Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

בזיהום Mycoplasma pneumoniae, בדיקות סרולוגיות יכולות להניב תוצאות טובות, אך עם ספציפיות נמוכה בגלל תגובה צולבת אימונולוגית. ה- ELISA ללכידת אנטיגן פנימית, המתוארת במאמר זה, מבטיחה ספציפיות גבוהה של מינים והוכחה כבדיקת סינון אמינה לאבחון מדויק של M. pneumoniae.

Abstract

Mycoplasma pneumoniae הוא פרוקריוט חסר דופן התא, הידוע בעיקר כדי ליישב את דרכי הנשימה האנושיות להיות אנדמי, עם שיאי מגיפה כל 6 שנים, אצל ילדים גדולים יותר ומבוגרים צעירים. אבחון של M. דלקת ריאות הוא מאתגר בגלל האופי המהיר של הפתוגן ואת האפשרות של הובלה אסימפטומטית. אבחון מעבדה של זיהום M. דלקת ריאות המבוססת על טיטרציה נוגדנים בדגימות סרום של חולים נשאר השיטה המתורגלת ביותר. בגלל הבעיה הפוטנציאלית של תגובתיות צולבת אימונולוגית עם שימוש בסרום פוליקלונלי עבור M. pneumoniae, פותחה בדיקה אימונוסורבנטית הקשורה לאנזים לכידת אנטיגן (ELISA) כדי לשפר את הספציפיות של אבחון סרולוגי. לוחות ELISA מצופים בנוגדנים פוליקלונליים של M. pneumoniae, מגודלים בארנבות ומעובדים ספציפית לאחר ספיחה כנגד פאנל של חיידקים הטרולוגיים החולקים אנטיגנים עם מיני M. pneumoniae ו / או ידועים כמתיישבים בדרכי הנשימה. האנטיגנים ההומולוגיים M. pneumoniae שהגיבו מזוהים באופן ספציפי על ידי הנוגדנים המתאימים להם בדגימות הסרום. אופטימיזציה נוספת של הפרמטרים הפיסיקוכימיים שאליהם נתונה ELISA ללכידת אנטיגן הובילה ל- ELISA ספציפי מאוד, רגיש וניתן לשחזור.

Introduction

מיקופלסמות הן בין הפרוקריוטים הקטנים והפשוטים ביותר הידועים. הם נבדלים בעיקר מחיידקים אחרים על ידי היעדר מבנה דופן התא. לפיכך, מיקופלסמות סווגו בכיתה נפרדת בשם Mollicutes1. מחסור בדופן התא מקנה עמידות פנימית למיקרואורגניזמים אלה נגד כמה חומרים אנטי מיקרוביאליים והוא אחראי במידה רבה לפולימורפיזם שלהם. למיקופלסמות יש גנום קטן וגודל מוקטן, מה שמגביל את היכולות המטבוליות והביוסינטטיות שלהן ומסביר את האופי הטפילי והספרופיטי שלהן1.

מיקופלסמה דלקת ריאות היא אחת המיקופלסמות שמדביקות את האדם ונחשבת לארסיתביותר 2. M. דלקת ריאות מאכלסת את דרכי הנשימה העליונות, מה שמוביל לדלקת ריאות לא טיפוסית אצל ילדים ומבוגרים צעירים. הסימנים הקליניים הנגרמים על ידי זיהום M. דלקת ריאות הם דמויי שפעת, עם כאבי ראש, חום ושיעול3. הציטדהרנות של M. pneumoniae לתאים מארחים מתווכת על ידי אברון התקשרות הכולל הידבקות P1 מז'ורית ומספר חלבונים נלווים 4,5. ביטויים קליניים נוספים עשויים להתרחש בגלל דלקת מקומית וגירוי של המערכת החיסונית המארחת הנובעת מהיצמדות אינטימית של M. דלקת ריאות לרירית דרכי הנשימה6. למרות שדלקת ריאות היא סימן היכר של זיהום M. pneumoniae, התגלה כי זיהום עם חיידק זה יכול גם להיות אחראי על ספקטרום רחב של ביטויים לא ריאתיים באתרים אנטומיים שונים כגון מערכת העצבים המרכזית, הלב, העור, המפרקים7.

