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Neste Artigo

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Resumo

Na infecção por Mycoplasma pneumoniae, os exames de sorologia podem gerar bons resultados, porém com baixa especificidade devido à reação cruzada imunológica. O ELISA interno de captura de antígenos, descrito neste artigo, garante alta especificidade de espécies e tem se mostrado um teste de triagem confiável para o diagnóstico preciso de M. pneumoniae.

Resumo

O Mycoplasma pneumoniae é um procariota deficiente em parede celular, conhecido principalmente por colonizar o trato respiratório humano e ser endêmico, com picos epidêmicos a cada 6 anos, em crianças mais velhas e adultos jovens. O diagnóstico de M. pneumoniae é um desafio devido à natureza fastidiosa do patógeno e à possibilidade de transporte assintomático. O diagnóstico laboratorial da infecção por M. pneumoniae com base na titulação de anticorpos nas amostras de soro dos pacientes continua sendo o método mais praticado. Devido ao potencial problema de reatividade cruzada imunológica com o uso de soro policlonal para M. pneumoniae, um ensaio imunoenzimático de captura de antígenos (ELISA) foi desenvolvido para melhorar a especificidade do diagnóstico sorológico. As placas ELISA são revestidas com anticorpos policlonais de M. pneumoniae, criadas em coelhos e tornadas específicas após adsorção contra um painel de bactérias heterólogas que compartilham antígenos com espécies de M. pneumoniae e/ou são conhecidas por colonizar o trato respiratório. Os antígenos homólogos de M. pneumoniae reagidos são então especificamente reconhecidos por seus anticorpos correspondentes nas amostras de soro. Uma otimização adicional dos parâmetros físico-químicos aos quais o ELISA de captura de antígeno é submetido levou a um ELISA altamente específico, sensível e reprodutível.

Introdução

Os micoplasmas estão entre os menores e mais simples procariontes conhecidos. Eles se distinguem principalmente de outras bactérias pela falta de uma estrutura de parede celular. Assim, os Mycoplasmas foram classificados em uma classe separada denominada Mollicutes1. A deficiência da parede celular confere resistência intrínseca a esses microrganismos contra alguns agentes antimicrobianos e é em grande parte responsável pelo seu polimorfismo. Os micoplasmas têm genoma pequeno e tamanho reduzido, o que limita suas capacidades metabólicas e biossintéticas e explica sua natureza parasitária e saprófita1.

O Mycoplasma pneumoniae é um dos Mycoplasmas que infectam o homem e acredita-se que seja o mais virulento2. M. pneumoniae coloniza o trato respiratório superior, levando a pneumonia atípica em crianças e adultos jovens. Os sinais clínicos engendrados pela infecção por M. pneumoniae são gripais, com cefaleia, febre e tosse3. A ciaderência de M. pneumoniae às células hospedeiras é mediada por uma organela de fixação que inclui a adesão maior de P1 e várias proteínas acessórias 4,5. Mais manifestações clínicas podem ocorrer devido à inflamação local e estimulação do sistema imunológico do hospedeiro resultante da adesão íntima de M. pneumoniae à mucosa das vias aéreas6. Embora a pneumonia seja uma característica da infecção por M. pneumoniae, tem sido revelado que a infecção por essa bactéria também pode ser responsável por um amplo espectro de manifestações não pulmonares em diferentes locais anatômicos, como sistema nervoso central, coração, pele e articulações7.

