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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Nell'infezione da Mycoplasma pneumoniae, i test sierologici possono generare buoni risultati, ma con bassa specificità a causa della reazione crociata immunologica. L'ELISA interno per la cattura dell'antigene, descritto in questo articolo, garantisce un'elevata specificità delle specie e ha dimostrato di essere un test di screening affidabile per una diagnosi accurata di M. pneumoniae.

Abstract

Il Mycoplasma pneumoniae è un procariota carente della parete cellulare, noto principalmente per colonizzare il tratto respiratorio umano e per essere endemico, con picchi epidemici ogni 6 anni, nei bambini più grandi e nei giovani adulti. La diagnosi di M. pneumoniae è difficile a causa della natura meticolosa dell'agente patogeno e della possibilità di trasporto asintomatico. La diagnosi di laboratorio dell'infezione da M. pneumoniae basata sulla titolazione degli anticorpi nei campioni di siero dei pazienti rimane il metodo più praticato. A causa del potenziale problema della cross-reattività immunologica con l'uso di siero policlonale per M. pneumoniae, è stato sviluppato un saggio di immunoassorbimento enzimatico legato all'antigene (ELISA) per migliorare la specificità della diagnosi sierologica. Le piastre ELISA sono rivestite con anticorpi policlonali M. pneumoniae, allevati nei conigli e resi specifici dopo l'adsorbimento contro un pannello di batteri eterologhi che condividono antigeni con le specie di M. pneumoniae e/o sono noti per colonizzare le vie respiratorie . Gli antigeni omologhi di M. pneumoniae reagiti vengono quindi specificamente riconosciuti dai loro anticorpi corrispondenti nei campioni di siero. Un'ulteriore ottimizzazione dei parametri fisico-chimici a cui è sottoposto l'ELISA di cattura dell'antigene ha portato a un ELISA altamente specifico, sensibile e riproducibile.

Introduzione

I micoplasmi sono tra i procarioti più piccoli e semplici conosciuti. Si distinguono principalmente dagli altri batteri per la mancanza di una struttura della parete cellulare. Pertanto, i micoplasmi sono stati classificati in una classe separata denominata Mollicutes1. Il deficit della parete cellulare conferisce resistenza intrinseca a questi microrganismi contro alcuni agenti antimicrobici ed è in gran parte responsabile del loro polimorfismo. I micoplasmi hanno un genoma piccolo e dimensioni ridotte, il che limita le loro capacità metaboliche e biosintetiche e spiega la loro natura parassitaria e saprofita1.

Mycoplasma pneumoniae è uno dei micoplasmi che infettano l'uomo e si pensa che sia il più virulento2. M. pneumoniae colonizza il tratto respiratorio superiore, portando a polmonite atipica nei bambini e nei giovani adulti. I segni clinici generati dall'infezione da M. pneumoniae sono simil-influenzali, con mal di testa, febbre e tosse3. La cytadherence di M. pneumoniae alle cellule ospiti è mediata da un organello di attaccamento che include l'adesione maggiore P1 e diverse proteine accessorie 4,5. Altre manifestazioni cliniche possono verificarsi a causa dell'infiammazione locale e della stimolazione del sistema immunitario dell'ospite derivanti dall'aderenza intima di M. pneumoniae alla mucosa delle vie aeree6. Sebbene la polmonite sia un segno distintivo dell'infezione da M. pneumoniae, è stato rivelato che l'infezione da questo batterio può anche essere responsabile di un ampio spettro di manifestazioni non polmonari in diversi siti anatomici come il sistema nervoso centrale, il cuore, la pelle e le articolazioni7.

