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요약

마이코플라스마 폐렴 감염에서 혈청 검사는 좋은 결과를 생성할 수 있지만 면역학적 교차 반응으로 인해 특이도가 낮습니다. 이 논문에 설명된 사내 항원 포획 ELISA는 높은 종 특이성을 보장하며 M. pneumoniae의 정확한 진단을 위한 신뢰할 수 있는 선별 검사로 나타났습니다.

초록

Mycoplasma pneumoniae 는 세포벽 결핍 원핵생물로, 주로 인간의 호흡기를 식민지화하고 풍토병으로 알려져 있으며 6년마다 전염병이 최고조에 달하는 것으로 알려져 있습니다. M. pneumoniae 의 진단은 병원균의 까다로운 특성과 무증상 운송의 가능성 때문에 어렵습니다. 환자의 혈청 샘플에서 항체 적정에 기초한 M. pneumoniae 감염의 실험실 진단은 가장 많이 시행되는 방법으로 남아 있습니다. M. pneumoniae에 대한 다클론 혈청의 사용으로 인한 면역 학적 교차 반응의 잠재적 인 문제 때문에 혈청 학적 진단의 특이성을 향상시키기 위해 항원 포획 효소 결합 면역 흡착 분석 (ELISA)이 개발되었습니다. ELISA 플레이트는 M. pneumoniae polyclonal 항체로 코팅되고, 토끼에서 자라며, M. pneumoniae 종과 항원을 공유하거나 호흡기를 식민지화하는 것으로 알려진 이종 박테리아 패널에 대해 흡착 후 특이적으로 렌더링됩니다 . 반응된 M. pneumoniae 상동 항원은 혈청 샘플에서 그의 상응하는 항체에 의해 특이적으로 인식된다. 항원-포획 ELISA가 적용되는 물리화학적 파라미터의 추가 최적화는 매우 특이적이고 민감하며 재현 가능한 ELISA를 유도했습니다.

서문

마이코플라스마 는 알려진 가장 작고 단순한 원핵생물 중 하나입니다. 그들은 주로 세포벽 구조가 없기 때문에 다른 박테리아와 구별됩니다. 따라서 마이코 플라스마는 Mollicutes1이라는 별도의 클래스로 분류되었습니다. 세포벽 결핍은 일부 항균제에 대해 이러한 미생물에 대한 내재적 내성을 부여하며 다형성에 크게 책임이 있습니다. 마이코플라스마는 게놈이 작고 크기가 작아 대사 및 생합성 능력을 제한하고 기생 및 부생균 특성을 설명합니다1.

마이코플라스마 폐렴은 사람을 감염시키는 마이코플라스마 중 하나이며 가장 독성이 강한 것으로 생각됩니다2. M. pneumoniae는 상부 호흡기를 식민지화하여 어린이와 젊은 성인의 비정형 성 폐렴을 유발합니다. M. pneumoniae 감염으로 인한 임상 징후는 두통, 발열 및 기침과 함께 독감과 유사합니다3. 숙주 세포에 대한 M. pneumoniae의 세포 부착은 P1 주요 접착 및 여러 보조 단백질 4,5를 포함하는 부착 소기관에 의해 매개됩니다. 기도 점막에 대한 M. pneumoniae의 친밀한 부착으로 인한 숙주 면역계의 국소 염증 및 자극으로 인해 더 많은 임상 증상이 발생할 수 있습니다6. 폐렴은 M. pneumoniae 감염의 특징이지만,이 박테리아에 의한 감염은 또한 중추 신경계, 심장, 피부 및 관절과 같은 다양한 해부학 적 부위에서 광범위한 비 폐 증상을 유발할 수 있음이 밝혀졌습니다7.