Como para todas as espécies de Mycoplasma, o diagnóstico de M. pneumoniae é desafiador. Os sinais clínicos que evocam micoplasmose são, em sua maioria, inaparentes e não característicos8. Como é muito difícil diagnosticar a infecção por M. pneumoniae baseando-se apenas em manifestações e sintomas clínicos, o rastreamento laboratorial é de particular interesse9. A detecção de colônias de M. pneumoniae por cultura é o método padrão-ouro para um diagnóstico adequado. No entanto, as necessidades de crescimento exigente e o longo tempo necessário para a entrega de resultados definitivos (1-2 semanas) complicam a cultura e, portanto, significam que ela raramente é usada para o diagnóstico de rotina10. As tecnologias de amplificação de ácido nucleico foram validadas em termos de velocidade e eficiência, embora devido ao seu custo relativamente alto e indisponibilidade em algumas unidades de saúde, essas técnicas moleculares não sejam consideradas testes diagnósticos de primeira linha. É verdade que os testes PCR comerciais são amplamente utilizados para diagnosticar infecções por M. pneumoniae, mas ainda não podem substituir a sorologia. Além disso, a ocorrência frequente de resultados falsos negativos e falsos positivos limitou o uso da PCR9. Rotineiramente, a sorologia continua sendo a mais praticada em laboratórios para o diagnóstico da infecção por M. pneumoniae. Várias abordagens sorológicas têm sido relatadas há décadas, como hemaglutininas frias, teste de fixação do complemento 11, teste de hemaglutinação indireta12, imunofluorescência 13 e a tecnologia ELISA, que foi aplicada pela primeira vez à sorologia para micoplasma no início da década de 198014,15,16. Um dos principais problemas encontrados ao realizar o sorodiagnóstico por ELISA da infecção por M. pneumoniae são as reações cruzadas, o que reduz consideravelmente a especificidade da técnica. A adsorção inespecífica de soros humanos com antígenos de M. pneumoniae foi previamente relatada; de fato, muitos dos anticorpos detectados pelo ELISA em soros humanos podem nem sempre estar ligados a antígenos micoplasmáticos 17, devido à semelhança de M. pneumoniae com algumas bactérias18,19 e alguns tecidos animais e humanos20.

Devido às altas leituras de fundo observadas no teste ELISA convencional que foi praticado em laboratório, a interpretação dos resultados foi muitas vezes complicada e, portanto, a entrega de um diagnóstico adequado de M. pneumoniae foi uma tarefa difícil. Ao enfrentar esse problema, optamos por melhorar o ELISA de M. pneumoniae removendo reações inespecíficas de antígenos de M. pneumoniae com anticorpos a serem testados . Para tanto, foi trabalhada a depleção seletiva dos antígenos inespecíficos de M. pneumoniae utilizando a técnica de adsorção. De fato, o principal objetivo do ELISA de captura de antígeno é detectar especificamente a imunoglobulina (Ig) G de M. pneumoniae em amostras de soro humano. O conceito deste ELISA consiste principalmente na captura seletiva de antígenos específicos de M. pneumoniae, antes da adição das amostras de soro humano. Esta seletividade é assegurada pela incubação do antígeno bruto de M. pneumoniae com um antissoro policlonal de M. pneumoniae, produzido em coelhos em laboratório e tornando-o espécie-específico por adsorção contra um painel de bactérias heterólogas, pertencentes ou não à classe Mollicus, compartilhando antígenos com M. pneumoniae espécies e/ou conhecidas por colonizar o trato respiratório. O procedimento de adsorção foi repetido três vezes, e sua eficiência para eliminar a reatividade cruzada foi testada por immunoblotting. O ensaio ELISA desenvolvido é uma combinação de sanduíche e ELISA indireto. Resumidamente, os poços da placa ELISA são primeiro revestidos com um antissoro policlonal específico para M. pneumoniae. Em seguida, o antígeno de M. pneumoniae é adicionado e preso entre o antissoro e os anticorpos presentes na amostra de soro a ser testada. O complexo imunológico formado é detectado por um anticorpo conjugado enzimático secundário (IgG conjugada com peroxidase). As reações são visualizadas pela adição de substrato cromogênico, e a absorbância é medida espectrofotometricamente. Esse ELISA interno é apresentado esquematicamente na Figura 1. O ELISA caseiro mostrou-se eficiente na detecção específica da infecção por M. pneumoniae e é atualmente um dos testes mais praticados na atividade diagnóstica de rotina.

Protocolo

O presente estudo foi realizado em conformidade com os aspectos éticos estabelecidos pelo comitê de ética do Instituto Pasteur de Túnis.