Come per tutte le specie di Mycoplasma, la diagnosi di M. pneumoniae è impegnativa. I segni clinici che evocano la micoplasmosi sono per lo più inapparenti e non caratteristici8. Poiché è molto difficile diagnosticare l'infezione da M. pneumoniae basandosi solo su manifestazioni e sintomi clinici, lo screening di laboratorio è di particolare interesse9. Rilevare le colonie di M. pneumoniae mediante coltura è il metodo gold standard per una corretta diagnosi. Tuttavia, i meticolosi requisiti di crescita e il lungo tempo necessario per la consegna dei risultati definitivi (1-2 settimane) complicano la coltura, e quindi significa che viene raramente utilizzata per la diagnosi di routine10. Le tecnologie di amplificazione degli acidi nucleici sono state convalidate in termini di velocità ed efficienza, anche se a causa del loro costo relativamente elevato e dell'indisponibilità in alcune strutture sanitarie, queste tecniche molecolari non sono considerate test diagnostici di prima linea. È vero che i test PCR commerciali sono ampiamente utilizzati per diagnosticare le infezioni da M. pneumoniae, ma non possono ancora sostituire la sierologia. Inoltre, il frequente verificarsi di risultati falsi negativi e falsi positivi ha limitato l'uso della PCR9. Di routine, la sierologia rimane la più praticata nei laboratori per la diagnosi dell'infezione da M. pneumoniae. Diversi approcci sierologici sono stati riportati per decenni, come le emoagglutinine fredde, il test di fissazione del complemento11, il test di emoagglutinazione indiretta 12, l'immunofluorescenza 13 e la tecnologia di ELISA, che è stata applicata per la prima volta alla sierologia del micoplasma nei primi anni 198014,15,16. Uno dei principali problemi riscontrati durante l'esecuzione della sierodiagnosi ELISA dell'infezione da M. pneumoniae sono le reazioni crociate, che riducono considerevolmente la specificità della tecnica. In precedenza è stato riportato adsorbimento aspecifico di sieri umani con antigeni di M. pneumoniae; infatti, molti degli anticorpi rilevati dall'ELISA nei sieri umani potrebbero non essere sempre legati agli antigeni micoplasmatici 17, a causa della comunanza di M. pneumoniae con alcuni batteri18,19 e alcuni tessuti animali e umani20.

A causa delle elevate letture di fondo osservate nel test ELISA convenzionale praticato in laboratorio, l'interpretazione dei risultati era spesso complicata e quindi la consegna di una corretta diagnosi di M. pneumoniae era un compito difficile. Di fronte a questo problema, abbiamo optato per migliorare l'ELISA di M. pneumoniae rimuovendo le reazioni non specifiche degli antigeni di M. pneumoniae con anticorpi da testare. A questo scopo, abbiamo lavorato sulla deplezione selettiva degli antigeni non specifici di M. pneumoniae utilizzando la tecnica dell'adsorbimento. Infatti, l'obiettivo principale dell'ELISA di cattura dell'antigene è quello di rilevare specificamente l'immunoglobulina (Ig) G di M. pneumoniae nei campioni di siero umano. Il concetto di questo ELISA consiste principalmente nella cattura selettiva di antigeni specifici di M. pneumoniae, prima di aggiungere i campioni di siero umano. Questa selettività è assicurata mediante l'incubazione dell'antigene grezzo di M. pneumoniae con un antisiero policlonale M. pneumoniae, prodotto nei conigli in laboratorio e rendendolo specie-specifico mediante adsorbimento contro un pannello di batteri eterologhi, appartenenti o non appartenenti alla classe Mollicutes, che condividono antigeni con M. pneumoniae specie e/o note per colonizzare le vie respiratorie. La procedura di adsorbimento è stata ripetuta tre volte e la sua efficacia nell'eliminare la cross-reattività è stata testata mediante immunoblotting. Il test ELISA sviluppato è una combinazione di ELISA a sandwich e ELISA indiretto. In breve, i pozzetti della piastra ELISA vengono prima rivestiti con un antisiero policlonale specifico per M. pneumoniae. Quindi, l'antigene di M. pneumoniae viene aggiunto e intrappolato tra l'antisiero e gli anticorpi presenti nel campione di siero da testare. Il complesso immunologico formato viene rilevato da un anticorpo secondario coniugato enzimatico (IgG coniugate con perossidasi). Le reazioni vengono visualizzate mediante l'aggiunta di substrato cromogenico e l'assorbanza viene misurata spettrofotometricamente. Questo ELISA interno è schematicamente presentato nella Figura 1. L'ELISA fatto in casa si è dimostrato efficace nel rilevare specificamente l'infezione da M. pneumoniae ed è attualmente uno dei test più praticati nell'attività diagnostica di routine.