모든 마이코플라스마 종에 관해서는 M. pneumoniae의 진단이 어렵습니다. 마이코 플라스마 증을 유발하는 임상 징후는 대부분 명백하지 않고 특징이 없습니다8. 임상 증상과 증상에만 의존하여 M. pneumoniae 감염을 진단하는 것은 매우 어렵 기 때문에 실험실 스크리닝이 특히 중요합니다9. 배양으로 M. pneumoniae 콜로니를 검출하는 것은 적절한 진단을위한 황금 표준 방법입니다. 그러나 까다로운 성장 요구 사항과 최종 결과 (1-2 주)를 제공하는 데 필요한 긴 시간은 문화를 복잡하게 만들어 일상적인 진단에 거의 사용되지 않음을 의미합니다10. 핵산 증폭 기술은 속도와 효율성 측면에서 검증되었지만 상대적으로 높은 비용과 일부 의료 시설에서 사용할 수 없기 때문에 이러한 분자 기술은 1 차 진단 테스트로 간주되지 않습니다. 상용 PCR 검사가 M. pneumoniae 감염을 진단하는 데 널리 사용되는 것은 사실이지만 여전히 혈청학을 대체 할 수는 없습니다. 또한 위음성 및 위양성 결과가 모두 자주 발생하여 PCR9의 사용이 제한되었습니다. 일상적으로, 혈청학은 M. pneumoniae 감염의 진단을 위해 실험실에서 가장 많이 시행되고 있습니다. 차가운 혈구 응집소, 보체 고정 검사 11, 간접 혈구 응집 검사 12, 면역 형광검사 13 및 1980 년대 초 마이코 플라스마 혈청학에 처음 적용된 ELISA 기술과 같은 여러 혈청 학적 접근법이 수십 년 동안보고되었습니다14,15,16. M. pneumoniae 감염의 ELISA 혈청 진단을 수행 할 때 발생하는 주요 문제 중 하나는 교차 반응이며, 이는 기술의 특이성을 상당히 낮 춥니 다. M. pneumoniae 항원을 사용한 인간 혈청의 비특이적 흡착은 이전에 보고되었습니다. 사실, 인간 혈청에서 ELISA에 의해 검출된 많은 항체는 일부 박테리아(18,19) 및 일부 동물 및 인간 조직(20)과의 M. pneumoniae의 공통성으로 인해 마이코플라스마 항원(17)에 항상 결합되지 않을 수 있다.

실험실에서 시행 된 기존의 ELISA 검사에서 관찰 된 높은 배경 판독 값으로 인해 결과 해석이 종종 복잡했기 때문에 적절한 M. pneumoniae 진단을 전달하는 것은 어려운 과제였습니다. 이 문제에 직면하는 동안 우리는 테스트 할 항체와 M. pneumoniae 항원의 비특이적 반응을 제거하여 M. pneumoniae ELISA를 개선하기로 결정했습니다. 이를 위해 흡착 기술을 사용하여 비특이적 M. pneumoniae 항원의 선택적 고갈에 대해 연구했습니다. 사실, 항원 포획 ELISA의 주요 목표는 인간 혈청 샘플에서 M. pneumoniae 면역 글로불린 (Ig) G를 특이 적으로 검출하는 것입니다. 이 ELISA의 개념은 주로 인간 혈청 샘플을 추가하기 전에 M. pneumoniae 특이 항원의 선택적 포획으로 구성됩니다. 이 선택성은 실험실에서 토끼에서 생산되는 M. pneumoniae polyclonal antiserum과 함께 M. pneumoniae 원유 항원을 배양하고 Mollicutes 클래스에 속하거나 속하지 않는 이종 박테리아 패널에 대한 흡착에 의해 종 특이 적으로 만들어 M. pneumoniae 와 항원을 공유함으로써 보장됩니다. 종 및/또는 호흡기를 식민지화하는 것으로 알려져 있습니다. 흡착 절차를 세 번 반복하고, 교차 반응을 제거하는 그의 효율을 면역 블로팅에 의해 시험하였다. 개발된 ELISA 분석은 샌드위치와 간접 ELISA의 조합입니다. 간단히 말해서, ELISA 플레이트의 웰은 먼저 M. pneumoniae에 특이적인 다클론 항혈청으로 코팅됩니다. 이어서, M. pneumoniae 항원을 첨가하고, 항혈청과 시험될 혈청 샘플에 존재하는 항체 사이에 포획한다. 형성된 면역 복합체는 2 차 효소 - 접합 된 항체 (퍼 옥시다제 - 접합 된 IgG)에 의해 검출된다. 반응은 발색 기질의 첨가에 의해 시각화되고, 흡광도는 분광 광도계로 측정된다. 이 사내 ELISA는 그림 1에 개략적으로 나와 있습니다. 수제 ELISA는 M. pneumoniae 감염을 특이적으로 감지하는 데 효율적인 것으로 입증되었으며 현재 일상적인 진단 활동에서 가장 많이 시행되는 테스트 중 하나입니다.