באשר לכל מיני Mycoplasma, האבחנה של M. דלקת ריאות היא מאתגרת. הסימנים הקליניים המעוררים מיקופלסמוזיס הם לרוב בלתי נראים ולא אופייניים8. מכיוון שקשה מאוד לאבחן זיהום M. דלקת ריאות על ידי הסתמכות רק על ביטויים ותסמינים קליניים, בדיקת מעבדה מעניינת במיוחד9. איתור מושבות M. דלקת ריאות לפי תרבית הוא שיטת תקן הזהב לאבחון נכון. עם זאת, דרישות הצמיחה המהירות והזמן הארוך הדרוש למתן תוצאות סופיות (1-2 שבועות) מסבכים את התרבית, ולכן פירושה שהיא משמשת לעתים נדירות לאבחון שגרתי10. טכנולוגיות הגברה של חומצות גרעין אומתו במונחים של מהירות ויעילות, אם כי בגלל העלות הגבוהה יחסית שלהן וחוסר הזמינות בחלק ממתקני הבריאות, טכניקות מולקולריות אלה אינן נחשבות לבדיקות אבחון קו ראשון. זה נכון כי בדיקות PCR מסחריות נמצאים בשימוש נרחב כדי לאבחן זיהומים M. דלקת ריאות, אבל הם עדיין לא יכולים להחליף סרולוגיה. כמו כן, המופע התכוף של תוצאות חיוביות כוזבות ותוצאות חיוביות כוזבות הגביל את השימוש ב- PCR9. באופן שגרתי, סרולוגיה נשארת המיושמת ביותר במעבדות לאבחון של זיהום M. דלקת ריאות. מספר גישות סרולוגיות דווחו במשך עשרות שנים, כגון המגלוטינינים קרים, מבחן קיבוע משלים 11, מבחן המגלוטינציה עקיף 12, אימונופלואורסצנציה13, והטכנולוגיה של ELISA, אשר יושמה לראשונה על מיקופלסמה סרולוגיה בתחילת שנות השמונים14,15,16. אחת הבעיות העיקריות נתקלו בעת ביצוע ELISA serodiagnosis של זיהום M. דלקת ריאות היא תגובות צולבות, אשר מוריד במידה ניכרת את הספציפיות של הטכניקה. ספיחה לא ספציפית של סרה אנושית עם אנטיגנים של דלקת ריאות M. דווחה בעבר; למעשה, רבים מהנוגדנים שזוהו על ידי ELISA בסרה אנושית לא תמיד קשורים לאנטיגנים מיקופלסמליים 17, בשל המשותף של M. דלקת ריאות עם כמה חיידקים18,19 וכמה רקמות בעלי חיים ובני אדם20.