Protocollo

Il presente studio è stato condotto in conformità con gli aspetti etici stabiliti dal comitato etico dell'Istituto Pasteur di Tunisi.

1. Fasi pre-ELISA: prerequisiti e pre-elaborazione

  1. Ceppi batterici e terreni di crescita
    NOTA: Le specie di Mollicutes e i batteri murati utilizzati nel presente studio e i loro substrati di crescita sono elencati nella Tabella 1.
    1. Crescita delle specie di Mollicutes
      1. Inoculare 200 μL dallo stock di glicerolo di ciascuna specie in 1.800 μL di terreno.
      2. Coltivare le specie Mollicutes staticamente a 37 °C con il 5% di CO 2 per2-4 giorni fino a quando non si osserva un cambiamento di pH (l'indicatore di pH è rosso fenolo).
      3. Aumentare le colture a 10 ml aggiungendouna diluizione di 1/10 della coltura ai terreni e consentire loro di crescere di nuovo nelle stesse condizioni.
        NOTA: Secondo il metabolismo, alcune specie umane di Mollicutes (M. pneumoniae, M. genitalium e M. fermentans) acidificano il terreno a causa della fermentazione del glucosio e alcune altre (M. hominis e Ureaplasma) alcalinizzano il mezzo mediante idrolisi dell'arginina o idrolisi dell'urea, rispettivamente. Per quanto riguarda i micoplasmi aviari, l'acidificazione del terreno di Frey dimostra la presenza di M. gallisepticum, mentre la sua alcalinizzazione dimostra la crescita di M. imitans.
      4. Distribuire 50 μL delle colture su piastre di agar per confermare la crescita dei batteri. Mantenere le piastre di agar a 37 °C con il 5% di CO2 e osservarle regolarmente al microscopio per la comparsa di tipiche colonie di uova fritte (Mycoplasmas) e colonie simili a ricci scuri (Ureaplasmas).
    2. Crescita di specie non-Mollicutes
      1. Coltura dei batteri non mollicutes in 3 mL di terreno a 37 °C durante la notte (agitazione a 200 giri/min).
      2. Confronta la torbidità delle colture con i mezzi di controllo per confermare la crescita.
      3. Aumentare le colture a 10 ml aggiungendouna diluizione 1/100 della coltura ai terreni e consentire loro di crescere di nuovo nelle stesse condizioni.
  2. Preparazione dell'antigene
    1. Preparazione dell'antigene delle specie di Mollicutes
      1. Raccogliere le proteine intere (presenti in colture confermate di M. pneumoniae e delle altre specie di Mollicutes) mediante centrifugazione a 40.000 x g a 4 °C per 30 min.
      2. Scartare il surnatante e lavare il pellet tre volte con 1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato 1x (PBS, pH 7,4) mediante una serie di tre centrifugazioni con le stesse condizioni.
      3. Risospendere ogni antigene in 500 μL di PBS.
    2. Preparazione dell'antigene di specie non-Mollicutes
      1. Centrifugare le colture coltivate durante la notte dei batteri non-Mollicutes a 1.500 x g per 15 minuti.
      2. Risospendere ogni pellet batterico in 500 μL di PBS.
        NOTA: La concentrazione proteica viene determinata utilizzando il classico metodo di quantificazione Bradford con albumina sierica bovina come standard21. La concentrazione proteica delle specie di Mollicutes varia solitamente tra 0,7-4,8 mg/ml. Per le altre specie batteriche, la concentrazione proteica può raggiungere i 20 mg/ml. Tutti gli antigeni sono conservati a -20 °C fino al loro successivo utilizzo.
  3. Screening della cross-reattività mediante immunoblotting
    1. Denaturare le proteine batteriche mescolando 8 μL di ciascun antigene con un volume uguale di tampone campione (0,5 M Tris-HCl; pH 6,8, 10% glicerolo [v/v], 10% SDS [p/v] e 0,2% blu di bromofenolo), incubare la miscela a 100 °C per 5 minuti.
      NOTA: La denaturazione viene eseguita per coprire le proteine con carica negativa e per rompere le loro strutture secondarie, il che consente loro di attraversare il gel di poliacrilammide e di essere separate in base ai loro pesi molecolari.
    2. Sottoporre le proteine denaturate (100 μg di proteine/pozzetto) all'elettroforesi su gel di sodio dodecilsolfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) con il metodo 22 di Laemml con il12 % di gel separante e il 5% di gel impilabile. Successivamente, trasferire le proteine elettroforeticamente alla membrana nitrocellulosa con il metodo23 di Towbin et al.
    3. Immergere la membrana nitrocellulosa nel latte scremato al 5% in PBS per 30 minuti per bloccare le superfici non occupate. Incubare i peeling proteici a temperatura ambiente per 2 ore con antisiero policlonale M. pneumoniae di coniglio (prodotto presso l'Istituto Pasteur di Tunisi) diluito a 1/200 in PBS-Tween 20, quindi con IgG anti-coniglio coniugato con perossidasi di rafano (HRP) diluito a 1/2.000 in PBS-Tween 20 per 1 ora a temperatura ambiente.
    4. Lavare via gli anticorpi non legati con PBS e ottenere i risultati esponendo il foglio di nitrocellulosa alla soluzione di substrato (4-cloro-1-naftolo, H2 O2). Interrompere la reazione aggiungendo acqua dopo 5-15 minuti.
  4. Procedura di adsorbimento
    NOTA: Per eliminare le reazioni crociate tra l'antisiero policlonale di M. pneumoniae e gli antigeni dei batteri eterologhi, viene utilizzata la procedura di adsorbimento precedentemente descritta da Ben Abdelmoumen e Roy24 .
    1. Preparare un pool di antigeni dei 12 batteri eterologhi (sospettati di condividere antigeni con M. pneumoniae), mescolarlo in una provetta da microcentrifuga e regolare la concentrazione proteica corrispondente alla metà dell'antisiero da adsorbitare nell'esperimento.
      NOTA: Il volume e la concentrazione variano tra i diversi test. Questo passaggio dipende principalmente dalla concentrazione dell'anticorpo da adsorbitare. Ad esempio, se la concentrazione di anticorpi = 3,56 mg/ml, la concentrazione del pool di antigeni (composto dai 12 batteri eterologhi) dovrebbe essere di 1,78 mg/ml (quindi, circa 0,148 mg di ciascun antigene).
    2. Centrifugare la miscela di antigeni a 14.000 x g per 10 minuti a 4 °C, raccogliere il pellet raggruppato e incubarlo con il policlonale purificato anti-M. pneumoniae IgG per 2 ore a 37 °C con agitazione lenta.
    3. Dopo l'incubazione, centrifugare la sospensione a 14.000 x g per 10 minuti a 4 °C e recuperare il surnatante (che corrisponde all'antisiero policlonale specifico M. pneumoniae ).
      NOTA: Per garantire la specificità dell'antisiero policlonale M. pneumoniae , ripetere la procedura di adsorbimento tre volte. Prima di poter essere utilizzato nel test ELISA, l'antisiero policlonale adsorbito M. pneumoniae deve essere testato mediante immunoblotting per l'assenza di reazioni crociate contro il set di batteri incluso.

2. Fasi ELISA: il test stesso

  1. Rivestimento in micropiastre con l'anticorpo di cattura
    1. Diluire l'anticorpo di cattura (antisiero policlonale preadsorbito di M. pneumoniae ) ad una concentrazione di 10 μg/mL in tampone carbonato-bicarbonato 0,1 M (pH 9,6).
    2. Rivestire la piastra ELISA a 96 pozzetti aggiungendo 100 μL dell'anticorpo di cattura diluito a ciascun pozzetto.
    3. Dopo l'incubazione notturna a 4 °C, rimuovere la soluzione di rivestimento e lavare la piastra cinque volte con il tampone di lavaggio (composizione [per L]: 146,29 g di NaCl, 39,4 g di Tris-HCl, 0,2 g di Thimerosal e 0,5 mL di Tween 20; pH 7,3).
  2. Inceppamento
    1. Bloccare le restanti superfici di legame dei pozzetti rivestiti aggiungendo 100 μL della soluzione bloccante (caseina allo 0,5% in PBS) a ciascun pozzetto.
    2. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
    3. Rimuovere la soluzione di blocco con una pipetta e lavare la piastra cinque volte con il tampone di lavaggio.
  3. Applicazione dell'antigene
    1. Aggiungere una quantità uguale di proteine intere di M. pneumoniae a tutti i pozzetti rivestiti (10 ng/pozzetto).
    2. Lasciare che la reazione avvenga per 2 ore a temperatura ambiente.
    3. Rimuovere l'eccesso della soluzione di antigene e lavare la piastra cinque volte con il tampone di lavaggio.
  4. Applicazione dei campioni di prova e dei controlli
    1. Diluire i campioni di prova (sieri umani) e i controlli (sieri positivi e negativi di riferimento) a 1/200, 1/400 e 1/800 in PBS-Tween 20.
    2. Aggiungere 100 μL dei campioni diluiti e dei controlli nei pozzetti appropriati. Esegui ogni reazione in duplicato. Contrassegnare i pozzetti che non contengono né antigene né sieri come vuoti.
    3. Dopo aver incubato la piastra per 90 minuti a temperatura ambiente, rimuovere le soluzioni di siero e lavare la piastra cinque volte con il tampone di lavaggio.
  5. Applicazione dell'anticorpo di rilevazione enzima-coniugato
    1. Diluire gli anticorpi di rilevamento coniugati con enzimi, gli anti-coniglio coniugati con HRP e le IgG anti-umane a 1/10.000 in PBS-Tween 20.
    2. Pipettare 100 μL dell'anticorpo di rilevazione opportunamente diluito in ciascun pozzetto.
    3. Dopo aver incubato la piastra per 1 ora a temperatura ambiente al buio, rimuovere gli anticorpi di rilevamento non legati e lavare la piastra cinque volte con il tampone di lavaggio.
  6. Rilevamento e analisi dei dati
    1. Aggiungere 100 μL della soluzione cromogeno 3,3', 5,5' tetrametil-benzidina (TMB) per visualizzare il legame antigene-anticorpo.
    2. Lasciare sviluppare la piastra per 30 minuti a temperatura ambiente, quindi aggiungere 100 μL della soluzione di arresto (7,5% H2SO4) per arrestare la reazione enzimatica.
    3. Leggere l'assorbanza a 450 nm di lunghezza d'onda utilizzando il lettore di micropiastre e ordinare i risultati in base al calcolo dell'indice di positività (IP).
      IP = Assorbanza del siero testato / Assorbanza del cut-off
      IP < 0.7: risultato negativo
      IP = 0,7: il test deve essere ripetuto entro 2 settimane
      IP > 0.7: risultato positivo
      NOTA: La formula IP è concepita in laboratorio e il valore 0.7 viene impostato dopo l'ottimizzazione. Per le reazioni duplicate, viene calcolato il valore medio dell'assorbanza. La diluizione sierica ottimale e la concentrazione di antigene sono stabilite con il metodo di titolazione a scacchiera ELISA (dati non mostrati). Valore soglia = OD (densità ottica) di un siero positivo di riferimento (diluito alla stessa diluizione del campione). Questo OD dovrebbe essere almeno tre volte superiore al valore OD del controllo negativo.

3. Fasi post-ELISA: valutazione dei risultati e convalida dei test

  1. La capacità dell'ELISA interno di diagnosticare specificamente l'infezione da M. pneumoniae nei pazienti testati viene valutata attraverso immunoblot supplementari utilizzando antigeni di M. pneumoniae e batteri eterologhi per confermare la positività dei sieri umani testati negli anticorpi di M. pneumoniae e la loro negatività negli altri batteri sospetti (dati non mostrati).

Risultati

L'attività immunoblotting dell'antisiero policlonale Mycoplasma pneumoniae non adsorbito a batteri eterologhi
La cross-reattività esiste effettivamente come mostrato nei risultati dell'immunoblotting (Figura 2) e rispetto al controllo positivo (Lane 1), alcuni degli antigeni di M. pneumoniae sono condivisi con i batteri schermati. L'intensità di queste reazioni crociate era variabile. Ad esempio, gli antigeni di M. <...

Discussione

Questo documento presenta una descrizione generale di un ELISA interno sviluppato principalmente per garantire uno screening specifico di M. pneumoniae Infezione. Vengono forniti i dettagli sul protocollo del test ELISA stesso e alcune fasi di pre e post-elaborazione. La specificità di questo test è assicurata dalla tecnica di adsorbimento. Questa procedura è stata precedentemente descritta nei test ELISA sviluppati per la diagnosi di esseri umani e aviari Mycoplasmas17,<...

Divulgazioni

Gli autori dichiarano che non vi sono interessi concorrenti.

Riconoscimenti

Questo studio è stato finanziato dal Ministero della Salute tunisino e dal Ministero tunisino dell'Istruzione Superiore e della Ricerca Scientifica.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
4-chloro-1-naphtolSigma-AldrichC6788-50 TAB
Bacto peptoneBD211677
Bacto tryptoneBD211705
Bovine serum albuminSigma-AldrichA9647-50 G
Carbonate bicarbonate bufferSigma-AldrichC3041-50 Cap
CaseinSigma-AldrichC7078-1 KG
CMRL1066 VWRP0058-N1L
D-GlucoseSigma-AldrichG7528-1KG
Difco PPLO BrothBD255420Frey media
ELISA plate-ReaderMULTISKAN GO, Thermo ScientificRef: 51119200
Fetal bovine serumCapricorn ScientificFBS-12A
Goat peroxidase-conjugated anti-human IgGAbcamab6759
Goat peroxidase-conjugated anti-rabbit IgGLife Technologies656120
Hydrochloric Acid 37%Prolab2025.290
Hydrogen peroxide (H2O2), solution 30%ScharlauHI01361000
L-argininSigma-AldrichA5006-1KG
LB brothPrepared in Pasteur Institute of TunisProvided by the laboratory of bacteriology of the Pasteur Institute of Tunis
Mycoplasma pneumoniae polyclonal antiserum produced in rabbitProduced in Pasteur Institute of TunisSerum was produced by rabbit immunization at the Pasteur Institute of Tunis
Nicotinamide adenine dinucleotideSigma-AldrichN7004-10G
Nunc Maxisorp flat-bottom 96-well microtiter plate Invitrogen44-2404-21
Penicillin G sodium (1 MIU)PANPHARMA
Phenol redfluka chemika77660
Skim milkMP Biomedicals902887
Sodium bicarbonate Sigma-AldrichS6297-1KG
Sodium carbonateSigma-AldrichS7795-1KG
Sodium chloride (NaCl)NovachimPS02805
Sulfuric acid (H2SO4) 95-97%Merck1007311011
ThimerosalUSB22215
TMB substrate (3,3’, 5,5’ TetraMethyl-Benzidine solution)Abcamab142042
Trizma baseSigma-AldrichT6791-1 KG
Tween 20Sigma-Aldrich1379-500 ML
Yeast extract, powder, UltrapureThermo Scientific J23547 

Riferimenti

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