프로토콜

본 연구는 튀니스 파스퇴르 연구소의 윤리위원회가 설립 한 윤리적 측면에 따라 수행되었습니다.

1. 사전 ELISA 단계: 전제 조건 및 전처리

  1. 박테리아 균주 및 성장 배지
    참고: 본 연구에 사용된 Mollicutes 종과 벽으로 둘러싸인 박테리아 및 성장 배지는 표 1에 나열되어 있습니다.
    1. 연체 동물의 성장
      1. 각 종의 글리세롤 스톡으로부터 200 μL의 배지 1,800 μL를 접종한다.
      2. pH 변화가 관찰 될 때까지 2-4 일 동안 5 % CO2 로 37 ° C에서 정적으로 Mollicutes 종을 성장시킵니다 (pH 표시기는 페놀 레드).
      3. 배양액의 1/10희석액을 배지에 추가하여 배양물을 10mL로 확장하고 동일한 조건에서 다시 성장할 수 있도록 합니다.
        참고: 신진 대사에 따르면 일부 인간 Mollicutes 종 (M. pneumoniae, M. genitalium 및 M. fermentans)은 포도당 발효로 인해 배지를 산성화하고 일부 다른 종 (M. hominis 및 우레아 플라스마)은 각각 아르기닌 가수 분해 또는 요소 가수 분해로 배지를 알칼리화합니다. 조류 마이코 플라스마와 관련하여 Frey 배지의 산성화는 M. gallisepticum의 존재를 입증하는 반면 알칼리화는 M. imitans의 성장을 증명합니다.
      4. 배양 물 50μL를 한천 플레이트에 뿌려 박테리아의 성장을 확인합니다. 한천 플레이트를 5%CO2 로 37°C로 유지하고 전형적인 프라이드 계란 콜로니(마이코플라스마) 및 어두운 성게와 같은 콜로니(우레아플라스마)의 출현에 대해 현미경으로 정기적으로 관찰합니다.
    2. 비 몰리 카테 종의 성장
      1. Mollicutes 박테리아를 3 mL의 배지에서 37°C에서 밤새 배양합니다(200rpm으로 진탕).
      2. 배양의 탁도를 대조군 배지와 비교하여 성장을 확인합니다.
      3. 배양액의 1/100희석 액을 배지에 추가하여 배양액을 10mL로 확장하고 동일한 조건에서 다시 성장할 수 있도록 합니다.
  2. 항원 준비
    1. 연체 동물의 항원 준비
      1. 4°C에서 30분 동안 40,000 x g로 원심분리하여 전체 단백질(M. pneumoniae 및 다른 Mollicutes 종의 확인된 배양물에 존재)을 수확합니다.
      2. 상청액을 버리고 동일한 조건으로 일련의 3개의 원심분리에 의해 1x 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.4) 1mL로 펠릿을 3회 세척합니다.
      3. 각 항원을 500 μL의 PBS에 재현탁시킨다.
    2. 비 연체 동물의 항원 준비
      1. 비Mollicutes 박테리아의 하룻밤 성장 배양물을 1,500 x g에서 15분 동안 원심분리합니다.
      2. 각 박테리아 펠릿을 500μL의 PBS에 재현탁합니다.
        참고: 단백질 농도는 소 혈청 알부민을 표준21로 사용하는 고전적인 Bradford 정량 방법을 사용하여 측정됩니다. Mollicutes 종의 단백질 농도는 일반적으로 0.7-4.8 mg / mL 사이입니다. 다른 박테리아 종의 경우 단백질 농도가 20mg/mL에 도달할 수 있습니다. 모든 항원은 이들의 후속 용법까지 -20°C에서 저장된다.
  3. 면역블로팅에 의한 교차 반응성 스크리닝
    1. 8μL의 각 항원을 동일한 부피의 샘플 완충액(0.5M Tris-HCl; pH 6.8, 10% 글리세롤[v/v], 10% SDS[w/v] 및 0.2% 브로모페놀 블루)과 혼합하여 박테리아 단백질을 변성시키고, 혼합물을 100°C에서 5분 동안 배양합니다.
      참고: 변성은 단백질을 음전하로 덮고 2차 구조를 파괴하기 위해 수행되며, 이를 통해 폴리아크릴아미드 겔을 가로질러 흐르고 분자량에 따라 분리될 수 있습니다.
    2. 변성 단백질 (100 μg 단백질 / 웰)을 Laemmli의 방법 22에 의해 나트륨 도데 실 설페이트-폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE)에12 % 분리 겔 및 5 % 스태킹 겔로 적용합니다. 그 후, 단백질을 전기 영동적으로 Towbin et al.의 방법23에 의해 니트로 셀룰로오스 막으로 옮깁니다.
    3. 니트로셀룰로오스 멤브레인을 PBS의 5% 탈지유에 30분 동안 담그면 비어 있는 표면을 차단합니다. 단백질 블롯을 PBS-트윈 20에서 1/200으로 희석한 토끼 다클론 M. 폐렴 항혈청(튀니스 파스퇴르 연구소에서 제조)으로 실온에서 2시간 동안 배양한 다음, PBS-트윈 20에서 1/2,000으로 희석한 양 고추냉이 과산화효소(HRP) 접합 항토끼 IgG를 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
    4. 결합되지 않은 항체를 PBS로 씻어내고 니트로셀룰로오스 시트를 기질용액(4-클로로-1-나프톨,H2O2)에 노출시켜 결과를 얻었다. 5-15 분 후에 물을 추가하여 반응을 중지하십시오.
  4. 흡착 절차
    참고: 다클론 M. pneumoniae 항혈청과 이종 박테리아 항원 사이의 교차 반응을 제거하기 위해 Ben Abdelmoumen과 Roy24 가 이전에 설명한 흡착 절차가 사용됩니다.
    1. 12 개의 이종 박테리아 ( M. pneumoniae와 항원을 공유하는 것으로 의심됨)의 항원 풀을 준비하고 미세 원심 분리 튜브에 혼합하고 실험에서 흡착 할 항 혈청의 절반에 해당하는 단백질 농도를 조정합니다.
      참고: 부피와 농도는 분석마다 다릅니다. 이 단계는 주로 흡착되는 항체의 농도에 의존한다. 예를 들어, 항체 농도 = 3.56mg/mL인 경우 항원 풀(12개의 이종 박테리아로 구성됨)의 농도는 1.78mg/mL(따라서 각 항원의 약 0.148mg)여야 합니다.
    2. 항원 혼합물을 4°C에서 10분 동안 14,000 x g 에서 원심분리하고, 풀링된 펠릿을 수집하고, 느린 교반과 함께 37°C에서 2시간 동안 정제된 폴리클로날 항-M. 폐렴 IgG와 함께 인큐베이션한다.
    3. 인큐베이션 후, 현탁액을 4°C에서 10분 동안 14,000 x g 에서 원심분리하고, 상청액을 회수한다 (이는 특이적 폴리클로날 M. pneumoniae 항혈청에 상응한다).
      알림: 다클론 M. pneumoniae 항혈청의 특이성을 보장하려면 흡착 절차를 세 번 반복하십시오. ELISA 분석에 사용하기 전에 흡착된 다클론 M. 폐렴 항혈청을 면역블로팅으로 검사하여 포함된 박테리아 세트에 대한 교차 반응이 없는지 확인해야 합니다.

2. ELISA 단계: 분석 자체

  1. 포획 항체를 사용한 마이크로플레이트 코팅
    1. 포획 항체(M. pneumoniae 사전 흡착된 다클론 항혈청)를 0.1M 탄산염-중탄산염 완충액(pH 9.6)에서 10μg/mL의 농도로 희석합니다.
    2. 희석된 포획 항체 100 μL를 각 웰에 첨가하여 96-웰 ELISA 플레이트를 코팅한다.
    3. 4°C에서 밤새 인큐베이션한 후, 코팅 용액을 제거하고, 플레이트를 세척 완충액으로 5회 세척한다 (조성물 [당 L]: 146.29 g의 NaCl, 39.4 g의 트리스-HCl, 0.2 g의 티메로살, 및 0.5 mL의 트윈 20; pH 7.3).
  2. 블로킹
    1. 각 웰에 100 μL의 블로킹 용액(PBS 중 0.5% 카제인)을 첨가하여 코팅된 웰의 나머지 결합 표면을 차단합니다.
    2. 실온에서 1 시간 동안 배양하십시오.
    3. 피펫으로 블로킹 용액을 제거하고 세척 버퍼로 플레이트를 5 회 세척하십시오.
  3. 항원의 적용
    1. 동일한 양의 M. pneumoniae 전체 단백질을 코팅된 모든 웰(10ng/웰)에 추가합니다.
    2. 실온에서 2시간 동안 반응이 일어나도록 합니다.
    3. 과량의 항원 용액을 제거하고 세척 완충액으로 플레이트를 5회 세척한다.
  4. 테스트 샘플 및 대조군의 적용
    1. 시험 샘플 (인간 혈청) 및 대조군 (참조 양성 및 음성 혈청)을 PBS-Tween 20에서 1/200, 1/400, 및 1/800으로 희석한다.
    2. 희석된 샘플 및 대조군 100μL를 적절한 웰에 추가합니다. 각 반응을 반복적으로 수행하십시오. 항원이나 혈청이 들어 있지 않은 우물을 공백으로 표시하십시오.
    3. 플레이트를 실온에서 90분 동안 인큐베이션한 후, 혈청 용액을 제거하고 세척 완충액으로 플레이트를 5회 세척하였다.
  5. 효소 접합 검출 항체의 응용
    1. 효소-접합된 검출 항체, HRP-접합된 항-토끼, 및 항-인간 IgG를 PBS-Tween 20에서 1/10,000으로 희석한다.
    2. 각 웰에 적절하게 희석된 검출 항체 100 μL를 피펫팅한다.
    3. 플레이트를 암실에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 결합되지 않은 검출 항체를 제거하고 세척 완충액으로 플레이트를 5회 세척하였다.
  6. 탐지 및 데이터 분석
    1. 100μL의 3,3',5,5' 테트라메틸-벤지딘(TMB) 발색원 용액을 추가하여 항원-항체 결합을 시각화합니다.
    2. 플레이트를 실온에서 30분 동안 현상시킨 다음 100μL의 정지 용액(7.5%H2SO4)을 추가하여 효소 반응을 중지시킵니다.
    3. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450nm 파장에서 흡광도를 읽고 양성 지수(IP) 계산을 기반으로 결과를 정렬합니다.
      IP = 시험된 혈청의 흡광도 / 컷오프의 흡광도
      IP < 0.7: 음성 결과
      IP = 0.7: 2주 이내에 테스트를 반복해야 합니다.
      IP > 0.7: 긍정적인 결과
      참고 : IP 공식은 실험실에서 구상되며 0.7 값은 최적화 후에 설정됩니다. 중복 반응의 경우 흡광도의 평균값이 계산됩니다. 최적의 혈청 희석 및 항원 농도는 ELISA 바둑판 적정 방법에 의해 확립됩니다 (데이터는 표시되지 않음). 컷오프 값 = 기준 양성 혈청의 OD(광학 밀도)(샘플과 동일한 희석으로 희석됨). 이 OD는 음성 대조군의 OD 값보다 적어도 3배 높아야 한다.

