksiyonlardır. İnsan serumlarının M. pneumoniae antijenleri ile spesifik olmayan adsorpsiyonu daha önce bildirilmiştir; Aslında, insan serumlarında ELISA tarafından tespit edilen antikorların çoğu, M. pneumoniae'nin bazı bakteriler 18,19 ve bazı hayvan ve insan dokuları20 ile ortaklığından dolayı her zaman mikoplazmal antijenlere 17 bağlı olmayabilir.

Laboratuvarda uygulanan geleneksel ELISA testinde gözlenen yüksek arka plan okumaları nedeniyle, sonuçların yorumlanması genellikle karmaşıktı ve bu nedenle uygun bir M. pneumoniae tanısının verilmesi zor bir görevdi. Bu sorunla karşı karşıya kalırken, M. pneumoniae antijenlerinin spesifik olmayan reaksiyonlarını test edilecek antikorlarla ortadan kaldırarak M. pneumoniae ELISA'yı iyileştirmeyi seçtik. Bu amaçla, adsorpsiyon tekniğini kullanarak spesifik olmayan M. pneumoniae antijenlerinin seçici tükenmesi üzerinde çalıştık. Aslında, antijen yakalama ELISA'nın temel amacı, insan serum örneklerinde M. pneumoniae immunoglobulin (Ig) G'yi spesifik olarak tespit etmektir. Bu ELISA kavramı, esas olarak, insan serum örneklerini eklemeden önce, M. pneumoniae-spesifik antijenlerin seçici olarak yakalanmasından oluşur. Bu seçicilik, laboratuvarda tavşanlarda üretilen M. pneumoniae ham antijeninin M. pneumoniae poliklonal antiserum ile inkübe edilmesi ve Mollicutes sınıfına ait olan veya olmayan heterolog bakterilerden oluşan bir panele karşı adsorpsiyon yoluyla türe özgü hale getirilmesi, antijenlerin M. pneumoniae ile paylaşılmasıyla sigortalanır. türler ve / veya solunum yollarını kolonize ettiği bilinmektedir. Adsorpsiyon prosedürü üç kez tekrarlandı ve çapraz reaktiviteyi ortadan kaldırma etkinliği immünoblotlama ile test edildi. Geliştirilen ELISA testi, sandviç ve dolaylı ELISA'nın bir kombinasyonudur. Kısaca, ELISA plakasının kuyucukları ilk önce M. pneumoniae'ye özgü bir poliklonal antiserum ile kaplanır. Daha sonra, M. pneumoniae antijeni eklenir ve antiserum ile test edilecek serum örneğinde bulunan antikorlar arasında sıkışır. Oluşan immünolojik kompleks, ikincil bir enzim konjuge antikoru (peroksidaz konjuge IgG) ile tespit edilir. Reaksiyonlar kromojenik substratın eklenmesiyle görselleştirilir ve absorbans spektrofotometrik olarak ölçülür. Bu kurum içi ELISA, şematik olarak Şekil 1'de sunulmuştur. Ev yapımı ELISA, M. pneumoniae enfeksiyonunu spesifik olarak tespit etmede etkili olduğunu kanıtladı ve şu anda rutin tanı aktivitesinde en çok uygulanan testlerden biridir.

Protokol

Bu çalışma, Tunus Pasteur Enstitüsü etik kurulu tarafından oluşturulan etik yönlere uygun olarak yürütülmüştür.

