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  • Déclarations de divulgation
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  • matériels
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  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Dans l’infection à Mycoplasma pneumoniae, les tests sérologiques peuvent générer de bons résultats, mais avec une faible spécificité en raison de la réaction immunologique croisée. Le test ELISA interne de capture d’antigènes, décrit dans cet article, garantit une spécificité élevée de l’espèce et s’est avéré être un test de dépistage fiable pour un diagnostic précis de M. pneumoniae.

Résumé

Mycoplasma pneumoniae est un procaryote déficient de la paroi cellulaire, principalement connu pour coloniser les voies respiratoires humaines et être endémique, avec des pics épidémiques tous les 6 ans, chez les enfants plus âgés et les jeunes adultes. Le diagnostic de M. pneumoniae est difficile en raison de la nature fastidieuse de l’agent pathogène et de la possibilité d’un portage asymptomatique. Le diagnostic en laboratoire de l’infection à M. pneumoniae basé sur le titrage des anticorps dans les échantillons de sérum des patients reste la méthode la plus pratiquée. En raison du problème potentiel de réactivité immunologique croisée avec l’utilisation de sérum polyclonal pour M. pneumoniae, un test immuno-enzymatique de capture d’antigènes (ELISA) a été développé pour améliorer la spécificité du diagnostic sérologique. Les plaques ELISA sont recouvertes d’anticorps polyclonaux contre M. pneumoniae, élevés chez le lapin et rendus spécifiques après adsorption contre un panel de bactéries hétérologues qui partagent des antigènes avec des espèces de M. pneumoniae et/ou sont connues pour coloniser les voies respiratoires . Les antigènes homologues de M. pneumoniae ayant réagi sont alors spécifiquement reconnus par leurs anticorps correspondants dans les échantillons de sérum. L’optimisation ultérieure des paramètres physico-chimiques auxquels l’ELISA de capture d’antigènes est soumis a conduit à un ELISA hautement spécifique, sensible et reproductible.

Introduction

Les mycoplasmes sont parmi les procaryotes connus les plus petits et les plus simples. Elles se distinguent principalement des autres bactéries par l’absence de structure de paroi cellulaire. Ainsi, les mycoplasmes ont été classés dans une classe distincte appelée Mollicutes1. La déficience de la paroi cellulaire confère une résistance intrinsèque à ces micro-organismes contre certains agents antimicrobiens et est en grande partie responsable de leur polymorphisme. Les mycoplasmes ont un génome restreint et une taille réduite, ce qui limite leurs capacités métaboliques et biosynthétiques et explique leur nature parasitaire et saprophyte1.

Mycoplasma pneumoniae est l’un des mycoplasmes qui infectent l’homme et est considéré comme le plus virulent2. M. pneumoniae colonise les voies respiratoires supérieures, entraînant une pneumonie atypique chez les enfants et les jeunes adultes. Les signes cliniques engendrés par l’infection à M. pneumoniae sont pseudo-grippaux, avec maux de tête, fièvre et toux3. La cytadhésion de M. pneumoniae aux cellules hôtes est médiée par un organite de fixation comprenant une adhérence majeure P1 et plusieurs protéines accessoires 4,5. D’autres manifestations cliniques peuvent survenir en raison d’une inflammation locale et d’une stimulation du système immunitaire de l’hôte résultant de l’adhérence intime de M. pneumoniae à la muqueuse des voies respiratoires6. Bien que la pneumonie soit une caractéristique de l’infection à M. pneumoniae, il a été révélé que l’infection par cette bactérie peut également être responsable d’un large éventail de manifestations non pulmonaires dans différents sites anatomiques tels que le système nerveux central, le cœur, la peau et les articulations7.