בגלל קריאות הרקע הגבוהות שנצפו במבחן ELISA הקונבנציונלי שהיה נהוג במעבדה, פרשנות התוצאות הייתה לעתים קרובות מסובכת, ולכן מתן אבחנה נכונה של M. דלקת ריאות הייתה משימה קשה. בעודנו מתמודדים עם בעיה זו, בחרנו לשפר את M. pneumoniae ELISA על ידי הסרת תגובות לא ספציפיות של אנטיגנים של M. דלקת ריאות עם נוגדנים להיבדק. לשם כך, עבדנו על דלדול סלקטיבי של האנטיגנים הלא ספציפיים של M. pneumoniae באמצעות טכניקת הספיגה. למעשה, המטרה העיקרית של לכידת אנטיגן ELISA היא לזהות באופן ספציפי M. דלקת ריאות אימונוגלובולין (Ig) G בדגימות סרום אנושי. הרעיון של ELISA זה מורכב בעיקר מלכידה סלקטיבית של אנטיגנים ספציפיים לדלקת ריאות M, לפני הוספת דגימות הסרום האנושיות. סלקטיביות זו מבוטחת על ידי דגירה של אנטיגן גולמי M. pneumoniae עם אנטיסרום פוליקלונלי M. pneumoniae, המיוצר בארנבות במעבדה והפיכתו למין ספציפי על ידי ספיחה נגד פאנל של חיידקים הטרולוגיים, השייכים או לא שייכים למעמד Mollicutes, חולקים אנטיגנים עם M. pneumoniae מינים ו/או ידועים כמתיישבים בדרכי הנשימה. הליך הספיחה חזר על עצמו שלוש פעמים, ויעילותו לביטול תגובתיות צולבת נבדקה על ידי אימונובלוטציה. מבחן ELISA שפותח הוא שילוב של סנדוויץ' ואליזה עקיפה. בקצרה, הבארות של צלחת ELISA מצופים תחילה עם אנטיסרום פוליקלונלי ספציפי M. דלקת ריאות. לאחר מכן, M. דלקת ריאות אנטיגן הוא הוסיף ולכוד בין antiserum ואת הנוגדנים הנמצאים בדגימת הסרום להיבדק. הקומפלקס האימונולוגי שנוצר מזוהה על ידי נוגדן מצומד אנזים משני (IgG מצומד פרוקסידאז). התגובות מוצגות על ידי תוספת של מצע כרומוגני, והספיגה נמדדת ספקטרופוטומטרית. ELISA פנימית זו מוצגת באופן סכמטי באיור 1. ה- ELISA הביתית הוכיחה את עצמה כיעילה באיתור ספציפי של זיהום M. pneumoniae והיא כיום אחת הבדיקות המתורגלות ביותר בפעילות אבחון שגרתית.

Protocol

המחקר הנוכחי נערך בהתאם להיבטים אתיים שנקבעו על ידי הוועדה האתית של מכון פסטר בתוניס.

