הדמיה של מיטופגיה עם צבעים פלואורסצנטיים למיטוכונדריה וליזוזום

Summary

מיטופגיה היא המנגנון העיקרי של בקרת איכות מיטוכונדריאלית. עם זאת, ההערכה של mitophagy in vivo הוא הפריע על ידי היעדר בדיקות כמותיות אמין. מוצג כאן פרוטוקול לתצפית על מיטופגיה בתאים חיים באמצעות צבע מיטוכונדריה ירוק-פלואורסצנטי המיועד לתאים וצבע ליזוזום אדום-פלואורסצנטי.

Abstract

מיטוכונדריה, בהיותה תחנות הכוח של התא, ממלאת תפקידים חשובים בביו-אנרגיה, יצירת רדיקלים חופשיים, הומאוסטזיס סידן ואפופטוזיס. מיטופגיה היא המנגנון העיקרי של בקרת איכות מיטוכונדריאלית והיא נחקרת בדרך כלל באמצעות תצפית מיקרוסקופית, אולם מבחני מיטופגיה in vivo קשים לביצוע. הערכת מיטופגיה על ידי הדמיית אברונים חיים היא שיטה חלופית והכרחית למחקר מיטוכונדריאלי. פרוטוקול זה מתאר את ההליכים לשימוש בצבע המיטוכונדריה הירוק-פלואורסצנטי של התאים MitoTracker Green ובצבע הליזוזום האדום-פלואורסצנטי LysoTracker Red בתאים חיים, כולל העמסת הצבעים, הדמיה של המיטוכונדריה והליזוזום, והתוצאות הצפויות. שלבים מפורטים להערכת mitophagy בתאים חיים, כמו גם הערות טכניות על הגדרות תוכנה מיקרוסקופ, מסופקים גם. שיטה זו יכולה לסייע לחוקרים לצפות במיטופגיה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של תאים חיים. בנוסף, ניתן להשתמש בו כדי לכמת מיטוכונדריה וליזוזומים ולהעריך מורפולוגיה מיטוכונדריאלית.

Introduction

מיטוכונדריה הם תחנות הכוח של כמעט כל התאים האאוקריוטים ^1,2. בנוסף לייצור ATP באמצעות פוספורילציה חמצונית, המיטוכונדריה ממלאת תפקיד חיוני בתהליכים אחרים כגון ביו-אנרגיה, הומאוסטזיס סידן, יצירת רדיקלים חופשיים, אפופטוזיס והומאוסטזיס תאי ^3,4,5. כאשר המיטוכונדריה מייצרת מיני חמצן תגובתי (ROS) ממספר קומפלקסים בשרשרת הובלת האלקטרונים, הם מגורה כל הזמן על ידי עקה חמצונית פוטנציאלית, מה שעלול להוביל בסופו של דבר לנזק מבני ולתפקוד לקוי כאשר מערכת ההגנה נוגדת החמצון קורסת ^6,7. נמצא כי תפקוד לקוי של המיטוכונדריה תורם למחלות רבות, כולל הפרעות מטבוליות, ניוון עצבי ומחלות לב וכלי דם⁸. לכן, חיוני לשמור על אוכלוסיות מיטוכונדריאליות בריאות ועל תפקודן התקין. מיטוכונדריה הם אברונים פלסטיים ודינמיים מאוד; המורפולוגיה והתפקוד שלהם נשלטים על ידי מנגנוני בקרת איכות מיטוכונדריאליים, כולל שינויים לאחר תרגום (PTM) של חלבונים מיטוכונדריאליים, ביוגנזה מיטוכונדריאלית, איחוי, ביקוע ומיטופגיה ^9,10. ביקוע מיטוכונדריאלי בתיווך חלבון 1 הקשור לדינמין (DRP1), GTPase של משפחת-העל של הדינמין של חלבונים, יוצר מיטוכונדריה קטנה ועגולה ומבודד את המיטוכונדריה הלא מתפקדת, אשר ניתנת לניקוי ולפירוק על ידי מיטופגיה^11,12.