Comme pour toutes les espèces de Mycoplasma, le diagnostic de M. pneumoniae est difficile. Les signes cliniques évoquant la mycoplasmose sont pour la plupart inapparents et non caractéristiques8. Comme il est très difficile de diagnostiquer l’infection à M. pneumoniae en se fiant uniquement aux manifestations cliniques et aux symptômes, le dépistage en laboratoire présente un intérêt particulier9. La détection des colonies de M. pneumoniae par culture est la méthode de référence pour un diagnostic approprié. Cependant, les exigences de croissance fastidieuses et le long temps nécessaire pour obtenir des résultats définitifs (1-2 semaines) compliquent la culture, et signifie donc qu’elle est rarement utilisée pour le diagnostic de routine10. Les technologies d’amplification des acides nucléiques ont été validées en termes de rapidité et d’efficacité, bien qu’en raison de leur coût relativement élevé et de leur indisponibilité dans certains établissements de soins de santé, ces techniques moléculaires ne soient pas considérées comme des tests diagnostiques de première intention. Il est vrai que les tests PCR commerciaux sont largement utilisés pour diagnostiquer les infections à M. pneumoniae, mais ils ne peuvent toujours pas remplacer la sérologie. En outre, l’occurrence fréquente de résultats faussement négatifs et faux positifs a limité l’utilisation de la PCR9. Systématiquement, la sérologie reste la plus pratiquée dans les laboratoires pour le diagnostic de l’infection à M. pneumoniae. Plusieurs approches sérologiques ont été rapportées depuis des décennies, telles que les hémagglutinines froides, le test de fixation du complément 11, le test d’hémagglutination indirecte12, l’immunofluorescence 13 et la technologie ELISA, qui a été appliquée pour la première fois à la sérologie des mycoplasmes au début des années1980 14,15,16. L’un des principaux problèmes rencontrés lors de la réalisation du sérodiagnostic ELISA de l’infection à M. pneumoniae est les réactions croisées, ce qui réduit considérablement la spécificité de la technique. L’adsorption non spécifique de sérums humains avec des antigènes de M. pneumoniae a déjà été signalée; en fait, bon nombre des anticorps détectés par ELISA dans les sérums humains ne sont pas toujours liés aux antigènes mycoplasmiques 17, en raison de la similitude de M. pneumoniae avec certaines bactéries18,19 et certains tissus animaux et humains20.

En raison des lectures de fond élevées observées dans le test ELISA conventionnel pratiqué en laboratoire, l’interprétation des résultats était souvent compliquée et, par conséquent, la délivrance d’un diagnostic correct de M. pneumoniae était une tâche difficile. Face à ce problème, nous avons choisi d’améliorer le test ELISA de M. pneumoniae en supprimant les réactions non spécifiques des antigènes de M. pneumoniae avec des anticorps à tester. À cette fin, nous avons travaillé sur la déplétion sélective des antigènes non spécifiques de M. pneumoniae en utilisant la technique d’adsorption. En fait, l’objectif principal du test ELISA de capture d’antigènes est de détecter spécifiquement l’immunoglobuline (Ig) G de M. pneumoniae dans des échantillons de sérum humain. Le concept de ce test ELISA consiste principalement en la capture sélective d’antigènes spécifiques de M. pneumoniae, avant l’ajout des échantillons de sérum humain. Cette sélectivité est assurée par l’incubation de l’antigène brut M. pneumoniae avec un antisérum polyclonal M. pneumoniae, produit chez le lapin en laboratoire et en le rendant spécifique à l’espèce par adsorption contre un panel de bactéries hétérologues, appartenant ou non à la classe des Mollicutes, partageant des antigènes avec M. pneumoniae espèces et/ou connues pour coloniser les voies respiratoires. La procédure d’adsorption a été répétée trois fois et son efficacité à éliminer la réactivité croisée a été testée par immunobuvardage. Le test ELISA développé est une combinaison d’ELISA sandwich et indirect. Brièvement, les puits de la plaque ELISA sont d’abord recouverts d’un antisérum polyclonal spécifique à M. pneumoniae. Ensuite, l’antigène M. pneumoniae est ajouté et piégé entre l’antisérum et les anticorps présents dans l’échantillon de sérum à tester. Le complexe immunologique formé est détecté par un anticorps secondaire conjugué à l’enzyme (IgG conjuguées à la peroxydase). Les réactions sont visualisées par l’ajout de substrat chromogène et l’absorbance est mesurée par spectrophotométrique. Ce test ELISA interne est présenté schématiquement à la figure 1. Le test ELISA maison s’est avéré efficace pour détecter spécifiquement l’infection à M. pneumoniae et est actuellement l’un des tests les plus pratiqués dans l’activité diagnostique de routine.

Protocole

La présente étude a été menée conformément aux aspects éthiques établis par le comité d’éthique de l’Institut Pasteur de Tunis.

1. Étapes pré-ELISA : Prérequis et prétraitement

  1. Souches bactériennes et milieux de croissance
    REMARQUE : Les espèces de mollicutes et les bactéries à paroi utilisées dans la présente étude ainsi que leurs milieux de croissance sont énumérés dans le tableau 1.
    1. Croissance des espèces de Mollicutes
      1. Inoculer 200 μL du stock de glycérol de chaque espèce dans 1 800 μL du milieu.
      2. Cultiver les espèces de Mollicutes statiquement à 37 °C avec 5% de CO 2 pendant2-4 jours jusqu’à ce qu’un changement de pH soit observé (l’indicateur de pH est rouge de phénol).
      3. Augmenter les cultures à 10 mL en ajoutantune dilution de 1/10e de la culture dans le milieu et leur permettre de repousser dans les mêmes conditions.
        NOTE: Selon le métabolisme, certaines espèces humaines de Mollicutes (M. pneumoniae, M. genitalium et M. fermentans) acidifient le milieu en raison de la fermentation du glucose, et d’autres (M. hominis et Ureaplasma) alcalinisent le milieu par hydrolyse de l’arginine ou hydrolyse de l’urée, respectivement. En ce qui concerne les mycoplasmes aviaires, l’acidification du milieu de Frey démontre la présence de M. gallisepticum, tandis que son alcalinisation prouve la croissance de M. imitans.
      4. Étaler 50 μL des cultures sur des plaques de gélose pour confirmer la croissance de la bactérie. Maintenir les plaques de gélose à 37 °C avec 5% de CO2 et les observer régulièrement au microscope pour l’apparition de colonies typiques d’œufs au plat (mycoplasmes) et de colonies d’oursins foncés (Ureaplasmas).
    2. Croissance des espèces non-Mollicutes
      1. Culture des bactéries non mollicites dans 3 mL du milieu à 37 °C pendant une nuit (agitation à 200 tr/min).
      2. Comparer la turbidité des cultures avec le milieu témoin pour confirmer la croissance.
      3. Augmenter les cultures à 10 mL en ajoutantune dilution de 1/100e de la culture dans le milieu et leur permettre de repousser dans les mêmes conditions.
  2. Préparation de l’antigène
    1. Préparation d’antigènes d’espèces de Mollicutes
      1. Récolter les protéines entières (présentes dans les cultures confirmées de M. pneumoniae et des autres espèces de Mollicutes) par centrifugation à 40 000 x g à 4 °C pendant 30 min.
      2. Jeter le surnageant et laver les pastilles trois fois avec 1 mL de 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4) par une série de trois centrifugations dans les mêmes conditions.
      3. Remettez chaque antigène en suspension dans 500 μL de PBS.
    2. Préparation d’antigènes d’espèces non Mollicutes
      1. Centrifuger les cultures cultivées pendant la nuit des bactéries non-Mollicutes à 1 500 x g pendant 15 minutes.
      2. Remettez chaque pastille bactérienne en suspension dans 500 μL de PBS.
        NOTE: La concentration en protéines est déterminée à l’aide de la méthode classique de quantification de Bradford avec l’albumine sérique bovine comme norme21. La concentration en protéines des espèces de Mollicutes varie habituellement entre 0,7 et 4,8 mg/mL. Pour les autres espèces bactériennes, la concentration en protéines peut atteindre 20 mg/mL. Tous les antigènes sont conservés à -20 °C jusqu’à leur utilisation ultérieure.
  3. Criblage de réactivité croisée par immunoblot
    1. Dénaturer les protéines bactériennes en mélangeant 8 μL de chaque antigène avec un volume égal de tampon échantillon (0,5 M Tris-HCl; pH 6,8, 10% glycérol [v/v], 10% SDS [p/v] et 0,2% bleu de bromophénol), incuber le mélange à 100 °C pendant 5 min.
      REMARQUE: La dénaturation est effectuée pour couvrir les protéines de charge négative et pour briser leurs structures secondaires, ce qui leur permet de traverser le gel de polyacrylamide et d’être séparées en fonction de leur poids moléculaire.
    2. Soumettre les protéines dénaturées (100 μg de protéines/puits) à l’électrophorèse sur gel dodécylsulfate-polyacrylamide de sodium (SDS-PAGE) par la méthode 22 de Laemmli avec12 % de gel de séparation et 5% de gel empilable. Après cela, transférer les protéines par électrophorétie sur la membrane de nitrocellulose par la méthode23 de Towbin et al.
    3. Immerger la membrane de nitrocellulose dans du lait écrémé à 5 % dans du PBS pendant 30 minutes pour bloquer les surfaces inoccupées. Incuber les transferts de protéines à température ambiante pendant 2 h avec l’antisérum polyclonal de lapin M. pneumoniae (produit à l’Institut Pasteur de Tunis) dilué à 1/200 dans du PBS-Tween 20, puis avec des IgG anti-lapin conjuguées à la peroxydase de raifort (HRP) diluées à 1/2 000 dans PBS-Tween 20 pendant 1 h à température ambiante.
    4. Laver les anticorps non liés avec du PBS et obtenir les résultats en exposant la feuille de nitrocellulose à la solution de substrat (4-chloro-1-naphtol,H2O2). Arrêtez la réaction en ajoutant de l’eau après 5-15 min.
  4. Procédure d’adsorption
    NOTE: Pour éliminer les réactions croisées entre l’antisérum polyclonal M. pneumoniae et les antigènes de bactéries hétérologues, la procédure d’adsorption précédemment décrite par Ben Abdelmoumen et Roy24 est utilisée.
    1. Préparer un pool d’antigènes des 12 bactéries hétérologues (suspectées de partager des antigènes avec M. pneumoniae), le mélanger dans un tube de microcentrifugation et ajuster la concentration en protéines correspondant à la moitié de l’antisérum à adsorber dans l’expérience.
      NOTE: Le volume et la concentration varient entre les différents essais. Cette étape dépend principalement de la concentration de l’anticorps à adsorber. Par exemple, si la concentration d’anticorps = 3,56 mg/mL, la concentration du pool d’antigènes (composé des 12 bactéries hétérologues) devrait être de 1,78 mg/mL (donc environ 0,148 mg de chaque antigène).
    2. Centrifuger le mélange d’antigènes à 14 000 x g pendant 10 min à 4 °C, recueillir la pastille groupée et l’incuber avec les IgG polyclonales purifiées anti-M. pneumoniae pendant 2 h à 37 °C avec agitation lente.
    3. Après incubation, centrifuger la suspension à 14 000 x g pendant 10 min à 4 °C et récupérer le surnageant (qui correspond au polyclonal spécifique M . pneumoniae antisérum).
      NOTE: Pour assurer la spécificité de l’antisérum polyclonal M. pneumoniae , répétez la procédure d’adsorption trois fois. Avant de pouvoir être utilisé dans le test ELISA, l’antisérum polyclonal M. pneumoniae adsorbé doit être testé par immunoblot pour l’absence de réactions croisées contre l’ensemble de bactéries inclus.