1. שלבי טרום ELISA: תנאים מוקדמים ועיבוד מקדים

  1. זני חיידקים ומדיית גדילה
    הערה: מינים של מוליקוטים והחיידקים בעלי הקירות המשמשים במחקר הנוכחי ואמצעי הגדילה שלהם מפורטים בטבלה 1.
    1. גידול מינים של מוליקוטים
      1. לחסן 200 μL ממלאי הגליצרול של כל מין ב-1,800 μL של המדיה.
      2. לגדל מינים Mollicutes באופן סטטי ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 במשך2-4 ימים עד שינוי pH נצפה (מחוון pH הוא פנול אדום).
      3. הגדילו את התרבויות ל-10 מ"ל על ידי הוספת דילול של 1/10מהתרבות לתקשורת ואפשרו להן לצמוח שוב באותם תנאים.
        הערה: על פי חילוף החומרים, כמה מינים של Mollicutes אנושיים (M. דלקת ריאות, M. genitalium, ו- M. fermentans) חומציים את המדיום עקב תסיסת גלוקוז, וכמה אחרים (M. hominis ו Ureaplasma) אלקליניזציה של המדיום על ידי הידרוליזה של ארגינין או הידרוליזה של אוריאה, בהתאמה. לגבי מיקופלסמות של עופות, החמצה של המדיום של פריי מדגימה את נוכחותו של M. gallisepticum, בעוד אלקליניזציה שלה מוכיח את הצמיחה של M. imitans.
      4. להפיץ 50 μL של תרביות על צלחות אגר כדי לאשר את הצמיחה של החיידקים. שמרו על צלחות האגר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 וצפו בהן באופן קבוע מתחת למיקרוסקופ להופעת מושבות ביצים מטוגנות טיפוסיות (מיקופלסמות) ומושבות דמויות קיפודים כהים (Ureaplasmas).
    2. גידול מינים שאינם מוליקוטים
      1. תרבית את החיידקים שאינם מוליקוטים ב-3 מ"ל של המדיה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה (רועדת ב-200 סל"ד).
      2. השווה את העכירות של התרבויות עם אמצעי הבקרה כדי לאשר צמיחה.
      3. הגדל את התרבויות ל -10 מ"ל על ידי הוספת דילול של 1/100של התרבות לתקשורת ואפשר להן לצמוח שוב באותם תנאים.
  2. הכנת אנטיגן
    1. הכנת אנטיגן של מינים Mollicutes
      1. קציר החלבונים המלאים (הנמצאים בתרביות מאושרות של M. pneumoniae ושאר מיני Mollicutes) על ידי צנטריפוגה ב 40,000 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
      2. יש להשליך את הסופר-נאטנט ולשטוף את הכדורים שלוש פעמים עם 1 מ"ל של 1x מלח אפוץ פוספט (PBS, pH 7.4) על ידי סדרה של שלוש צנטריפוגות עם אותם תנאים.
      3. יש להשעות כל אנטיגן ב-500 μL של PBS.
    2. הכנת אנטיגן של מינים שאינם מוליקוטים
      1. צנטריפוגה של תרביות הלילה של חיידקים שאינם Mollicutes ב 1,500 x גרם במשך 15 דקות.
      2. יש להשהות כל כדור חיידקי ב-500 מיקרו-ליטר של PBS.
        הערה: ריכוז החלבון נקבע בשיטת הכמות הקלאסית של ברדפורד עם אלבומין בסרום בקר כסטנדרט21. ריכוז החלבון של מיני Mollicutes נע בדרך כלל בין 0.7-4.8 מ"ג/מ"ל. עבור זני החיידקים האחרים, ריכוז החלבון יכול להגיע ל-20 מ"ג/מ"ל. כל האנטיגנים מאוחסנים ב -20 מעלות צלזיוס עד השימוש הבא שלהם.
  3. בדיקת תגובתיות צולבת על ידי אימונובלוטינג
    1. נטרול חלבוני החיידקים על ידי ערבוב של 8 μL מכל אנטיגן עם נפח שווה של מאגר דגימה (0.5 M Tris-HCl; pH 6.8, 10% גליצרול [v/v], 10% SDS [w/v], ו-0.2% ברומופנול כחול), דגירה של התערובת בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
      הערה: דנטורציה מבוצעת כדי לכסות את החלבונים עם מטען שלילי ולשבור את המבנים המשניים שלהם, מה שמאפשר להם לרוץ על פני ג'ל פוליאקרילאמיד ולהיות מופרדים על פי משקלם המולקולרי.
    2. הכפיף את החלבונים שעברו דנטורציה (100 מיקרוגרם חלבון/באר) לנתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE) בשיטה של Laemmli22 עם 12 % ג'ל הפרדה וג'ל ערימה של 5%. לאחר מכן, העבירו את החלבונים באופן אלקטרופורטי לקרום הניטרוצלולוז בשיטה של Towbin et al.23.
    3. יש לטבול את קרום הניטרוצלולוז בחלב רזה 5% ב-PBS למשך 30 דקות כדי לחסום את המשטחים הפנויים. דגירה של כתמי החלבון בטמפרטורת החדר למשך שעתיים עם ארנב פוליקלונלי M. pneumoniae antiserum (המיוצר במכון פסטר של תוניס) מדולל ל 1/200 ב PBS-Tween 20, ולאחר מכן עם חזרת peroxidase (HRP) מצומד נגד ארנב IgG מדולל ל 1/2,000 ב PBS-Tween 20 במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר.
    4. שטפו את הנוגדנים הלא מאוגדים עם PBS וקבלו את התוצאות על ידי חשיפת יריעת הניטרוצלולוז לתמיסת המצע (4-כלורו-1-נפתול, H 2 O2). עצור את התגובה על ידי הוספת מים לאחר 5-15 דקות.
  4. הליך ספיחה
    הערה: כדי למנוע תגובות צולבות בין אנטי-סרום חיידקי M. דלקת ריאות פוליקלונלית לבין אנטיגנים של חיידקים הטרולוגיים, נעשה שימוש בהליך ספיחה שתואר קודם לכן על ידי בן עבד אלמומן ורועי24 .
    1. הכינו מאגר אנטיגן של 12 חיידקים הטרולוגיים (החשודים כחולקים אנטיגנים עם M. pneumoniae), ערבבו אותו בצינור מיקרוצנטריפוגה, והתאימו את ריכוז החלבון המתאים למחצית מהאנטי-סרום שייספג בניסוי.
      הערה: עוצמת הקול והריכוז משתנים בין המבחנים השונים. שלב זה תלוי בעיקר בריכוז הנוגדן שיש לספוח. לדוגמה, אם ריכוז הנוגדנים = 3.56 מ"ג/מ"ל, ריכוז מאגר האנטיגנים (המורכב מ-12 חיידקים הטרולוגיים) צריך להיות 1.78 מ"ג/מ"ל (לכן, כ-0.148 מ"ג מכל אנטיגן).
    2. צנטריפוגה תערובת אנטיגן ב 14,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס, לאסוף את הכדור pooled, ולדגור אותו עם אנטי שבטי מטוהרים אנטי M. דלקת ריאות IgG במשך 2 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה איטית.
    3. לאחר הדגירה, צנטריפוגה ההשעיה ב 14,000 x g במשך 10 דקות ב 4 °C ולשחזר את supernatant (אשר מתאים פוליקלונלי ספציפי M. דלקת ריאות antiserum).
      הערה: כדי להבטיח ספציפיות של אנטיסרום M. דלקת ריאות פוליקלונלית , חזור על הליך ספיחה שלוש פעמים. לפני שניתן יהיה להשתמש בו במבחן ELISA, יש לבדוק את האנטיסרום הפוליקלונלי M. pneumoniae על ידי immunoblotting על היעדר תגובות צולבות נגד קבוצת החיידקים הכלולה.