מיטופגיה היא תהליך תאי המפרק באופן סלקטיבי את המיטוכונדריה על ידי אוטופגיה, המתרחשת בדרך כלל במיטוכונדריה פגומה בעקבות פציעה, הזדקנות או סטרס. לאחר מכן, מיטוכונדריה אלה מועברים לליזוזומים לצורך פירוק¹⁰. לפיכך, מיטופגיה היא תהליך קטבולי המסייע בשמירה על כמות ואיכות המיטוכונדריה במצב בריא במגוון רחב של סוגי תאים. הוא ממלא תפקיד מכריע בשיקום הומאוסטזיס תאי בתנאי פיזיולוגיה ועקה רגילים^13,14. התאים מאופיינים במנגנון מיטופגיה מורכב, המושרה על ידי אותות שונים של לחץ תאי ושינויים התפתחותיים. מסלולי ויסות מיטופגיים מסווגים כתלויי יוביקוויטין או תלויי קולטן^15,16; האוטופגיה התלויה באוביקוויטין מתווכת על ידי קינאז PINK1 וגיוס של אוביקוויטין ליגאז פרקין E3 למיטוכונדריה 17,18^, בעוד שאוטופגיה תלוית קולטן כרוכה בקשירת קולטני אוטופגיה לשרשרת האור החלבונית הקשורה למיקרוטובול LC3 המתווכת מיטופגיה בתגובה לנזק למיטוכונדריה¹⁹.

מיקרוסקופיית אלקטרונים (TEM) היא השיטה הנפוצה ביותר, ועדיין אחת השיטות הטובות ביותר, כדי לבחון ולזהות mitophagy²⁰. המאפיינים המורפולוגיים של מיטופגיה הם אוטופגוזומים או אוטוליזוזומים הנוצרים על ידי היתוך של אוטופגוזומים עם ליזוזומים, אשר ניתן לצפות בהם מתמונות מיקרוסקופיית אלקטרונים²¹. החולשה של מיקרוסקופיית אלקטרונים (EM), לעומת זאת, היא חוסר היכולת לנטר את התהליכים הדינמיים של מיטופגיה, כגון דה-פולריזציה של המיטוכונדריה, ביקוע מיטוכונדריאלי ואיחוי של אוטופגוזומים וליזוזומים, בתא החי²⁰. לפיכך, הערכת מיטופגיה באמצעות הדמיה של אברונים חיים היא שיטה חלופית אטרקטיבית למחקר מיטוכונדריאלי. טכניקת הדמיית התאים החיים המתוארת כאן משתמשת בשני צבעים פלואורסצנטיים כדי להכתים את המיטוכונדריה ואת הליזוזומים. כאשר מתרחשת מיטופגיה, מיטוכונדריה פגומה או מיותרת שנבלעת על ידי אוטופגוזומים מוכתמת בירוק על ידי הצבע המיטוכונדריאלי, בעוד שהצבע האדום מכתים את הליזוזומים. ההיתוך של אוטופגוזומים וליזוזומים אלה, המכונים אוטוליזוזומים, גורם לפלואורסצנציה הירוקה והאדומה לחפוף ולהתבטא כנקודות צהובות, ובכך מצביע על התרחשות של מיטופגיה²². צבע המיטוכונדריה בעל התכולה (MitoTracker Green) מכיל מואטי כלורומתיל בעל תגובת קלה של תיול כדי לסמן את המיטוכונדריה²³. כדי לתייג את המיטוכונדריה, התאים פשוט דוגרים עם הצבע, אשר מתפזר באופן פסיבי על פני קרום הפלזמה ומצטבר במיטוכונדריה פעילה. צבע מיטוכונדריה זה יכול בקלות להכתים תאים חיים, והוא פחות יעיל בהכתמת תאים קבועים או מתים של אלדהיד. צבע ליזוזום (LysoTracker Red) הוא גשושית פלואורסצנטית חומצית המשמשת לתיוג ומעקב אחר אברונים חומציים בתאים חיים. צבע זה מפגין סלקטיביות גבוהה עבור אברונים חומציים ויכול לסמן ביעילות תאים חיים בריכוזים ננומולריים²⁴.

ההליכים לשימוש בצבעים פלואורסצנטיים אלה בתאים חיים, כולל טעינת הצבעים והדמיה של מיטוכונדריה וליזוזומים, מוצגים כאן. שיטה זו יכולה לסייע לחוקרים לצפות במיטופגיה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של תאים חיים. ניתן להשתמש בו גם לכימות מיטוכונדריה וליזוזומים, ולהערכת מורפולוגיה מיטוכונדריאלית.

Protocol

1. תרבית תאים ומעבר

הערה: הפרוטוקול מתואר באמצעות פיברובלסטים עובריים (MEFs) של עכברים בתרבית שגרתית כדוגמה.

1. תרבית תאי MEF במנות תרבית תאים בקוטר 10 ס"מ עם 10 מ"ל של מדיום הנשר המתוקן (DMEM) של דולבקו. דגירה ב-37°C ו-5% CO₂ וניטור התאים תחת מיקרוסקופ בהגדלה של פי 100.
2. בצע העברת תאים שגרתית.
   1. כאשר התאים מגיעים למפגש של 80%-90% (כל 3 ימים), שטפו את התאים עם 2 מ"ל של תמיסת מלח עם מאגר פוספטים (DPBS) של דולבקו. לאחר מכן להוסיף 2 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA במשך דקה אחת כדי לנתק את התאים, ואחריו 2 מ"ל של DMEM כדי לעצור את הפעולה של טריפסין-EDTA. צנטריפוגה של מתלה התא ב 100 x g במשך 3 דקות להשעות את גלולת התא ב 1 מ"ל של DMEM.
   2. ספרו את התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי ושקופיות תא ספירת תאים (ראו טבלת חומרים), ולאחר מכן חסן 1.5 x 10^{6 תאים} לתוך צלחת תרבית תאים חדשה בגודל 10 ס"מ המכילה 10 מ"ל של DMEM.
3. עבור הבדיקה mitophagy, להכין השעיה התא כמו בשלב 1.2.1. דלל את מתלה התא ל-1 x 10^{5 תאים} למ"ל ב-DMEM טרי.
4. הוסיפו 2 מ"ל מתלי התאים המדוללים לצלחת קונפוקלית בקוטר 20 מ"מ (ראו טבלת חומרים) ונערו את צלחת התרבית ב"צלב". לדגום את צלחת תרבית התאים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ במשך 24 שעות.

2. כתמים במיטוכונדריה

1. הסר את תמיסת המניות של הצבע המיטוכונדריאלי הירוק-פלואורסצנטי וצבע ליזוזום פלואורסצנטי אדום (ראו טבלת חומרים) מהמקפיא בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
2. הכן פתרונות עבודה של הצבעים על ידי דילול פתרונות המלאי 1:1,000 ב- DMEM וערבב היטב. לדוגמה, הוסף 2 μL כל אחד של 1 mM צבע מיטוכונדריאלי וצבע ליזוזום ל 2 מ"ל של DMEM כדי לקבל ריכוז עבודה של 1 μM עבור שני הצבעים.
3. מוציאים את המדיום מצלחת התרבית הקונפוקלית (שלב 1.4). הוסף 1 מ"ל של תמיסת צביעה (מוכן בשלב 2.2) כדי לכסות את התאים. מניחים את צלחת תרבית התאים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ למשך 20-30 דקות.