2. Étapes ELISA : le test lui-même

  1. Revêtement de microplaques avec l’anticorps de capture
    1. Diluer l’anticorps de capture (antisérum polyclonal pré-adsorbé par M. pneumoniae ) à une concentration de 10 μg/mL dans un tampon carbonate-bicarbonate 0,1 M (pH 9,6).
    2. Enduire la plaque ELISA de 96 puits en ajoutant 100 μL d’anticorps de capture dilué à chaque puits.
    3. Après une nuit d’incubation à 4 °C, retirer la solution d’enrobage et laver la plaque cinq fois avec le tampon de lavage (composition [par L]: 146,29 g de NaCl, 39,4 g de Tris-HCl, 0,2 g de Thimérosal et 0,5 mL de Tween 20; pH 7,3).
  2. Bloquant
    1. Bloquer les surfaces de liaison restantes des puits revêtus en ajoutant 100 μL de solution de blocage (0,5 % de caséine dans PBS) à chaque puits.
    2. Incuber pendant 1 h à température ambiante.
    3. Retirez la solution bloquante à l’aide d’une pipette et lavez la plaque cinq fois avec le tampon de lavage.
  3. Application de l’antigène
    1. Ajouter une quantité égale de protéines entières de M. pneumoniae à tous les puits enrobés (10 ng/puits).
    2. Laisser la réaction se produire pendant 2 h à température ambiante.
    3. Retirez l’excès de solution antigénique et lavez la plaque cinq fois avec le tampon de lavage.
  4. Application des échantillons d’essai et des témoins
    1. Diluer les échantillons d’essai (sérums humains) et les témoins (sérums de référence positifs et négatifs) à 1/200, 1/400 et 1/800 dans PBS-Tween 20.
    2. Ajouter 100 μL des échantillons dilués et des témoins dans les puits appropriés. Effectuez chaque réaction en double. Marquez les puits ne contenant ni antigène ni sérum comme étant vides.
    3. Après avoir incubé la plaque pendant 90 min à température ambiante, retirez les solutions de sérum et lavez la plaque cinq fois avec le tampon de lavage.
  5. Application de l’anticorps de détection conjugué enzymatique
    1. Diluer les anticorps de détection conjugués enzymatiques, l’anticorps anti-lapin conjugué HRP et les IgG anti-humains à 1/10 000 dans PBS-Tween 20.
    2. Pipeter 100 μL de l’anticorps de détection dilué de manière appropriée à chaque puits.
    3. Après avoir incubé la plaque pendant 1 h à température ambiante dans l’obscurité, retirez les anticorps de détection non liés et lavez la plaque cinq fois avec le tampon de lavage.
  6. Détection et analyse des données
    1. Ajouter 100 μL de la solution chromogène 3,3', 5,5' tétraméthylbenzidine (TMB) pour visualiser la liaison antigène-anticorps.
    2. Laisser la plaque se développer pendant 30 min à température ambiante puis ajouter 100 μL de la solution stop (7,5%H2SO4) pour arrêter la réaction enzymatique.
    3. Lire l’absorbance à une longueur d’onde de 450 nm à l’aide du lecteur de microplaques et trier les résultats en fonction du calcul de l’indice de positivité (IP).
      IP = Absorbance du sérum testé / Absorbance du seuil
      IP < 0.7 : Résultat négatif
      IP = 0,7 : Le test doit être répété dans les 2 semaines
      IP > 0.7 : Résultat positif
      REMARQUE: La formule IP est conçue en laboratoire et la valeur 0.7 est configurée après optimisation. Pour les réactions en double, la valeur moyenne de l’absorbance est calculée. La dilution sérique optimale et la concentration d’antigène sont établies par la méthode de titrage en damier ELISA (données non présentées). Valeur seuil = DO (densité optique) d’un sérum positif de référence (dilué à la même dilution que l’échantillon). Cette DO doit être au moins trois fois supérieure à la valeur OD du témoin négatif.