2. צעדי עליזה: הבדיקה עצמה

  1. ציפוי מיקרו-פלטה עם נוגדן הלכידה
    1. יש לדלל את נוגדן הלכידה (M. pneumoniae טרום-ספיחה פוליקלונלית אנטיסרום) לריכוז של 10 מיקרוגרם/מ"ל בחיץ קרבונט-ביקרבונט 0.1 M (pH 9.6).
    2. מצפים את צלחת ELISA בעלת 96 הבארות על ידי הוספת 100 μL של נוגדן הלכידה המדולל לכל באר.
    3. לאחר דגירה של לילה ב -4 מעלות צלזיוס, הסר את תמיסת הציפוי ושטוף את הצלחת חמש פעמים עם חיץ הכביסה (הרכב [לכל L]: 146.29 גרם של NaCl, 39.4 גרם של Tris-HCl, 0.2 גרם של Thimerosal, ו 0.5 mL של Tween 20; pH 7.3).
  2. חסימת
    1. חסום את משטחי הקשירה הנותרים של הבארות המצופות על ידי הוספת 100 μL של תמיסת החסימה (0.5% קזאין ב- PBS) לכל באר.
    2. לדגור במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
    3. הסר את הפתרון החוסם עם פיפטה ושטוף את הצלחת חמש פעמים עם מאגר הכביסה.
  3. יישום של האנטיגן
    1. הוסיפו כמות שווה של חלבונים מלאים מדלקת ריאות M. לכל הבארות המצופות (10 ננוגרם/באר).
    2. אפשרו לתגובה להתרחש במשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
    3. הסר את עודף של תמיסת אנטיגן ולשטוף את הצלחת חמש פעמים עם חיץ כביסה.
  4. יישום דגימות הבדיקה והבקרות
    1. לדלל את דגימות הבדיקה (סרה אנושית) ובקרות (הפניה חיובית ושלילית) ל 1/200, 1/400, ו 1/800 ב- PBS-Tween 20.
    2. הוסף 100 μL של דגימות מדולל ובקרות לתוך הבארות המתאימות. בצע כל תגובה בשכפול. סמן את הבארות שאינן מכילות לא אנטיגן ולא סרה כריקות.
    3. לאחר דגירה של הצלחת במשך 90 דקות בטמפרטורת החדר, הסר את תמיסות הסרום ושטוף את הצלחת חמש פעמים עם חיץ הכביסה.
  5. יישום נוגדן זיהוי מצומד אנזים
    1. דלל את נוגדני הזיהוי המצומדים לאנזימים, נוגדנים מצומדים נגד ארנב HRP ו- IgG אנטי-אנושי ל-1/10,000 ב- PBS-Tween 20.
    2. פיפטה 100 μL של נוגדן זיהוי מדולל כראוי לכל באר.
    3. לאחר דגירה של הצלחת במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר בחושך, הסר את נוגדני הזיהוי הבלתי מאוגדים ושטוף את הצלחת חמש פעמים עם חיץ הכביסה.
  6. איתור וניתוח נתונים
    1. הוסף 100 μL מתמיסת הכרומוגן Tetramethyl-benzidine (TMB) בגודל 3,3', 5,5' כדי להמחיש את קשירת האנטיגן-נוגדנים.
    2. אפשרו לצלחת להתפתח במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטר מתמיסת העצירה (7.5% H2SO4) כדי לעצור את התגובה האנזימטית.
    3. קרא את הספיגה באורך גל של 450 ננומטר באמצעות קורא המיקרו-פלטות ומיין את התוצאות על סמך חישוב מדד החיוביות (IP).
      IP = ספיגת הסרום הנבדק / ספיגת החתך
      IP < 0.7: תוצאה שלילית
      IP = 0.7: יש לחזור על הבדיקה תוך שבועיים
      IP > 0.7: תוצאה חיובית
      הערה: נוסחת ה- IP נתפסת במעבדה והערך 0.7 מוגדר לאחר מיטוב. עבור תגובות כפולות, מחושב הערך הממוצע של הספיגה. דילול אופטימלי בסרום וריכוז אנטיגן נקבעים בשיטת טיטרציה של לוח משבצות ELISA (הנתונים אינם מוצגים). ערך חיתוך = OD (צפיפות אופטית) של סרום חיובי ייחוס (מדולל באותו דילול כמו הדגימה). OD זה צריך להיות גבוה לפחות פי שלושה מערך ה- OD של הפקד השלילי.