3. הדמיה קונפוקלית

1. הכינו 1 ליטר של חיץ קרבס-הנסלייט (KH) (138.2 mM NaCl, 3.7 mM KCl, 0.25 mM CaCl 2, 1.2 mM KH 2 PO 4, 1.2 mM MgSO 4.7H₂O, 15 mM גלוקוז ו-21.85 mM HEPES; pH סופי 7.4) ואחסנו_ב-4 °C (עד חודש אחד).
2. ביום ההדמיה הקונפוקלית, מוציאים מראש את חיץ ה-KH מהמקרר ומחממים אותו מראש לטמפרטורת החדר (20 עד 25 מעלות צלזיוס).
3. הגדר את הפרמטרים של תוכנת ההדמיה של מיקרוסקופיה קונפוקלית (ראה טבלת חומרים): עבור תמונות עירור כפולות, השתמש בעירור רציף ב- 488 ננומטר ו- 543 ננומטר, ואסוף פליטה ב- 505-545 ננומטר ו- >560 ננומטר, בהתאמה.
   הערה: הגדר את הגדרות ההדמיה באופן הבא. מצב סריקה: מסגרת; מהירות: 9; ממוצע: מספר, 1; רווח: 450 עד 600; חור סיכה: 30 עד 200; לייזר: <10%. עדיף להפעיל את תוכנת ההדמיה תחילה ולאחר מכן להפעיל לחלוטין את לייזר 488 ננומטר. יש להפעיל ולייצב את הלייזר בקוטר 543 ננומטר למשך 3-5 דקות לפני השימוש (איור 1A).
4. הסר את מדיום התרבית המכיל את הצבע מהאינקובטור (שלב 2.3) והוסף 1 מ"ל של חיץ KH לצלחת.
5. כדי לגרום למיטופגיה, טפלו בתאים עם קרבוניל ציאניד-4-(טריפלואורומתוקסי) פנילהידרזון (FCCP) ב-1 מיקרומטר (ריכוז סופי) במאגר KH למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ומיד המשיכו לדמות את התאים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.
6. יש למרוח כמות מתאימה של שמן על החלק העליון של עדשת השמן 63x (ראו טבלת חומרים). הניחו את דגימת התא על שלב הדגימה של המיקרוסקופ הקונפוקלי והזיזו אותה ישירות מעל העדשה האובייקטיבית.
7. השתמש בתוכנת ההדמיה כדי למצוא את הדוגמה על-ידי לחיצה על הכרטיסיה איתור בפינה השמאלית העליונה של ממשק התוכנה (איור 1B). בחרו ערכת מסננים ירוקה לניסוי.
8. השתמש בידית הכוונון הגסה כדי להתמקד במהירות על-ידי הזזת העדשה האובייקטיבית למעלה ולמטה. לאחר שדגימת התא נראית בבירור דרך העינית, חפש ומקד את האזור של תאים בודדים והזז אותו למרכז שדה הראייה.
9. לחץ על רכישה הכרטיסייה בפינה השמאלית העליונה בממשק התוכנה כדי לקבל תמונות. בחר רק את ערוץ 488 ננומטר ואת רזולוציית המסגרת 1024 x 1024 לתצוגה מקדימה.
10. לחץ על הכרטיסייה Live בפינה הימנית העליונה כדי להתחיל סריקה בשידור חי. כוונן את שדה הראייה לחד ביותר וכוונן את עוצמת הלייזר על-ידי הזזת המחוון שמאלה או ימינה (איור 1A). שמור על הגדרת הרווח מתחת ל-600 כדי למנוע חשיפת יתר.
11. התאם את ערך חור הסיכה ל- 156, ערך ההקזת הערך ל- 545 וערך ההסטה הדיגיטלית ל- 0.
12. בחר את שדה הראייה הטוב ביותר, בדוק את שני הערוצים (488 ננומטר ו- 543 ננומטר) ובחר ברזולוציית המסגרת 1024 x 1024. לחץ על הצמד כדי לקבל תמונות דו-ממדיות. שמור את התמונות שנרכשו.
    הערה: לצבע המיטוכונדריה הירוק יש שיא עירור ב-490 ננומטר ושיא פליטה ב-516 ננומטר; זה יכול להיות נרגש באמצעות לייזר 488 ננומטר. לצבע הליזוזום האדום יש שיא עירור ב-576 ננומטר ושיא פליטה ב-590 ננומטר; זה יכול להיות נרגש באמצעות לייזר 543 ננומטר.

4. ניתוח תמונות

1. פתח את התמונה שנשמרה באמצעות ImageJ וייבא לתוכה את התמונה הממוזגת.
2. ספרו ידנית את מספר הנקודות הצהובות בכל תא, המציינות כי הליזוזום בולע את המיטוכונדריה.

תוצאות

MitoTracker Green הוא כתם מיטוכונדריאלי ירוק-פלואורסצנטי המסוגל למקם במדויק את המיטוכונדריה. הצבע יכול בקלות להכתים תאים חיים והוא פחות יעיל בהכתמת תאים קבועים או מתים של אלדהיד (איור 2). צבע הליזוזום האדום-פלואורסצנטי LysoTracker Red מסוגל לסמן ולעקוב אחר אברונים ליזוזומליים חומציים וי...

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן מספק שיטה להערכה ולניטור התהליך הדינמי של מיטופגיה בתאים חיים, הכולל אוטופגוזומים, ליזוזומים וביקוע מיטוכונדריאלי, באמצעות צביעה משותפת עם מיטוכונדריה וצבעי ליזוזום המיועדים לתאים. השיטה יכולה לשמש גם לזיהוי מיטוכונדריה ולהערכת מורפולוגיה מיטוכונדריאלית. שני הצבע...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automated cell counter	Countstar	IC1000
Cell counting chamber slides	Countstar	12-0005-50
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)	Corning	10-013-CV
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Corning	21-031-CVC
Glass bottom cell culture dish (confocal dish)	NEST	801002
Image J (Rasband, NIH)	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Krebs–Henseleit(KHB) buffer			Self-prepared
LysoTracker Red	Invitrogen	1818430	100 µmol/L, red-fluorescent lysosome dye
MitoTracker Green	Invitrogen	1842298	200 µmol/L stock, green-fluorescent mitochondria dye
Mouse Embryonic Fibroblasts			Self-prepared
Objective (63x oil lens)	ZEISS	ZEISS LSM 880
Trypsin-EDTA 0.25%	Gibico	Cat# 25200056
ZEISS LSM 880 Confocal Laser Scanning Microscope	ZEISS	ZEISS LSM 880
ZEN Microscopy Software 2.1 (confocal microscope imaging software)	ZEISS	ZEN 2.1