3. Étapes post-ELISA : évaluation des résultats et validation des tests

  1. La capacité du test ELISA interne à diagnostiquer spécifiquement l’infection à M. pneumoniae chez les patients testés est évaluée par immunoblots supplémentaires utilisant des antigènes de M. pneumoniae et des bactéries hétérologues pour confirmer la positivité des sérums humains testés dans les anticorps de M. pneumoniae et leur négativité dans les autres bactéries suspectées (données non présentées).

Résultats

L’activité immunoblotting de l’antisérum polyclonal non adsorbé Mycoplasma pneumoniae contre les bactéries hétérologues
La réactivité croisée existe bel et bien comme le montrent les résultats de l’immunoblot (Figure 2) et par rapport au témoin positif (Lane 1), certains des antigènes de M. pneumoniae sont partagés avec les bactéries dépistées. L’intensité de ces réactions croisées était varia...

Discussion

Cet article présente une description générale d’un test ELISA interne principalement développé pour assurer un dépistage spécifique des M. pneumoniae Infection. Les détails sur le protocole du test ELISA lui-même ainsi que certaines étapes de pré et de post-traitement sont fournis. La spécificité de ce dosage est assurée par la technique d’adsorption. Cette procédure a déjà été décrite dans des tests ELISA développés pour le diagnostic des humains et des oiseaux. Mycoplasmas

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas d’intérêts concurrents.

Remerciements

Cette étude a été financée par le ministère tunisien de la Santé et le ministère tunisien de l’Enseignement supérieur et de la Recherche scientifique.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
4-chloro-1-naphtolSigma-AldrichC6788-50 TAB
Bacto peptoneBD211677
Bacto tryptoneBD211705
Bovine serum albuminSigma-AldrichA9647-50 G
Carbonate bicarbonate bufferSigma-AldrichC3041-50 Cap
CaseinSigma-AldrichC7078-1 KG
CMRL1066 VWRP0058-N1L
D-GlucoseSigma-AldrichG7528-1KG
Difco PPLO BrothBD255420Frey media
ELISA plate-ReaderMULTISKAN GO, Thermo ScientificRef: 51119200
Fetal bovine serumCapricorn ScientificFBS-12A
Goat peroxidase-conjugated anti-human IgGAbcamab6759
Goat peroxidase-conjugated anti-rabbit IgGLife Technologies656120
Hydrochloric Acid 37%Prolab2025.290
Hydrogen peroxide (H2O2), solution 30%ScharlauHI01361000
L-argininSigma-AldrichA5006-1KG
LB brothPrepared in Pasteur Institute of TunisProvided by the laboratory of bacteriology of the Pasteur Institute of Tunis
Mycoplasma pneumoniae polyclonal antiserum produced in rabbitProduced in Pasteur Institute of TunisSerum was produced by rabbit immunization at the Pasteur Institute of Tunis
Nicotinamide adenine dinucleotideSigma-AldrichN7004-10G
Nunc Maxisorp flat-bottom 96-well microtiter plate Invitrogen44-2404-21
Penicillin G sodium (1 MIU)PANPHARMA
Phenol redfluka chemika77660
Skim milkMP Biomedicals902887
Sodium bicarbonate Sigma-AldrichS6297-1KG
Sodium carbonateSigma-AldrichS7795-1KG
Sodium chloride (NaCl)NovachimPS02805
Sulfuric acid (H2SO4) 95-97%Merck1007311011
ThimerosalUSB22215
TMB substrate (3,3’, 5,5’ TetraMethyl-Benzidine solution)Abcamab142042
Trizma baseSigma-AldrichT6791-1 KG
Tween 20Sigma-Aldrich1379-500 ML
Yeast extract, powder, UltrapureThermo Scientific J23547 

Références

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