3. שלבים לאחר ELISA: הערכת תוצאות ואימות בדיקות

  1. היכולת של ELISA הפנימית לאבחן באופן ספציפי זיהום M. דלקת ריאות בחולים שנבדקו מוערכת באמצעות אימונובלוטים משלימים באמצעות אנטיגנים של M. pneumoniae והחיידקים ההטרולוגיים כדי לאשר את החיוביות של sera האדם הנבדק בנוגדנים לדלקת ריאות M. ואת השליליות שלהם בחיידקים חשודים אחרים (הנתונים לא מוצגים).

תוצאות

הפעילות החיסונית של מיקופלסמה אנטי-סרום פוליקלונלית שאינה נספגת לחיידקים הטרולוגיים
תגובתיות צולבת אכן קיימת כפי שמוצג בתוצאות האימונובלוטינג (איור 2) ובהשוואה לבקרה החיובית (נתיב 1), חלק מהאנטיגנים של M. pneumoniae משותפים לחיידקים המוק?...

Discussion

מאמר זה מציג תיאור כללי של ELISA פנימי שפותח בעיקר כדי להבטיח סינון ספציפי של M. pneumoniae זיהום. הפרטים על הפרוטוקול של מבחן ELISA עצמו, כמו גם כמה שלבים לפני ואחרי העיבוד מסופקים. הספציפיות של בדיקה זו מובטחת על ידי טכניקת ספיחה. הליך זה תואר בעבר בבדיקות ELISA שפותחו לאבחון בני אדם ועופות Mycoplasm...

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.