1. ELISA öncesi adımlar: Önkoşullar ve ön işleme

  1. Bakteri suşları ve büyüme ortamı
    NOT: Bu çalışmada kullanılan Mollicutes türleri ve duvarlı bakteriler ile bunların büyüme ortamları Tablo 1'de listelenmiştir.
    1. Mollicutes türlerinin büyümesi
      1. Ortamın 1.800 μL'sinde her türün gliserol stoğundan 200 μL aşılayın.
      2. Mollicutes türlerini pH değişimi gözlenene kadar 2-4 gün boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de statik olarak büyütün (pH göstergesi fenol kırmızısıdır).
      3. Medyaya kültürün 1/10'luk seyreltilmesini ekleyerek kültürleri 10mL'ye yükseltin ve aynı koşullarda tekrar büyümelerini sağlayın.
        NOT: Metabolizmaya göre, bazı insan Mollicutes türleri (M. pneumoniae, M. genitalium ve M. fermentans), glikoz fermantasyonu nedeniyle ortamı asitleştirir ve bazıları (M. hominis ve Ureaplasma) sırasıyla arginin hidrolizi veya üre hidrolizi ile ortamı alkalileştirir. Kuş mikoplazmaları ile ilgili olarak, Frey'in ortamının asitlenmesi M. gallisepticum'un varlığını gösterirken, alkalinizasyonu M. imitans'ın büyümesini kanıtlar.
      4. Bakterilerin büyümesini doğrulamak için kültürlerin 50 μL'sini agar plakalarına yayın. Agar plakalarını% 5 CO2 ile 37 ° C'de tutun ve tipik kızarmış yumurta kolonilerinin (Mikoplazmalar) ve koyu kestane benzeri kolonilerin (Ureaplasmas) ortaya çıkması için mikroskop altında düzenli olarak gözlemleyin.
    2. Mollicutes olmayan türlerin büyümesi
      1. Mollicutes olmayan bakterileri gece boyunca 37 ° C'de 3 mL'lik ortamda kültürleyin (200 rpm'de sallanıyor).
      2. Büyümeyi doğrulamak için kültürlerin bulanıklığını kontrol ortamıyla karşılaştırın.
      3. Medyaya kültürün 1/100'üncü seyreltilmesini ekleyerek kültürleri 10mL'ye yükseltin ve aynı koşullarda tekrar büyümelerini sağlayın.
  2. Antijen hazırlama
    1. Mollicutes türlerinin antijen hazırlanması
      1. Tüm proteinleri ( M. pneumoniae ve diğer Mollicutes türlerinin doğrulanmış kültürlerinde bulunur) 30 dakika boyunca 4 ° C'de 40.000 x g'de santrifüjleme yoluyla hasat edin.
      2. Süpernatantı atın ve peletleri aynı koşullara sahip bir dizi üç santrifüjleme ile 1 mL 1x fosfat tamponlu salin (PBS, pH 7.4) ile üç kez yıkayın.
      3. Her antijeni 500 μL PBS'de yeniden askıya alın.
    2. Mollicutes olmayan türlerin antijen hazırlanması
      1. Mollicutes olmayan bakterilerin gece boyunca yetiştirilen kültürlerini 15 dakika boyunca 1.500 x g'de santrifüj edin.
      2. Her bir bakteriyel peleti 500 μL PBS içinde yeniden askıya alın.
        NOT: Protein konsantrasyonu, standart21 olarak sığır serum albümini içeren klasik Bradford kantitasyon yöntemi kullanılarak belirlenir. Mollicutes türlerinin protein konsantrasyonu genellikle 0.7-4.8 mg / mL arasında değişmektedir. Diğer bakteri türleri için protein konsantrasyonu 20 mg / mL'ye ulaşabilir. Tüm antijenler sonraki kullanımlarına kadar -20 °C'de saklanır.
  3. İmmünoblotlama ile çapraz reaktivite taraması