1. Etapas pré-ELISA: Pré-requisitos e pré-processamento

  1. Cepas bacterianas e meios de crescimento
    NOTA: As espécies de Mollicutes e as bactérias muradas utilizadas no presente estudo e seus meios de crescimento estão listados na Tabela 1.
    1. Crescimento de espécies de Mollicutes
      1. Inocular 200 μL do estoque de glicerol de cada espécie em 1.800 μL do meio.
      2. Cultivar espécies de Mollicutes estaticamente a 37 °C com 5% de CO 2 por2-4 dias até que uma mudança de pH seja observada (o indicador de pH é vermelho de fenol).
      3. Aumente as culturas para 10 mL adicionando uma diluição de 1/10da cultura ao meio e permita que elas cresçam novamente nas mesmas condições.
        NOTA: De acordo com o metabolismo, algumas espécies humanas de Mollicutes (M. pneumoniae, M. genitalium e M. fermentans) acidificam o meio devido à fermentação da glicose, e algumas outras (M. hominis e Ureaplasma) alcalinizam o meio por hidrólise de arginina ou hidrólise de ureia, respectivamente. Em relação aos micoplasmas aviários, a acidificação do meio de Frey demonstra a presença de M. gallisepticum, enquanto sua alcalinização comprova o crescimento de M. imitans.
      4. Espalhe 50 μL das culturas em placas de ágar para confirmar o crescimento das bactérias. Manter as placas de ágar a 37 °C com 5% de CO2 e observá-las regularmente ao microscópio para o aparecimento de colónias típicas de ovos fritos (Mycoplasmas) e colónias semelhantes a ouriços escuros (Ureaplasmas).
    2. Crescimento de espécies não-Mollicutes
      1. Cultivar as bactérias não-Mollicutes em 3 mL do meio a 37 °C durante a noite (agitação a 200 rpm).
      2. Compare a turbidez das culturas com os meios de controle para confirmar o crescimento.
      3. Aumente as culturas para 10 mL adicionando uma diluição de 1/100da cultura ao meio e permita que elas cresçam novamente nas mesmas condições.
  2. Preparação de antígenos
    1. Preparação de antígenos de espécies de Mollicutes
      1. Colher as proteínas inteiras (presentes em culturas confirmadas de M. pneumoniae e das outras espécies de Mollicutes) por centrifugação a 40.000 x g a 4 °C durante 30 min.
      2. Descarte o sobrenadante e lave os pellets três vezes com 1 mL de solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS, pH 7,4) por uma série de três centrifugações com as mesmas condições.
      3. Ressuspender cada antígeno em 500 μL de PBS.
    2. Preparação de antígenos de espécies não-Mollicutes
      1. Centrifugar as culturas cultivadas durante a noite das bactérias não-Mollicutes a 1.500 x g por 15 min.
      2. Ressuscite cada pellet bacteriano em 500 μL de PBS.
        NOTA: A concentração de proteína é determinada usando o método clássico de quantificação de Bradford com albumina sérica bovina como padrão21. A concentração de proteína das espécies de Mollicutes geralmente varia entre 0,7-4,8 mg/mL. Para as demais espécies bacterianas, a concentração de proteína pode chegar a 20 mg/mL. Todos os antigénios são armazenados a -20 °C até à sua utilização subsequente.
  3. Rastreio de reatividade cruzada por immunoblotting
    1. Desnaturar as proteínas bacterianas misturando 8 μL de cada antígeno com um volume igual de tampão de amostra (0,5 M Tris-HCl; pH 6,8, 10% de glicerol [v/v], 10% de SDS [p/v] e 0,2% de azul de bromofenol), incubar a mistura a 100 °C por 5 min.
      NOTA: A desnaturação é realizada para cobrir as proteínas com carga negativa e quebrar suas estruturas secundárias, o que lhes permite atravessar o gel de poliacrilamida e ser separados de acordo com seus pesos moleculares.
    2. Submeter as proteínas desnaturadas (100 μg de proteína/poço) à eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE) pelo método de Laemmli 22 com gel separador a12 % e gel empilhador a 5%. Em seguida, transferir as proteínas eletroforeticamente para a membrana de nitrocelulose pelo método de Towbin et al.23.
    3. Mergulhe a membrana de nitrocelulose em leite desnatado a 5% em PBS por 30 min para bloquear as superfícies desocupadas. Incubar as manchas de proteína à temperatura ambiente durante 2 h com antissoro policlonal de coelho M. pneumoniae (produzido no Instituto Pasteur de Tunes) diluído a 1/200 em PBS-Tween 20, depois com IgG anti-coelho conjugada com peroxidase de rábano (HRP) diluída a 1/2.000 em PBS-Tween 20 durante 1 h à temperatura ambiente.
    4. Lavar os anticorpos não ligados com PBS e obter os resultados expondo a folha de nitrocelulose à solução de substrato (4-cloro-1-naftol, H 2 O2). Pare a reação adicionando água após 5-15 min.
  4. Procedimento de adsorção
    NOTA: Para eliminar as reações cruzadas entre o antissoro policlonal de M. pneumoniae e antígenos de bactérias heterólogas, o procedimento de adsorção descrito anteriormente por Ben Abdelmoumen e Roy24 é empregado.
    1. Preparar um pool de antígenos das 12 bactérias heterólogas (suspeitas de compartilhar antígenos com M. pneumoniae), misturá-lo em um tubo de microcentrífuga e ajustar a concentração de proteína correspondente à metade do antissoro a ser adsorvido no experimento.
      NOTA: O volume e a concentração variam entre os diferentes ensaios. Esta etapa depende principalmente da concentração do anticorpo a ser adsorvido. Por exemplo, se a concentração de anticorpos = 3,56 mg/mL, a concentração do pool de antígenos (composto pelas 12 bactérias heterólogas) deve ser de 1,78 mg/mL (portanto, aproximadamente 0,148 mg de cada antígeno).
    2. Centrifugar a mistura de antigénios a 14.000 x g durante 10 min a 4 °C, recolher o pellet agrupado e incubá-lo com a IgG policlonal purificada anti-M. pneumoniae durante 2 h a 37 °C com agitação lenta.
    3. Após a incubação, centrifugar a suspensão a 14.000 x g durante 10 min a 4 °C e recuperar o sobrenadante (que corresponde ao antissoro policlonal específico de M. pneumoniae ).
      NOTA: Para garantir a especificidade do antissoro policlonal de M. pneumoniae , repita o procedimento de adsorção três vezes. Antes de poder ser usado no ensaio ELISA, o antissoro policlonal adsorvido de M. pneumoniae deve ser testado por imunoblotting para a ausência de reações cruzadas contra o conjunto incluído de bactérias.