Acknowledgements

המחקר מומן על ידי משרד הבריאות התוניסאי והמשרד התוניסאי להשכלה גבוהה ולמחקר מדעי.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
4-chloro-1-naphtolSigma-AldrichC6788-50 TAB
Bacto peptoneBD211677
Bacto tryptoneBD211705
Bovine serum albuminSigma-AldrichA9647-50 G
Carbonate bicarbonate bufferSigma-AldrichC3041-50 Cap
CaseinSigma-AldrichC7078-1 KG
CMRL1066 VWRP0058-N1L
D-GlucoseSigma-AldrichG7528-1KG
Difco PPLO BrothBD255420Frey media
ELISA plate-ReaderMULTISKAN GO, Thermo ScientificRef: 51119200
Fetal bovine serumCapricorn ScientificFBS-12A
Goat peroxidase-conjugated anti-human IgGAbcamab6759
Goat peroxidase-conjugated anti-rabbit IgGLife Technologies656120
Hydrochloric Acid 37%Prolab2025.290
Hydrogen peroxide (H2O2), solution 30%ScharlauHI01361000
L-argininSigma-AldrichA5006-1KG
LB brothPrepared in Pasteur Institute of TunisProvided by the laboratory of bacteriology of the Pasteur Institute of Tunis
Mycoplasma pneumoniae polyclonal antiserum produced in rabbitProduced in Pasteur Institute of TunisSerum was produced by rabbit immunization at the Pasteur Institute of Tunis
Nicotinamide adenine dinucleotideSigma-AldrichN7004-10G
Nunc Maxisorp flat-bottom 96-well microtiter plate Invitrogen44-2404-21
Penicillin G sodium (1 MIU)PANPHARMA
Phenol redfluka chemika77660
Skim milkMP Biomedicals902887
Sodium bicarbonate Sigma-AldrichS6297-1KG
Sodium carbonateSigma-AldrichS7795-1KG
Sodium chloride (NaCl)NovachimPS02805
Sulfuric acid (H2SO4) 95-97%Merck1007311011
ThimerosalUSB22215
TMB substrate (3,3’, 5,5’ TetraMethyl-Benzidine solution)Abcamab142042
Trizma baseSigma-AldrichT6791-1 KG
Tween 20Sigma-Aldrich1379-500 ML
Yeast extract, powder, UltrapureThermo Scientific J23547 