    1. Her antijenin 8 μL'sini eşit hacimde numune tamponu (0.5 M Tris-HCl; pH 6.8,% 10 gliserol [v / v],% 10 SDS [w / v] ve% 0.2 bromofenol mavisi) karıştırarak bakteriyel proteinleri denatüre edin, karışımı 5 dakika boyunca 100 ° C'de inkübe edin.
      NOT: Denatürasyon, proteinleri negatif yükle örtmek ve ikincil yapılarını kırmak için gerçekleştirilir, bu da poliakrilamid jel boyunca koşmalarını ve moleküler ağırlıklarına göre ayrılmalarını sağlar.
    2. Denatüre proteinleri (100 μg protein/kuyu) Laemmli'nin yöntemi 22 ile sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezine (SDS-PAGE) %12 ayırma jeli ve %5 istifleme jeli ile maruz bırakın. Bundan sonra, proteinleri elektroforetik olarak Towbin ve ark.'nın yöntemi23 ile nitroselüloz membranına aktarın.
    3. Boş yüzeyleri tıkamak için nitroselüloz membranı PBS'de %5 yağsız süte 30 dakika batırın. Protein lekelerini, PBS-Tween 20'de 1/200'e seyreltilmiş tavşan poliklonal M. pneumoniae antiserumu (Tunus Pasteur Enstitüsü'nde üretilen) ile oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübe edin, daha sonra oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS-Tween 20'de 1/2.000'e seyreltilmiş yaban turpu peroksidaz (HRP) konjuge edilmiş tavşan karşıtı IgG ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edin.
    4. Bağlanmamış antikorları PBS ile yıkayın ve nitroselüloz tabakayı substrat çözeltisine (4-kloro-1-naftol,H2 O2) maruz bırakarak sonuçları elde edin. 5-15 dakika sonra su ekleyerek reaksiyonu durdurun.
  4. Adsorpsiyon prosedürü
    NOT: Poliklonal M. pneumoniae antiserumu ve heterolog bakteri antijenleri arasındaki çapraz reaksiyonları ortadan kaldırmak için, daha önce Ben Abdelmoumen ve Roy24 tarafından tanımlanan adsorpsiyon prosedürü kullanılmaktadır.
    1. 12 heterolog bakterinin bir antijen havuzunu hazırlayın (antijenleri M. pneumoniae ile paylaştığından şüpheleniliyor), bir mikrosantrifüj tüpünde karıştırın ve deneyde adsorbe edilecek antiserumun yarısına karşılık gelen protein konsantrasyonunu ayarlayın.
      NOT: Hacim ve konsantrasyon farklı tahliller arasında farklılık gösterir. Bu adım esas olarak adsorbe edilecek antikorun konsantrasyonuna bağlıdır. Örneğin, antikor konsantrasyonu = 3.56 mg / mL ise, antijen havuzunun konsantrasyonu (12 heterolog bakteriden oluşan) 1.78 mg / mL olmalıdır (bu nedenle, her antijenin yaklaşık 0.148 mg'ı).
    2. Antijen karışımını 4 ° C'de 10 dakika boyunca 14.000 x g'de santrifüj edin, havuzlanmış peleti toplayın ve saflaştırılmış poliklonal anti-M. pneumoniae IgG ile yavaş ajitasyonla 37 ° C'de 2 saat boyunca inkübe edin.
    3. Kuluçkadan sonra, süspansiyonu 4 ° C'de 10 dakika boyunca 14.000 x g'de santrifüj edin ve süpernatantı (spesifik poliklonal M. pneumoniae antiserumuna karşılık gelir) geri kazanın.
      NOT: Poliklonal M. pneumoniae antiserumunun özgüllüğünü sağlamak için, adsorpsiyon prosedürünü üç kez tekrarlayın. ELISA testinde kullanılmadan önce, adsorbe edilmiş poliklonal M. pneumoniae antiserumu, dahil edilen bakteri grubuna karşı çapraz reaksiyonların yokluğu için immünoblotlama ile test edilmelidir.

2. ELISA adımları: Tahlilin kendisi

  1. Yakalama antikoru ile mikroplaka kaplama
    1. Yakalama antikorunu (M. pneumoniae önceden adsorbe edilmiş poliklonal antiserum) 0,1 M karbonat-bikarbonat tamponunda (pH 9,6) 10 μg/mL konsantrasyona kadar seyreltin.
    2. 96 kuyucuklu ELISA plakasını, her bir kuyucuğa seyreltilmiş yakalama antikorunun 100 μL'sini ekleyerek kaplayın.
    3. 4 ° C'de gece boyunca inkübasyondan sonra, kaplama çözeltisini çıkarın ve plakayı yıkama tamponu ile beş kez yıkayın (bileşim [L başına]: 146.29 g NaCl, 39.4 g Tris-HCl, 0.2 g Thimerosal ve 0.5 mL Ara 20; pH 7.3).
  2. Engelleme
    1. Her bir kuyucuğa 100 μL blokaj çözeltisi (PBS'de %0,5 kazein) ekleyerek kaplanmış kuyucukların kalan bağlayıcı yüzeylerini bloke edin.
    2. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
    3. Blokaj solüsyonunu bir pipetle çıkarın ve plakayı yıkama tamponuyla beş kez yıkayın.
  3. Antijenin uygulanması
    1. Kaplanmış tüm kuyucuklara eşit miktarda M. pneumoniae bütün proteini ekleyin (10 ng / kuyu).
    2. Reaksiyonun oda sıcaklığında 2 saat boyunca gerçekleşmesine izin verin.
    3. Antijen çözeltisinin fazlalığını çıkarın ve plakayı yıkama tamponu ile beş kez yıkayın.
  4. Test numunelerinin ve kontrollerinin uygulanması
    1. PBS-Tween 20'de test numunelerini (insan serumu) ve kontrolleri (referans pozitif ve negatif serumlar) 1/200, 1/400 ve 1/800'e kadar seyreltin.
    2. Seyreltilmiş numunelerin 100 μL'sini uygun kuyucuklara ekleyin ve kontrol edin. Her reaksiyonu çift olarak gerçekleştirin. Ne antijen ne de serum içeren kuyucukları boş olarak işaretleyin.
    3. Plakayı oda sıcaklığında 90 dakika inkübe ettikten sonra, serum çözeltilerini çıkarın ve plakayı yıkama tamponuyla beş kez yıkayın.
  5. Enzim konjuge tespit antikorunun uygulanması
    1. PBS-Tween 20'de enzim konjuge tespit antikorlarını, HRP konjuge anti-tavşanı ve anti-insan IgG'yi 1/10.000'e kadar seyreltin.
    2. Pipet, her bir kuyucuğa uygun şekilde seyreltilmiş algılama antikorunun 100 μL'sidir.
    3. Plakayı karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat inkübe ettikten sonra, bağlanmamış algılama antikorlarını çıkarın ve plakayı yıkama tamponuyla beş kez yıkayın.
  6. Algılama ve veri analizi
    1. Antijen-antikor bağlanmasını görselleştirmek için 3,3', 5,5' Tetrametil-benzidin (TMB) kromojen çözeltisinin 100 μL'sini ekleyin.
    2. Plakanın oda sıcaklığında 30 dakika boyunca gelişmesine izin verin, ardından enzimatik reaksiyonu durdurmak için 100 μL durdurma çözeltisi (% 7.5H2S04) ekleyin.
    3. Mikroplaka okuyucuyu kullanarak 450 nm dalga boyundaki absorbansı okuyun ve pozitiflik indeksinin (IP) hesaplanmasına dayanarak sonuçları sıralayın.
      IP = Test edilen serumun emilimi / Kesmenin emilimi
      IP < 0.7: Olumsuz sonuç
      IP = 0.7: Test 2 hafta içinde tekrarlanmalıdır
      IP > 0.7: Olumlu sonuç
      NOT: IP formülü laboratuvarda tasarlanır ve optimizasyondan sonra 0,7 değeri ayarlanır. Yinelenen reaksiyonlar için, ortalama absorbans değeri hesaplanır. Optimum serum seyreltme ve antijen konsantrasyonu, ELISA dama tahtası titrasyon yöntemi ile belirlenir (veriler gösterilmemiştir). Kesme değeri = Referans pozitif serumun OD (optik yoğunluk) (numune ile aynı seyreltmede seyreltilir). Bu OD, negatif denetimin OD değerinden en az üç kat daha yüksek olmalıdır.

3. ELISA sonrası adımlar: Sonuç değerlendirmesi ve test doğrulaması

  1. Kurum içi ELISA'nın test edilen hastalarda M. pneumoniae enfeksiyonunu spesifik olarak teşhis etme yeteneği, M. pneumoniae antikorlarında test edilen insan serumlarının pozitifliğini ve diğer şüpheli bakterilerdeki olumsuzluklarını doğrulamak için M. pneumoniae ve heterolog bakterilerin antijenleri kullanılarak ek immünoblotlar yoluyla değerlendirilir (veriler gösterilmemiştir).

Sonuçlar

Adsorbe edilmemiş poliklonal Mycoplasma pneumoniae antiserumunun heterolog bakterilere karşı immünoblotlama aktivitesi
Çapraz reaktivite, immünoblotlama sonuçlarında (Şekil 2) görüldüğü gibi gerçekten de mevcuttur ve pozitif kontrol (Şerit 1) ile karşılaştırıldığında, M. pneumoniae antijenlerinin bir kısmı taranan bakterilerle paylaşılmaktadır. Bu çapraz reaksiyonların yoğunluğu değişke...

Tartışmalar

Bu makale, esas olarak spesifik taramayı sağlamak için geliştirilen kurum içi ELISA'nın genel bir tanımını sunmaktadır. M. pneumoniae enfeksiyon. ELISA testinin kendisinin protokolü ve bazı işlem öncesi ve sonrası adımlar hakkında ayrıntılar sağlanmaktadır. Bu tahlilin özgüllüğü adsorpsiyon tekniği ile sağlanır. Bu prosedür daha önce insan ve kuş tanısı için geliştirilen ELISA testlerinde tanımlanmıştır. Mycoplasmas17,