3. ELISA 이후 단계: 결과 평가 및 테스트 검증

  1. 검사된 환자에서 M. pneumoniae 감염을 특이적으로 진단하는 사내 ELISA의 능력은 M. pneumoniae 및 이종 박테리아의 항원을 사용하는 보충 면역 블롯을 통해 평가되어 M. pneumoniae 항체에서 테스트된 인간 혈청의 양성성과 다른 의심되는 박테리아에서의 음성성을 확인합니다(데이터는 표시되지 않음).

결과

이종 박테리아에 대한 흡착되지 않은 다클론 마이코플라스마 폐렴 항혈청의 면역블로팅 활성
교차 반응은 면역블로팅 결과(그림 2)에서 입증된 바와 같이 실제로 존재하며 양성 대조군(레인 1)과 비교하여 일부 M. pneumoniae 항원은 선별된 박테리아와 공유됩니다. 이러한 교차 반응의 강도는 다양했습니다. 예를 들어, M. ...

토론

이 백서는 주로 특정 스크리닝을 보장하기 위해 개발된 사내 ELISA에 대한 일반적인 설명을 제공합니다. M. pneumoniae 감염. ELISA 분석 자체의 프로토콜과 일부 전처리 및 후처리 단계에 대한 세부 정보가 제공됩니다. 이 분석의 특이성은 흡착 기술에 의해 보장됩니다. 이 절차는 이전에 인간 및 조류 진단을 위해 개발 된 ELISA 검사에서 설명되었습니다. Mycoplasmas17,

공개

저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.

감사의 말

이 연구는 튀니지 보건부와 튀니지 고등 교육 및 과학 연구부의 자금 지원을 받았습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
4-chloro-1-naphtolSigma-AldrichC6788-50 TAB
Bacto peptoneBD211677
Bacto tryptoneBD211705
Bovine serum albuminSigma-AldrichA9647-50 G
Carbonate bicarbonate bufferSigma-AldrichC3041-50 Cap
CaseinSigma-AldrichC7078-1 KG
CMRL1066 VWRP0058-N1L
D-GlucoseSigma-AldrichG7528-1KG
Difco PPLO BrothBD255420Frey media
ELISA plate-ReaderMULTISKAN GO, Thermo ScientificRef: 51119200
Fetal bovine serumCapricorn ScientificFBS-12A
Goat peroxidase-conjugated anti-human IgGAbcamab6759
Goat peroxidase-conjugated anti-rabbit IgGLife Technologies656120
Hydrochloric Acid 37%Prolab2025.290
Hydrogen peroxide (H2O2), solution 30%ScharlauHI01361000
L-argininSigma-AldrichA5006-1KG
LB brothPrepared in Pasteur Institute of TunisProvided by the laboratory of bacteriology of the Pasteur Institute of Tunis
Mycoplasma pneumoniae polyclonal antiserum produced in rabbitProduced in Pasteur Institute of TunisSerum was produced by rabbit immunization at the Pasteur Institute of Tunis
Nicotinamide adenine dinucleotideSigma-AldrichN7004-10G
Nunc Maxisorp flat-bottom 96-well microtiter plate Invitrogen44-2404-21
Penicillin G sodium (1 MIU)PANPHARMA
Phenol redfluka chemika77660
Skim milkMP Biomedicals902887
Sodium bicarbonate Sigma-AldrichS6297-1KG
Sodium carbonateSigma-AldrichS7795-1KG
Sodium chloride (NaCl)NovachimPS02805
Sulfuric acid (H2SO4) 95-97%Merck1007311011
ThimerosalUSB22215
TMB substrate (3,3’, 5,5’ TetraMethyl-Benzidine solution)Abcamab142042
Trizma baseSigma-AldrichT6791-1 KG
Tween 20Sigma-Aldrich1379-500 ML
Yeast extract, powder, UltrapureThermo Scientific J23547 

참고문헌

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