References

  1. Razin, S., Yogev, D., Naot, Y. Molecular biology and pathogenicity of mycoplasmas. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1094-1156 (1998).
  2. Chanock, R. M. Mycoplasma infections of man. The New England Journal of Medicine. 273 (22), 1199-1206 (1965).
  3. Braun, G. S., Wagner, K. S., Huttner, B. D., Schmid, H. Mycoplasma pneumoniae: Usual suspect and unsecured diagnosis in the acute setting. The Journal of Emergency Medicine. 30 (4), 371-375 (2006).
  4. Baseman, J. B., Cole, R. M., Krause, D. C., Leith, D. K. Molecular basis for cytadhesion of Mycoplasma pneumoniae. Journal of Bacteriology. 151, 1514-1522 (1982).
  5. Waldo, R. H., Krause, D. C. Synthesis, stability, and function of cytadhesin P1 and accessory protein B/C complex of Mycoplasma pneumoniae. Journal of Bacteriology. 188 (2), 569-575 (2006).
  6. Waites, K. B., Balish, M. F., Atkinson, T. P. New insights into the pathogenesis and detection of Mycoplasma pneumoniae infections. Future Microbiology. 3 (6), 635-648 (2008).
  7. Narita, M. Pathogenesis of extrapulmonary manifestations of Mycoplasma pneumoniae infection with special reference to pneumonia. Journal of Infection and Chemotherapy. 16 (3), 162-169 (2010).
  8. Kashyap, S., Sarkar, M. Mycoplasma pneumonia: Clinical features and management. Lung India. 27 (2), 75-85 (2010).
  9. Zhang, L., Zong, Z. Y., Liu, Y. B., Ye, H., Lv, X. J. PCR versus serology for diagnosing Mycoplasma pneumoniae infection: A systematic review & meta-analysis. Indian Journal of Medical Research. 134 (3), 270-280 (2011).
  10. Saraya, T. Mycoplasma pneumoniae infection: Basics. Journal of General and Family Medicine. 18 (3), 118-125 (2017).
  11. Jacobs, E. Serological diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infections: a critical review of current procedures. Clinical Infectious Diseases. 17, 79-82 (1993).
  12. Kok, T. W., Marmion, B. P., Varkanis, G., Worswick, D. A., Martin, J. Laboratory diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection: 3. Detection of IgM antibodies to M. pneumoniae by a modified indirect haemagglutination test. Epidemiology and Infection. 103 (3), 613-623 (1989).
  13. Smith, T. F. Mycoplasma pneumoniae infections: diagnosis based on immunofluorescence titer of IgG and IgM antibodies. Mayo Clinic Proceedings. 61 (10), 830-831 (1986).
  14. Busolo, F., Tonin, E., Conventi, L. Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Mycoplasma pneumoniae antibodies. Journal of Clinical Microbiology. 12 (1), 69-73 (1980).
  15. Van Griethuysen, A. J., et al. Use of the enzyme-linked immunosorbent assay for the early diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection. European Journal of Clinical Microbiology. 3 (2), 116-121 (1984).
  16. Raisanen, S. M., Suni, J. I., Leinikki, P. Serological diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection by enzyme immunoassay. Journal of Clinical Pathology. 33 (9), 836-840 (1980).
  17. Sasaki, T., Bonissol, C., Stoilikovic, B., Ito, K. Demonstration of cross-reactive antibodies to mycoplasmas in human sera by ELISA and immunoblotting. Microbiology and Immunology. 31 (7), 639-648 (1987).
  18. Brunner, H., et al. Unexpectedly high frequency of antibody to Mycoplasma pneumoniae in human sera as measured by sensitive techniques. Journal of Infectious Diseases. 135 (4), 524-530 (1977).
  19. Plackett, P., Marmion, B. P., Shaw, E. J., Lemcke, R. M. Immunochemical analysis of Mycoplasma pneumoniae: 3. Separation and chemical identification of serological active lipids. Australian Journal of Experimental Biology and Medical Science. 47 (2), 171-195 (1969).
  20. Ponka, A. The occurrence and clinical picture of serologically verified Mycoplasma pneumoniae infections with emphasis on central nervous system, cardiac and joint manifestations. Annals of Clinical Research. 11, 1-60 (1979).
  21. Bradford, M. M. A Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  22. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  23. Towbin, H., Staehlin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets. Procedure and some applications. Proceedings of National Academy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  24. Ben Abdelmoumen, B., Roy, S. An enzyme-linked immunosorbent assay for detection of avian mycoplasmas in culture. Avian Diseases. 39, 85-93 (1995).
  25. Fawcett, P. T., O'Brien, A. E., Doughty, R. A. An adsorption procedure to increase the specificity of enzyme-linked immunosorbent assays for lyme disease without decreasing sensitivity. Arthritis and Rheumatism. 32 (8), 1041-1044 (1989).
  26. Nicolson, G. L., Nasralla, M. Y., Nicolson, N. L. The pathogenesis and treatment of mycoplasmal infections. Antimicrobics and Infectious Disease Newsletter. 17 (11), 81-88 (1999).
  27. Meyer, R. D., Clough, W. Extragenital Mycoplasma hominis infections in adults: emphasis on immunosuppression. Clinical Infectious Diseases. 17, 243-249 (1993).
  28. Pitcher, D. G., Nicholas, R. A. J. Mycoplasma host specificity: Fact or fiction. Veterinary Journal. 170 (3), 300-306 (2005).
  29. Lierz, M., Jansen, A., Hafez, H. M. Mycoplasma lipofaciens transmission to veterinarian. Emerging Infectious Diseases. 14 (7), 1161-1163 (2008).
  30. Baker, A. S., Ruoff, K. L., Madoff, S. Isolation of Mycoplasma species from a patient with seal finger. Clinical Infectious Diseases. 27 (5), 1168-1170 (1998).
  31. Slack, M., P, E. A review of the role of Haemophilus influenzae in community-acquired pneumonia. Pneumonia. 6 (1), 26-43 (2015).
  32. Janira Avire, N., Whiley, H., Ross, K. A review of Streptococcus pyogenes: public health risk factors, prevention and control. Pathogens. 10 (2), 248 (2021).
  33. Steinitz, M. Quantitation of the blocking effect of Tween 20 and bovine serum albumin in ELISA microwells. Analytical Biochemistry. 282 (2), 232-238 (2000).
  34. Tully, J. G., Whitcomb, R. F., Clark, H. F., Williamson, D. L. Pathogenic mycoplasmas: cultivation and vertebrate pathogenicity of a new spiroplasma. Science. 195 (4281), 892-894 (1977).
  35. Frey, M. L., Hanson, R. P., Andrson, D. P. A medium for the isolation of avian mycoplasmas. American Journal of Veterinary Research. 29 (11), 2163-2171 (1968).
  36. Bertani, G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 62 (3), 293-300 (1951).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

192

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved