Visualización de la mitofagia con tintes fluorescentes para mitocondrias y lisosomas

Resumen

La mitofagia es el principal mecanismo de control de calidad mitocondrial. Sin embargo, la evaluación de la mitofagia in vivo se ve obstaculizada por la falta de ensayos cuantitativos fiables. Aquí se presenta un protocolo para la observación de la mitofagia en células vivas utilizando un colorante mitocondrial verde-fluorescente permean celular y un colorante lisosómico rojo-fluorescente.

Resumen

Las mitocondrias, al ser las centrales eléctricas de la célula, juegan un papel importante en la bioenergética, la generación de radicales libres, la homeostasis del calcio y la apoptosis. La mitofagia es el mecanismo primario del control de calidad mitocondrial y generalmente se estudia mediante observación microscópica, sin embargo, los ensayos de mitofagia in vivo son difíciles de realizar. La evaluación de la mitofagia mediante imágenes de orgánulos vivos es un método alternativo y necesario para la investigación mitocondrial. Este protocolo describe los procedimientos para usar el colorante mitocondrial verde-fluorescente permean celular MitoTracker Green y el colorante lisosómico rojo-fluorescente LysoTracker Red en células vivas, incluida la carga de los colorantes, la visualización de las mitocondrias y el lisosoma, y los resultados esperados. También se proporcionan pasos detallados para la evaluación de la mitofagia en células vivas, así como notas técnicas sobre la configuración del software del microscopio. Este método puede ayudar a los investigadores a observar la mitofagia utilizando microscopía fluorescente de células vivas. Además, se puede utilizar para cuantificar mitocondrias y lisosomas y evaluar la morfología mitocondrial.

Introducción

Las mitocondrias son las centrales eléctricas de casi todas las células eucariotas ^1,2. Además de la producción de ATP a través de la fosforilación oxidativa, las mitocondrias juegan un papel vital en otros procesos como la bioenergética, la homeostasis del calcio, la generación de radicales libres, la apoptosis y la homeostasis celular ^3,4,5. A medida que las mitocondrias generan especies reactivas de oxígeno (ROS) a partir de múltiples complejos en la cadena de transporte de electrones, son estimuladas constantemente por el estrés oxidativo potencial, que eventualmente puede conducir a daños estructurales y disfunción cuando el sistema de defensa antioxidante colapsa ^6,7. Se ha encontrado que la disfunción mitocondrial contribuye a muchas enfermedades, incluidos los trastornos metabólicos, la neurodegeneración y las enfermedades cardiovasculares⁸. Por lo tanto, es crucial mantener poblaciones mitocondriales sanas y su función adecuada. Las mitocondrias son orgánulos altamente plásticos y dinámicos; su morfología y función están controladas por mecanismos de control de calidad mitocondrial, incluyendo modificaciones postraduccionales (PTM) de proteínas mitocondriales, biogénesis mitocondrial, fusión, fisión y mitofagia ^9,10. La fisión mitocondrial mediada por la proteína 1 relacionada con la dinamina (DRP1), una GTPasa de la superfamilia de proteínas dinamina, da como resultado mitocondrias pequeñas y redondas y aísla las mitocondrias disfuncionales, que pueden ser eliminadas y degradadas por la mitofagia^11,12.

La mitofagia es un proceso celular que degrada selectivamente las mitocondrias por autofagia, que generalmente ocurre en las mitocondrias dañadas después de una lesión, envejecimiento o estrés. Posteriormente, estas mitocondrias son entregadas a los lisosomas para su degradación¹⁰. Por lo tanto, la mitofagia es un proceso catabólico que ayuda a mantener la cantidad y calidad de las mitocondrias en un estado saludable en una amplia gama de tipos de células. Desempeña un papel crucial en la restauración de la homeostasis celular en condiciones fisiológicas y de estrés normales^13,14. Las células se caracterizan por un complejo mecanismo de mitofagia, que es inducido por diferentes señales de estrés celular y cambios en el desarrollo. Las vías reguladoras de la mitofagia se clasifican como dependientes de ubiquitina o dependientes de receptores^15,16; la autofagia dependiente de ubiquitina está mediada por la quinasa PINK1 y el reclutamiento de ubiquitina ligasa Parkin E3 a las mitocondrias 17,18^, mientras que la autofagia dependiente del receptor implica la unión de los receptores de autofagia a la cadena ligera LC3 asociada a microtúbulos que media la mitofagia en respuesta al daño mitocondrial¹⁹.

La microscopía electrónica de transmisión (TEM) es el método más utilizado, y sigue siendo uno de los mejores, para observar y detectar la mitofagia²⁰. Las características morfológicas de la mitofagia son autofagosomas o autolisosomas formados por la fusión de autofagosomas con lisosomas, que pueden ser observados a partir de imágenes de microscopía electrónica²¹. La debilidad de la microscopía electrónica (EM), sin embargo, es la incapacidad de monitorear los procesos dinámicos de la mitofagia, como la despolarización mitocondrial, la fisión mitocondrial y la fusión de autofagosomas y lisosomas, en la célula viva²⁰. Por lo tanto, la evaluación de la mitofagia a través de imágenes de orgánulos vivos es un método alternativo atractivo para la investigación mitocondrial. La técnica de imagen de células vivas descrita aquí utiliza dos tintes fluorescentes para teñir mitocondrias y lisosomas. Cuando ocurre la mitofagia, las mitocondrias dañadas o superfluas engullidas por autofagosomas se tiñen de verde por el tinte mitocondrial, mientras que el tinte rojo tiñe los lisosomas. La fusión de estos autofagosomas y lisosomas, denominados autolisosomas, hace que la fluorescencia verde y roja se superponga y se manifieste como puntos amarillos, indicando así la ocurrencia de mitofagia²². El colorante mitocondrial permean celular (MitoTracker Green) contiene una fracción clorometilo ligeramente reactiva al tiol para etiquetar las mitocondrias²³. Para etiquetar las mitocondrias, las células simplemente se incuban con el tinte, que se difunde pasivamente a través de la membrana plasmática y se acumula en las mitocondrias activas. Este colorante mitocondrial puede teñir fácilmente las células vivas y es menos eficaz para teñir las células muertas o fijadas en aldehído. El colorante lisosómico (LysoTracker Red) es una sonda acidotrópica fluorescente utilizada para etiquetar y rastrear orgánulos ácidos en células vivas. Este colorante exhibe una alta selectividad para orgánulos ácidos y puede etiquetar eficazmente las células vivas a concentraciones nanomolares²⁴.

Aquí se presentan los procedimientos para usar estos tintes fluorescentes en células vivas, incluida la carga de los tintes y la visualización de mitocondrias y lisosomas. Este método puede ayudar a los investigadores a observar la mitofagia utilizando microscopía fluorescente de células vivas. También se puede utilizar para cuantificar mitocondrias y lisosomas, y evaluar la morfología mitocondrial.

Protocolo

1. Cultivo celular y pasaging

NOTA: El protocolo se describe utilizando fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) cultivados rutinariamente como ejemplo.

1. Cultive células MEF en placas de cultivo celular de 10 cm con 10 ml de medio de águila modificada (DMEM) de Dulbecco. Incubar a 37 °C y 5% de_CO2 y monitorizar las células bajo un microscopio a un aumento de 100x.
2. Realizar el paso celular de rutina.
   1. Cuando las células alcancen el 80% -90% de confluencia (cada 3 días), lave las células con 2 ml de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco. Luego agregue 2 ml de tripsina-EDTA al 0,05% durante 1 minuto para disociar las células, seguido de 2 ml de DMEM para detener la acción de la tripsina-EDTA. Centrifugar la suspensión celular a 100 x g durante 3 min y resuspender el pellet celular en 1 mL de DMEM.
   2. Cuente las células utilizando un contador de células automatizado y portaobjetos de cámara de conteo de células (consulte la Tabla de materiales) y luego inocule 1,5 x 10⁶ células en una nueva placa de cultivo celular de 10 cm que contenga 10 ml de DMEM.
3. Para el ensayo de mitofagia, preparar una suspensión celular como en el paso 1.2.1. Diluir la suspensión celular a 1 x 10⁵ células/ml en DMEM fresco.
4. Agregue 2 ml de la suspensión celular diluida a una placa confocal de 20 mm (consulte la Tabla de materiales) y agite la placa de cultivo en una "cruz". Incubar la placa de cultivo celular en una incubadora de_CO2 al 5% a 37 °C durante 24 h.

2. Tinción mitocondrial

1. Retirar las alícuotas de la solución madre del colorante mitocondrial verde-fluorescente y del colorante lisosómico rojo-fluorescente (ver tabla de materiales) del congelador a -20 °C.
2. Preparar soluciones de trabajo de los colorantes diluyendo las soluciones madre 1:1.000 en DMEM y mezclar bien. Por ejemplo, agregue 2 μL de colorante mitocondrial de 1 mM y colorante lisosómico a 2 ml de DMEM para obtener una concentración de trabajo de 1 μM para ambos colorantes.
3. Retire el medio de la placa de cultivo confocal (paso 1.4). Añadir 1 ml de la solución de tinción (preparada en el paso 2.2) para cubrir las células. Colocar la placa de cultivo celular en una incubadora a 37 °C, 5% de_CO2 durante 20-30 min.

3. Imágenes confocales

1. Preparar 1 L de tampón de Krebs-Henseleit (KH) (138,2 mM de NaCl, 3,7 mM de KCl, 0,25 mM de CaCl 2, 1,2 mM KH 2 PO 4,_1,2 mM de MgSO 4,7H2 O, 15 mM de glucosa y 21,85 mM de HEPES; pH final 7,4) y conservar a₄ °C (hasta 1 mes).
2. El día de la toma de imágenes confocales, retire el tampón KH del refrigerador con anticipación y precaliéntelo a temperatura ambiente (20 a 25 °C).
3. Establezca los parámetros del software de imágenes de microscopía confocal (consulte la Tabla de materiales): Para imágenes de excitación dual, use excitación secuencial a 488 nm y 543 nm, y recopile la emisión a 505-545 nm y >560 nm, respectivamente.
   NOTA: Establezca la configuración de imágenes de la siguiente manera. Modo de escaneo: marco; Velocidad: 9; Promedio: número, 1; Ganancia: 450 a 600; Estenopeico: 30 a 200; Láser: <10%. Es mejor iniciar primero el software de imágenes y luego encender completamente el láser de 488 nm. El láser de 543 nm debe encenderse y estabilizarse durante 3-5 minutos antes de su uso (Figura 1A).
4. Retire el medio de cultivo que contiene el colorante de la incubadora (paso 2.3) y añada 1 ml de tampón KH al plato.
5. Para inducir la mitofagia, tratar las células con cianuro de carbonilo-4-(trifluorometoxi) fenilhidrazona (FCCP) a 1 μM (concentración final) en tampón KH durante 10 minutos a temperatura ambiente, e inmediatamente proceder a obtener imágenes de las células utilizando el microscopio confocal.
6. Aplique una cantidad adecuada de aceite en la parte superior de la lente de aceite 63x (consulte la Tabla de materiales). Coloque la muestra de células en la etapa de muestra del microscopio confocal y muévala directamente por encima de la lente del objetivo.
7. Utilice el software de imágenes para encontrar la muestra haciendo clic en la pestaña Localizar en la esquina superior izquierda de la interfaz del software (Figura 1B). Seleccione un conjunto de filtros verdes para el experimento.
8. Utilice la perilla de ajuste gruesa para enfocar rápidamente moviendo la lente del objetivo hacia arriba y hacia abajo. Después de que la muestra de células sea claramente visible a través del ocular, busque y enfoque el área de celdas individuales y muévala al centro del campo de visión.
9. Haga clic en la pestaña Adquisición en la esquina superior izquierda de la interfaz del software para adquirir imágenes. Seleccione sólo el canal de 488 nm y la resolución de fotogramas 1024 x 1024 para la vista previa.
10. Haga clic en la pestaña En vivo en la esquina superior izquierda para iniciar un escaneo en vivo . Ajuste el campo de visión al máximo y ajuste la potencia del láser moviendo el control deslizante hacia la izquierda o hacia la derecha (Figura 1A). Mantenga el ajuste de ganancia por debajo de 600 para evitar la sobreexposición.
11. Ajuste el valor estenopeico a 156, el valor de ganancia a 545 y el valor de desplazamiento digital a 0.
12. Seleccione el mejor campo de visión, compruebe los dos canales (488 nm y 543 nm) y elija la resolución de fotogramas 1024 x 1024. Haga clic en Ajustar para adquirir imágenes 2D. Guarde las imágenes adquiridas.
    NOTA: El colorante verde de las mitocondrias tiene un pico de excitación a 490 nm y un pico de emisión a 516 nm; Se puede excitar usando un láser de 488 nm. El colorante lisosómico rojo tiene un pico de excitación a 576 nm y un pico de emisión a 590 nm; Se puede excitar usando un láser de 543 nm.

4. Análisis de imágenes

1. Abra la imagen guardada con ImageJ e importe la imagen combinada en ella.
2. Cuente manualmente el número de puntos amarillos en cada celda, que indican que el lisosoma está envolviendo a las mitocondrias.

Resultados

MitoTracker Green es una tinción mitocondrial verde-fluorescente que es capaz de localizar con precisión las mitocondrias. El colorante puede teñir fácilmente las células vivas y es menos eficaz para teñir las células muertas o fijadas en aldehído (Figura 2). El colorante lisosómico rojo-fluorescente LysoTracker Red es capaz de etiquetar y rastrear orgánulos lisosomales ácidos y solo puede teñir células vivas (Figura 2). La imagen del microscopio co...

Discusión

El protocolo descrito aquí proporciona un método para evaluar y monitorear el proceso dinámico de la mitofagia en células vivas, que involucra autofagosomas, lisosomas y fisión mitocondrial, a través de la tinción conjunta con mitocondrias permisas y colorantes lisosómicos permisionales. El método también se puede utilizar para identificar mitocondrias y evaluar la morfología mitocondrial. Ambos colorantes utilizados en este estudio deben protegerse de la luz, deben evitarse los ciclos múltiples de congelaci?...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automated cell counter	Countstar	IC1000
Cell counting chamber slides	Countstar	12-0005-50
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)	Corning	10-013-CV
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Corning	21-031-CVC
Glass bottom cell culture dish (confocal dish)	NEST	801002
Image J (Rasband, NIH)	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Krebs–Henseleit(KHB) buffer			Self-prepared
LysoTracker Red	Invitrogen	1818430	100 µmol/L, red-fluorescent lysosome dye
MitoTracker Green	Invitrogen	1842298	200 µmol/L stock, green-fluorescent mitochondria dye
Mouse Embryonic Fibroblasts			Self-prepared
Objective (63x oil lens)	ZEISS	ZEISS LSM 880
Trypsin-EDTA 0.25%	Gibico	Cat# 25200056
ZEISS LSM 880 Confocal Laser Scanning Microscope	ZEISS	ZEISS LSM 880
ZEN Microscopy Software 2.1 (confocal microscope imaging software)	ZEISS	ZEN 2.1