Visualizzazione della mitofagia con coloranti fluorescenti per mitocondri e lisosomi

Riepilogo

La mitofagia è il meccanismo primario del controllo di qualità mitocondriale. Tuttavia, la valutazione della mitofagia in vivo è ostacolata dalla mancanza di saggi quantitativi affidabili. Presentato qui è un protocollo per l'osservazione della mitofagia nelle cellule viventi utilizzando un colorante mitocondriale fluorescente verde e un colorante lisosoma rosso-fluorescente.

Abstract

I mitocondri, essendo le centrali elettriche della cellula, svolgono ruoli importanti nella bioenergetica, nella generazione di radicali liberi, nell'omeostasi del calcio e nell'apoptosi. La mitofagia è il meccanismo primario del controllo della qualità mitocondriale ed è generalmente studiata utilizzando l'osservazione microscopica, tuttavia i saggi di mitofagia in vivo sono difficili da eseguire. La valutazione della mitofagia mediante imaging di organelli vivi è un metodo alternativo e necessario per la ricerca mitocondriale. Questo protocollo descrive le procedure per l'utilizzo del colorante mitocondriale fluorescente verde MitoTracker Green e del colorante lisosoma rosso-fluorescente LysoTracker Red nelle cellule vive, compreso il caricamento dei coloranti, la visualizzazione dei mitocondri e del lisosoma e i risultati attesi. Vengono inoltre forniti passaggi dettagliati per la valutazione della mitofagia in cellule vive, nonché note tecniche sulle impostazioni del software del microscopio. Questo metodo può aiutare i ricercatori a osservare la mitofagia usando la microscopia fluorescente a cellule vive. Inoltre, può essere utilizzato per quantificare mitocondri e lisosomi e valutare la morfologia mitocondriale.

Introduzione

I mitocondri sono le centrali elettriche di quasi tutte le cellule eucariotiche ^1,2. Oltre alla produzione di ATP attraverso la fosforilazione ossidativa, i mitocondri svolgono un ruolo vitale in altri processi come la bioenergetica, l'omeostasi del calcio, la generazione di radicali liberi, l'apoptosi e l'omeostasi cellulare ^3,4,5. Poiché i mitocondri generano specie reattive dell'ossigeno (ROS) da più complessi nella catena di trasporto degli elettroni, sono costantemente stimolati da potenziale stress ossidativo, che può eventualmente portare a danni strutturali e disfunzioni quando il sistema di difesa antiossidante collassa ^6,7. È stato scoperto che la disfunzione mitocondriale contribuisce a molte malattie, tra cui disturbi metabolici, neurodegenerazione e malattie cardiovascolari⁸. Pertanto, è fondamentale mantenere sane le popolazioni mitocondriali e la loro corretta funzione. I mitocondri sono organelli altamente plastici e dinamici; la loro morfologia e funzione sono controllate da meccanismi di controllo della qualità mitocondriale, comprese le modificazioni post-traduzionali (PTM) delle proteine mitocondriali, la biogenesi mitocondriale, la fusione, la fissione e la mitofagia ^9,10. La fissione mitocondriale mediata dalla proteina 1 correlata alla dinamina (DRP1), una GTPasi della superfamiglia di proteine della dinamina, provoca mitocondri piccoli e rotondi e isola i mitocondri disfunzionali, che possono essere eliminati e degradati dalla mitofagia^11,12.

La mitofagia è un processo cellulare che degrada selettivamente i mitocondri per autofagia, di solito si verifica nei mitocondri danneggiati a seguito di lesioni, invecchiamento o stress. Successivamente, questi mitocondri vengono consegnati ai lisosomi per la degradazione¹⁰. Pertanto, la mitofagia è un processo catabolico che aiuta a mantenere la quantità e la qualità dei mitocondri in uno stato sano in una vasta gamma di tipi di cellule. Svolge un ruolo cruciale nel ripristino dell'omeostasi cellulare in normali condizioni fisiologiche e di stress^13,14. Le cellule sono caratterizzate da un complesso meccanismo mitofagia, che è indotto da diversi segnali di stress cellulare e cambiamenti dello sviluppo. Le vie regolatorie della mitofagia sono classificate come ubiquitina-dipendenti o recettore-dipendenti^15,16; l'autofagia ubiquitina-dipendente è mediata dalla chinasi PINK1 e dal reclutamento dell'ubiquitina ligasi Parkin E3 nei mitocondri 17,18^, mentre l'autofagia recettore-dipendente comporta il legame dei recettori dell'autofagia alla catena leggera LC3 della proteina associata ai microtubuli che media la mitofagia in risposta al danno mitocondriale¹⁹.

La microscopia elettronica a trasmissione (TEM) è il metodo più comunemente usato, e ancora uno dei metodi migliori, per osservare e rilevare la mitofagia²⁰. Le caratteristiche morfologiche della mitofagia sono autofagosomi o autolisosomi formati dalla fusione di autofagosomi con lisosomi, che possono essere osservati da immagini al microscopio elettronico²¹. La debolezza della microscopia elettronica (EM), tuttavia, è l'incapacità di monitorare i processi dinamici della mitofagia, come la depolarizzazione mitocondriale, la fissione mitocondriale e la fusione di autofagosomi e lisosomi, nella cellula vivente²⁰. Pertanto, la valutazione della mitofagia attraverso l'imaging degli organelli viventi è un metodo alternativo interessante per la ricerca mitocondriale. La tecnica di imaging delle cellule vive qui descritta utilizza due coloranti fluorescenti per colorare mitocondri e lisosomi. Quando si verifica la mitofagia, i mitocondri danneggiati o superflui inghiottiti dagli autofagosomi sono macchiati di verde dal colorante mitocondriale, mentre il colorante rosso colora i lisosomi. La fusione di questi autofagosomi e lisosomi, indicati come autolisosomi, fa sì che la fluorescenza verde e rossa si sovrapponga e si manifesti come punti gialli, indicando così la presenza di mitofagia²². Il colorante mitocondriale permeato dalle cellule (MitoTracker Green) contiene una porzione di clorometil leggermente tiolo-reattiva per etichettare i mitocondri²³. Per marcare i mitocondri, le cellule vengono semplicemente incubate con il colorante, che si diffonde passivamente attraverso la membrana plasmatica e si accumula nei mitocondri attivi. Questo colorante mitocondriale può facilmente macchiare le cellule vive ed è meno efficace nella colorazione delle cellule morte o fissate con aldeidi. Il colorante lisosoma (LysoTracker Red) è una sonda acidotropica fluorescente utilizzata per l'etichettatura e il monitoraggio degli organelli acidi nelle cellule vive. Questo colorante presenta un'elevata selettività per gli organelli acidi e può marcare efficacemente le cellule vive a concentrazioni nanomolari²⁴.

Le procedure per l'utilizzo di questi coloranti fluorescenti nelle cellule viventi, compreso il caricamento dei coloranti e la visualizzazione di mitocondri e lisosomi, sono presentate qui. Questo metodo può aiutare i ricercatori a osservare la mitofagia usando la microscopia fluorescente a cellule vive. Può anche essere usato per quantificare mitocondri e lisosomi e valutare la morfologia mitocondriale.

Protocollo

1. Coltura cellulare e passaggio

NOTA: Il protocollo è descritto utilizzando fibroblasti embrionali di topo (MEF) coltivati di routine come esempio.

1. Colture di cellule MEF in piastre di coltura cellulare da 10 cm con 10 ml di Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco. Incubare a 37 °C e 5% di CO₂ e monitorare le cellule al microscopio con un ingrandimento di 100x.
2. Eseguire il passaggio cellulare di routine.
   1. Quando le cellule raggiungono l'80%-90% di confluenza (ogni 3 giorni), lavare le cellule con 2 ml di soluzione salina tamponata fosfato di Dulbecco (DPBS). Quindi aggiungere 2 ml di tripsina-EDTA allo 0,05% per 1 minuto per dissociare le cellule, seguito da 2 ml di DMEM per fermare l'azione della tripsina-EDTA. Centrifugare la sospensione cellulare a 100 x g per 3 minuti e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di DMEM.
   2. Contare le cellule utilizzando un contatore automatico delle cellule e vetrini della camera di conteggio delle cellule (vedere Tabella dei materiali), quindi inoculare 1,5 x 10⁶ cellule in un nuovo piatto di coltura cellulare da 10 cm contenente 10 ml di DMEM.
3. Per il saggio della mitofagia, preparare una sospensione cellulare come al punto 1.2.1. Diluire la sospensione cellulare a 1 x 10⁵ cellule/ml in DMEM fresco.
4. Aggiungere 2 mL della sospensione cellulare diluita in un piatto confocale da 20 mm (vedere Tabella dei materiali) e agitare il piatto di coltura in una "croce". Incubare il piatto di coltura cellulare in un incubatore a 37 °C, 5% CO₂ per 24 ore.

2. Colorazione mitocondriale

1. Rimuovere le aliquote della soluzione madre del colorante mitocondriale fluorescente verde e del colorante lisosoma fluorescente rosso (vedere tabella dei materiali) dal congelatore a -20 °C.
2. Preparare le soluzioni di lavoro dei coloranti diluendo le soluzioni stock 1:1.000 in DMEM e mescolare bene. Ad esempio, aggiungere 2 μL ciascuno di 1 mM di colorante mitocondriale e colorante lisosoma a 2 ml di DMEM per ottenere una concentrazione di lavoro di 1 μM per entrambi i coloranti.
3. Rimuovere il terreno dal piatto di coltura confocale (punto 1.4). Aggiungere 1 mL della soluzione colorante (preparata al punto 2.2) per coprire le cellule. Porre il piatto di coltura cellulare in un'incubatrice a 37 °C, 5% CO₂ per 20-30 min.

3. Imaging confocale

1. Preparare 1 L di tampone Krebs-Henseleit (KH) (138,2 mM NaCl, 3,7 mM KCl, 0,25 mM CaCl 2, 1,2 mM KH 2 PO 4, 1,2 mM MgSO 4,7H₂O, 15 mM glucosio e 21,85 mM HEPES;pH finale 7,4) e conservare a₄ °C (fino a 1 mese).
2. Il giorno dell'imaging confocale, rimuovere preventivamente il tampone KH dal frigorifero e preriscaldarlo a temperatura ambiente (da 20 a 25 °C).
3. Impostare i parametri del software di imaging per microscopia confocale (vedere Tabella dei materiali): per le immagini a doppia eccitazione, utilizzare l'eccitazione sequenziale a 488 nm e 543 nm e raccogliere l'emissione rispettivamente a 505-545 nm e >560 nm.
   NOTA: impostare le impostazioni di imaging come segue. Modalità di scansione: fotogramma; Velocità: 9; Media: numero, 1; Guadagno: da 450 a 600; Foro stenopeico: da 30 a 200; Laser: <10%. È meglio avviare prima il software di imaging e quindi accendere completamente il laser a 488 nm. Il laser a 543 nm deve essere acceso e stabilizzato per 3-5 minuti prima dell'uso (Figura 1A).
4. Rimuovere il terreno di coltura contenente il colorante dall'incubatore (punto 2.3) e aggiungere 1 mL di tampone KH al piatto.
5. Per indurre la mitofagia, trattare le cellule con carbonil-cianuro-4-(trifluorometossi) fenilidrazone (FCCP) a 1 μM (concentrazione finale) in tampone KH per 10 minuti a temperatura ambiente e procedere immediatamente all'immagine delle cellule utilizzando il microscopio confocale.
6. Applicare una quantità appropriata di olio sulla parte superiore della lente dell'olio 63x (vedere Tabella dei materiali). Posizionare il campione cellulare sullo stadio del campione del microscopio confocale e spostarlo direttamente sopra la lente dell'obiettivo.
7. Utilizzare il software di imaging per trovare l'esempio facendo clic sulla scheda Trova nell'angolo superiore sinistro dell'interfaccia software (Figura 1B). Seleziona un set di filtri verde per l'esperimento.
8. Utilizzare la manopola di regolazione grossolana per mettere a fuoco rapidamente spostando l'obiettivo verso l'alto e verso il basso. Dopo che il campione di cellule è chiaramente visibile attraverso l'oculare, cercare e focalizzare l'area delle singole cellule e spostarla al centro del campo visivo.
9. Fare clic sulla scheda Acquisizione nell'angolo in alto a sinistra nell'interfaccia del software per acquisire immagini. Selezionare solo il canale a 488 nm e la risoluzione del fotogramma 1024 x 1024 per l'anteprima.
10. Fare clic sulla scheda Live nell'angolo in alto a sinistra per avviare una scansione dal vivo. Regolare il campo visivo al massimo e regolare la potenza del laser spostando il cursore a sinistra o a destra (Figura 1A). Mantenere l'impostazione del guadagno al di sotto di 600 per evitare la sovraesposizione.
11. Regolate il valore stenopeico su 156, il valore di guadagno su 545 e il valore di offset digitale su 0.
12. Seleziona il miglior campo visivo, controlla i due canali (488 nm e 543 nm) e scegli la risoluzione del fotogramma 1024 x 1024. Fare clic su Snap per acquisire immagini 2D. Salvare le immagini acquisite.
    NOTA: Il colorante mitocondriale verde ha un picco di eccitazione a 490 nm e un picco di emissione a 516 nm; Può essere eccitato usando un laser a 488 nm. Il colorante lisosoma rosso ha un picco di eccitazione a 576 nm e un picco di emissione a 590 nm; Può essere eccitato utilizzando un laser a 543 nm.

4. Analisi delle immagini

1. Aprire l'immagine salvata con ImageJ e importarvi l'immagine unita.
2. Contare manualmente il numero di punti gialli in ogni cellula, che indicano che il lisosoma sta inghiottendo i mitocondri.

Risultati

MitoTracker Green è una colorazione mitocondriale verde-fluorescente che è in grado di localizzarsi con precisione nei mitocondri. Il colorante può facilmente macchiare le cellule vive ed è meno efficace nella colorazione delle cellule fissate o morte con aldeide (Figura 2). Il colorante lisosoma rosso-fluorescente LysoTracker Red è in grado di marcare e tracciare organelli lisosomiali acidi e può solo macchiare cellule vive (Figura 2). L'imaging al micros...

Discussione

Il protocollo qui descritto fornisce un metodo per valutare e monitorare il processo dinamico della mitofagia nelle cellule viventi, che coinvolge autofagosomi, lisosomi e fissione mitocondriale, attraverso la co-colorazione con mitocondri e coloranti lisosomi. Il metodo può anche essere utilizzato per identificare i mitocondri e valutare la morfologia mitocondriale. Entrambi i coloranti utilizzati in questo studio dovrebbero essere protetti dalla luce, dovrebbero essere evitati cicli multipli di gelo-scongelamento e i ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automated cell counter	Countstar	IC1000
Cell counting chamber slides	Countstar	12-0005-50
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)	Corning	10-013-CV
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Corning	21-031-CVC
Glass bottom cell culture dish (confocal dish)	NEST	801002
Image J (Rasband, NIH)	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Krebs–Henseleit(KHB) buffer			Self-prepared
LysoTracker Red	Invitrogen	1818430	100 µmol/L, red-fluorescent lysosome dye
MitoTracker Green	Invitrogen	1842298	200 µmol/L stock, green-fluorescent mitochondria dye
Mouse Embryonic Fibroblasts			Self-prepared
Objective (63x oil lens)	ZEISS	ZEISS LSM 880
Trypsin-EDTA 0.25%	Gibico	Cat# 25200056
ZEISS LSM 880 Confocal Laser Scanning Microscope	ZEISS	ZEISS LSM 880
ZEN Microscopy Software 2.1 (confocal microscope imaging software)	ZEISS	ZEN 2.1