2. Etapas ELISA: O ensaio em si

  1. Revestimento de microplacas com o anticorpo de captura
    1. Diluir o anticorpo de captura (antissoro policlonal pré-adsorvido de M. pneumoniae ) até uma concentração de 10 μg/mL em tampão carbonato-bicarbonato 0,1 M (pH 9,6).
    2. Revestir a placa ELISA de 96 poços adicionando 100 μL do anticorpo de captura diluído a cada poço.
    3. Após incubação durante a noite a 4 °C, retirar a solução de revestimento e lavar a placa cinco vezes com o tampão de lavagem (composição [por L]: 146,29 g de NaCl, 39,4 g de Tris-HCl, 0,2 g de timerosal e 0,5 mL de Tween 20; pH 7,3).
  2. Bloqueio
    1. Bloquear as superfícies de ligação restantes dos poços revestidos adicionando 100 μL da solução de bloqueio (0,5% de caseína em PBS) a cada poço.
    2. Incubar durante 1 h à temperatura ambiente.
    3. Retire a solução de bloqueio com uma pipeta e lave a placa cinco vezes com o tampão de lavagem.
  3. Aplicação do antigénio
    1. Adicione uma quantidade igual de proteínas inteiras de M. pneumoniae a todos os poços revestidos (10 ng / poço).
    2. Deixe a reação ocorrer por 2 h à temperatura ambiente.
    3. Retire o excesso da solução antigénica e lave a placa cinco vezes com o tampão de lavagem.
  4. Aplicação das amostras de ensaio e dos controlos
    1. Diluir as amostras de ensaio (soros humanos) e os controlos (soros positivos e negativos de referência) para 1/200, 1/400 e 1/800 em PBS-Tween 20.
    2. Adicionar 100 μL das amostras diluídas e dos controlos aos poços adequados. Realize cada reação em duplicata. Marque os poços que não contêm antígeno nem soros como em branco.
    3. Depois de incubar a placa por 90 min à temperatura ambiente, remova as soluções séricas e lave a placa cinco vezes com o tampão de lavagem.
  5. Aplicação do anticorpo de detecção conjugado enzimático
    1. Diluir os anticorpos de detecção conjugados enzimáticos, anticoelho conjugado com HRP e IgG anti-humana para 1/10.000 em PBS-Tween 20.
    2. Pipetar 100 μL do anticorpo de detecção adequadamente diluído para cada poço.
    3. Depois de incubar a placa por 1 h à temperatura ambiente no escuro, remova os anticorpos de detecção não ligados e lave a placa cinco vezes com o tampão de lavagem.
  6. Detecção e análise de dados
    1. Adicionar 100 μL da solução cromogénica Tetrametil-benzidina (TMB) de 3,3', 5,5' para visualizar a ligação antígeno-anticorpo.
    2. Deixar que a placa se desenvolva durante 30 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, adicionar 100 μL da solução de paragem (7,5% H2SO4) para parar a reacção enzimática.
    3. Leia a absorbância no comprimento de onda de 450 nm usando o leitor de microplacas e classifique os resultados com base no cálculo do índice de positividade (IP).
      IP = Absorvância do soro ensaiado / Absorvância do ponto de corte
      IP < 0.7: Resultado negativo
      IP = 0,7: O teste deve ser repetido dentro de 2 semanas
      IP > 0.7: Resultado positivo
      Observação : A fórmula IP é concebida no laboratório e o valor 0,7 é configurado após a otimização. Para reações duplicadas, calcula-se o valor médio da absorbância. A diluição sérica óptima e a concentração de antigénios são estabelecidas pelo método de titulação do tabuleiro de xadrez ELISA (dados não apresentados). Valor de corte = OD (densidade óptica) de um soro positivo de referência (diluído na mesma diluição que a amostra). Essa OD deve ser pelo menos três vezes maior do que o valor OD do controle negativo.