Açıklamalar

Yazarlar, rakip çıkarların olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma Tunus Sağlık Bakanlığı ve Tunus Yüksek Öğretim ve Bilimsel Araştırma Bakanlığı tarafından finanse edilmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
4-chloro-1-naphtolSigma-AldrichC6788-50 TAB
Bacto peptoneBD211677
Bacto tryptoneBD211705
Bovine serum albuminSigma-AldrichA9647-50 G
Carbonate bicarbonate bufferSigma-AldrichC3041-50 Cap
CaseinSigma-AldrichC7078-1 KG
CMRL1066 VWRP0058-N1L
D-GlucoseSigma-AldrichG7528-1KG
Difco PPLO BrothBD255420Frey media
ELISA plate-ReaderMULTISKAN GO, Thermo ScientificRef: 51119200
Fetal bovine serumCapricorn ScientificFBS-12A
Goat peroxidase-conjugated anti-human IgGAbcamab6759
Goat peroxidase-conjugated anti-rabbit IgGLife Technologies656120
Hydrochloric Acid 37%Prolab2025.290
Hydrogen peroxide (H2O2), solution 30%ScharlauHI01361000
L-argininSigma-AldrichA5006-1KG
LB brothPrepared in Pasteur Institute of TunisProvided by the laboratory of bacteriology of the Pasteur Institute of Tunis
Mycoplasma pneumoniae polyclonal antiserum produced in rabbitProduced in Pasteur Institute of TunisSerum was produced by rabbit immunization at the Pasteur Institute of Tunis
Nicotinamide adenine dinucleotideSigma-AldrichN7004-10G
Nunc Maxisorp flat-bottom 96-well microtiter plate Invitrogen44-2404-21
Penicillin G sodium (1 MIU)PANPHARMA
Phenol redfluka chemika77660
Skim milkMP Biomedicals902887
Sodium bicarbonate Sigma-AldrichS6297-1KG
Sodium carbonateSigma-AldrichS7795-1KG
Sodium chloride (NaCl)NovachimPS02805
Sulfuric acid (H2SO4) 95-97%Merck1007311011
ThimerosalUSB22215
TMB substrate (3,3’, 5,5’ TetraMethyl-Benzidine solution)Abcamab142042
Trizma baseSigma-AldrichT6791-1 KG
Tween 20Sigma-Aldrich1379-500 ML
Yeast extract, powder, UltrapureThermo Scientific J23547 