3. Etapas pós-ELISA: Avaliação dos resultados e validação do teste

  1. A capacidade do ELISA interno de diagnosticar especificamente a infecção por M. pneumoniae nos pacientes testados é avaliada por meio de imunoblots suplementares usando antígenos de M. pneumoniae e bactérias heterólogas para confirmar a positividade dos soros humanos testados em anticorpos contra M. pneumoniae e sua negatividade nas outras bactérias suspeitas (dados não mostrados).

Resultados

A atividade imunoblotting do antissoro policlonal não adsorvido Mycoplasma pneumoniae a bactérias heterólogas
A reatividade cruzada de fato existe, como mostrado nos resultados do immunoblotting (Figura 2) e, em comparação com o controle positivo (Lane 1), alguns dos antígenos de M. pneumoniae são compartilhados com as bactérias rastreadas. A intensidade dessas reações cruzadas foi variável. Por exemplo, os an...

Discussão

Este artigo apresenta uma descrição geral de um ELISA interno desenvolvido principalmente para garantir a triagem específica de M. pneumoniae Infeção. Os detalhes sobre o protocolo do ensaio ELISA em si, bem como algumas etapas de pré e pós-processamento são fornecidos. A especificidade deste ensaio é assegurada pela técnica de adsorção. Este procedimento foi previamente descrito em testes ELISA desenvolvidos para o diagnóstico de humanos e aves Mycoplasmas17,

Divulgações

Os autores declaram que não há interesses concorrentes.

Agradecimentos

Este estudo foi financiado pelo Ministério da Saúde da Tunísia e pelo Ministério do Ensino Superior e Investigação Científica da Tunísia.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
4-chloro-1-naphtolSigma-AldrichC6788-50 TAB
Bacto peptoneBD211677
Bacto tryptoneBD211705
Bovine serum albuminSigma-AldrichA9647-50 G
Carbonate bicarbonate bufferSigma-AldrichC3041-50 Cap
CaseinSigma-AldrichC7078-1 KG
CMRL1066 VWRP0058-N1L
D-GlucoseSigma-AldrichG7528-1KG
Difco PPLO BrothBD255420Frey media
ELISA plate-ReaderMULTISKAN GO, Thermo ScientificRef: 51119200
Fetal bovine serumCapricorn ScientificFBS-12A
Goat peroxidase-conjugated anti-human IgGAbcamab6759
Goat peroxidase-conjugated anti-rabbit IgGLife Technologies656120
Hydrochloric Acid 37%Prolab2025.290
Hydrogen peroxide (H2O2), solution 30%ScharlauHI01361000
L-argininSigma-AldrichA5006-1KG
LB brothPrepared in Pasteur Institute of TunisProvided by the laboratory of bacteriology of the Pasteur Institute of Tunis
Mycoplasma pneumoniae polyclonal antiserum produced in rabbitProduced in Pasteur Institute of TunisSerum was produced by rabbit immunization at the Pasteur Institute of Tunis
Nicotinamide adenine dinucleotideSigma-AldrichN7004-10G
Nunc Maxisorp flat-bottom 96-well microtiter plate Invitrogen44-2404-21
Penicillin G sodium (1 MIU)PANPHARMA
Phenol redfluka chemika77660
Skim milkMP Biomedicals902887
Sodium bicarbonate Sigma-AldrichS6297-1KG
Sodium carbonateSigma-AldrichS7795-1KG
Sodium chloride (NaCl)NovachimPS02805
Sulfuric acid (H2SO4) 95-97%Merck1007311011
ThimerosalUSB22215
TMB substrate (3,3’, 5,5’ TetraMethyl-Benzidine solution)Abcamab142042
Trizma baseSigma-AldrichT6791-1 KG
Tween 20Sigma-Aldrich1379-500 ML
Yeast extract, powder, UltrapureThermo Scientific J23547 

Referências

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