Referanslar

  1. Razin, S., Yogev, D., Naot, Y. Molecular biology and pathogenicity of mycoplasmas. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1094-1156 (1998).
  2. Chanock, R. M. Mycoplasma infections of man. The New England Journal of Medicine. 273 (22), 1199-1206 (1965).
  3. Braun, G. S., Wagner, K. S., Huttner, B. D., Schmid, H. Mycoplasma pneumoniae: Usual suspect and unsecured diagnosis in the acute setting. The Journal of Emergency Medicine. 30 (4), 371-375 (2006).
  4. Baseman, J. B., Cole, R. M., Krause, D. C., Leith, D. K. Molecular basis for cytadhesion of Mycoplasma pneumoniae. Journal of Bacteriology. 151, 1514-1522 (1982).
  5. Waldo, R. H., Krause, D. C. Synthesis, stability, and function of cytadhesin P1 and accessory protein B/C complex of Mycoplasma pneumoniae. Journal of Bacteriology. 188 (2), 569-575 (2006).
  6. Waites, K. B., Balish, M. F., Atkinson, T. P. New insights into the pathogenesis and detection of Mycoplasma pneumoniae infections. Future Microbiology. 3 (6), 635-648 (2008).
  7. Narita, M. Pathogenesis of extrapulmonary manifestations of Mycoplasma pneumoniae infection with special reference to pneumonia. Journal of Infection and Chemotherapy. 16 (3), 162-169 (2010).
  8. Kashyap, S., Sarkar, M. Mycoplasma pneumonia: Clinical features and management. Lung India. 27 (2), 75-85 (2010).
  9. Zhang, L., Zong, Z. Y., Liu, Y. B., Ye, H., Lv, X. J. PCR versus serology for diagnosing Mycoplasma pneumoniae infection: A systematic review & meta-analysis. Indian Journal of Medical Research. 134 (3), 270-280 (2011).
  10. Saraya, T. Mycoplasma pneumoniae infection: Basics. Journal of General and Family Medicine. 18 (3), 118-125 (2017).
  11. Jacobs, E. Serological diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infections: a critical review of current procedures. Clinical Infectious Diseases. 17, 79-82 (1993).
  12. Kok, T. W., Marmion, B. P., Varkanis, G., Worswick, D. A., Martin, J. Laboratory diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection: 3. Detection of IgM antibodies to M. pneumoniae by a modified indirect haemagglutination test. Epidemiology and Infection. 103 (3), 613-623 (1989).
  13. Smith, T. F. Mycoplasma pneumoniae infections: diagnosis based on immunofluorescence titer of IgG and IgM antibodies. Mayo Clinic Proceedings. 61 (10), 830-831 (1986).
  14. Busolo, F., Tonin, E., Conventi, L. Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Mycoplasma pneumoniae antibodies. Journal of Clinical Microbiology. 12 (1), 69-73 (1980).
  15. Van Griethuysen, A. J., et al. Use of the enzyme-linked immunosorbent assay for the early diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection. European Journal of Clinical Microbiology. 3 (2), 116-121 (1984).
  16. Raisanen, S. M., Suni, J. I., Leinikki, P. Serological diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection by enzyme immunoassay. Journal of Clinical Pathology. 33 (9), 836-840 (1980).
  17. Sasaki, T., Bonissol, C., Stoilikovic, B., Ito, K. Demonstration of cross-reactive antibodies to mycoplasmas in human sera by ELISA and immunoblotting. Microbiology and Immunology. 31 (7), 639-648 (1987).
  18. Brunner, H., et al. Unexpectedly high frequency of antibody to Mycoplasma pneumoniae in human sera as measured by sensitive techniques. Journal of Infectious Diseases. 135 (4), 524-530 (1977).
  19. Plackett, P., Marmion, B. P., Shaw, E. J., Lemcke, R. M. Immunochemical analysis of Mycoplasma pneumoniae: 3. Separation and chemical identification of serological active lipids. Australian Journal of Experimental Biology and Medical Science. 47 (2), 171-195 (1969).
  20. Ponka, A. The occurrence and clinical picture of serologically verified Mycoplasma pneumoniae infections with emphasis on central nervous system, cardiac and joint manifestations. Annals of Clinical Research. 11, 1-60 (1979).
  21. Bradford, M. M. A Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  22. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  23. Towbin, H., Staehlin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets. Procedure and some applications. Proceedings of National Academy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  24. Ben Abdelmoumen, B., Roy, S. An enzyme-linked immunosorbent assay for detection of avian mycoplasmas in culture. Avian Diseases. 39, 85-93 (1995).
  25. Fawcett, P. T., O'Brien, A. E., Doughty, R. A. An adsorption procedure to increase the specificity of enzyme-linked immunosorbent assays for lyme disease without decreasing sensitivity. Arthritis and Rheumatism. 32 (8), 1041-1044 (1989).
  26. Nicolson, G. L., Nasralla, M. Y., Nicolson, N. L. The pathogenesis and treatment of mycoplasmal infections. Antimicrobics and Infectious Disease Newsletter. 17 (11), 81-88 (1999).
  27. Meyer, R. D., Clough, W. Extragenital Mycoplasma hominis infections in adults: emphasis on immunosuppression. Clinical Infectious Diseases. 17, 243-249 (1993).
  28. Pitcher, D. G., Nicholas, R. A. J. Mycoplasma host specificity: Fact or fiction. Veterinary Journal. 170 (3), 300-306 (2005).
  29. Lierz, M., Jansen, A., Hafez, H. M. Mycoplasma lipofaciens transmission to veterinarian. Emerging Infectious Diseases. 14 (7), 1161-1163 (2008).
  30. Baker, A. S., Ruoff, K. L., Madoff, S. Isolation of Mycoplasma species from a patient with seal finger. Clinical Infectious Diseases. 27 (5), 1168-1170 (1998).
  31. Slack, M., P, E. A review of the role of Haemophilus influenzae in community-acquired pneumonia. Pneumonia. 6 (1), 26-43 (2015).
  32. Janira Avire, N., Whiley, H., Ross, K. A review of Streptococcus pyogenes: public health risk factors, prevention and control. Pathogens. 10 (2), 248 (2021).
  33. Steinitz, M. Quantitation of the blocking effect of Tween 20 and bovine serum albumin in ELISA microwells. Analytical Biochemistry. 282 (2), 232-238 (2000).
  34. Tully, J. G., Whitcomb, R. F., Clark, H. F., Williamson, D. L. Pathogenic mycoplasmas: cultivation and vertebrate pathogenicity of a new spiroplasma. Science. 195 (4281), 892-894 (1977).
  35. Frey, M. L., Hanson, R. P., Andrson, D. P. A medium for the isolation of avian mycoplasmas. American Journal of Veterinary Research. 29 (11), 2163-2171 (1968).
  36. Bertani, G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 62 (3), 293-300 (1951).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 192

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır