Visualizando a mitofagia com corantes fluorescentes para mitocôndrias e lisossomos

Resumo

A mitofagia é o principal mecanismo de controle de qualidade mitocondrial. No entanto, a avaliação da mitofagia in vivo é dificultada pela falta de ensaios quantitativos confiáveis. Apresenta-se aqui um protocolo para a observação da mitofagia em células vivas usando um corante de mitocôndrias verde-fluorescente per-celular e um corante lisossomático vermelho-fluorescente.

Resumo

As mitocôndrias, sendo as potências da célula, desempenham papéis importantes na bioenergética, geração de radicais livres, homeostase do cálcio e apoptose. A mitofagia é o principal mecanismo de controle de qualidade mitocondrial e geralmente é estudada usando observação microscópica, no entanto, ensaios de mitofagia in vivo são difíceis de realizar. A avaliação da mitofagia por imagem de organelas vivas é um método alternativo e necessário para a pesquisa mitocondrial. Este protocolo descreve os procedimentos para o uso do corante de mitocôndrias verde-fluorescentes persignificado por células MitoTracker Green e o corante lisossomo vermelho-fluorescente LysoTracker Red em células vivas, incluindo a carga dos corantes, visualização das mitocôndrias e do lisossomo e resultados esperados. Etapas detalhadas para a avaliação da mitofagia em células vivas, bem como notas técnicas sobre as configurações do software do microscópio, também são fornecidas. Este método pode ajudar os pesquisadores a observar a mitofagia usando microscopia fluorescente de células vivas. Além disso, pode ser usado para quantificar mitocôndrias e lisossomos e avaliar a morfologia mitocondrial.

Introdução

As mitocôndrias são as potências de quase todas as células eucarióticas ^1,2. Além da produção de ATP por meio da fosforilação oxidativa, as mitocôndrias desempenham um papel vital em outros processos, como bioenergética, homeostase do cálcio, geração de radicais livres, apoptose e homeostase celular ^3,4,5. À medida que as mitocôndrias geram espécies reativas de oxigênio (EROs) a partir de múltiplos complexos na cadeia de transporte de elétrons, elas são constantemente estimuladas pelo potencial estresse oxidativo, o que pode eventualmente levar a danos estruturais e disfunção quando o sistema de defesa antioxidante entra em colapso ^6,7. Descobriu-se que a disfunção mitocondrial contribui para muitas doenças, incluindo distúrbios metabólicos, neurodegeneração e doenças cardiovasculares⁸. Portanto, é crucial manter populações mitocondriais saudáveis e sua função adequada. As mitocôndrias são organelas altamente plásticas e dinâmicas; sua morfologia e função são controladas por mecanismos de controle de qualidade mitocondrial, incluindo modificações pós-translacionais (PTM) de proteínas mitocondriais, biogênese mitocondrial, fusão, fissão e mitofagia ^9,10. A fissão mitocondrial mediada pela proteína 1 relacionada à dinamina (DRP1), uma GTPase da superfamília de proteínas dinamina, resulta em mitocôndrias pequenas e redondas e isola as mitocôndrias disfuncionais, que podem ser eliminadas e degradadas pela mitofagia^11,12.

A mitofagia é um processo celular que degrada seletivamente as mitocôndrias por autofagia, geralmente ocorrendo em mitocôndrias danificadas após lesão, envelhecimento ou estresse. Posteriormente, essas mitocôndrias são entregues aos lisossomos para degradação¹⁰. Assim, a mitofagia é um processo catabólico que ajuda a manter a quantidade e a qualidade das mitocôndrias em um estado saudável em uma ampla gama de tipos de células. Desempenha um papel crucial na restauração da homeostase celular em condições fisiológicas e de estresse normais^13,14. As células são caracterizadas por um complexo mecanismo de mitofagia, que é induzido por diferentes sinais de estresse celular e alterações no desenvolvimento. As vias reguladoras da mitofagia são classificadas em dependentes de ubiquitina ou dependentes de receptores^15,16; a autofagia dependente de ubiquitina é mediada pela quinase PINK1 e pelo recrutamento da ubiquitina ligase Parkin E3 para as mitocôndrias 17,18^, enquanto a autofagia receptor-dependente envolve a ligação dos receptores de autofagia à LC3 da cadeia leve da proteína associada aos microtúbulos que medeia a mitofagia em resposta ao dano mitocondrial¹⁹.

A microscopia eletrônica de transmissão (MET) é o método mais utilizado, e ainda um dos melhores métodos, para observar e detectar mitofagia²⁰. As características morfológicas da mitofagia são autofagossomos ou autolisossomos formados pela fusão de autofagossomos com lisossomos, que podem ser observados a partir de imagens de microscopia eletrônica²¹. A fraqueza da microscopia eletrônica (EM), no entanto, é a incapacidade de monitorar os processos dinâmicos da mitofagia, como a despolarização mitocondrial, a fissão mitocondrial e a fusão de autofagossomos e lisossomos, na célula viva²⁰. Assim, avaliar a mitofagia por meio de organelas vivas por imagem é um método alternativo atraente para a pesquisa mitocondrial. A técnica de imagem de células vivas descrita aqui usa dois corantes fluorescentes para manchar mitocôndrias e lisossomos. Quando a mitofagia ocorre, as mitocôndrias danificadas ou supérfluas engolidas por autofagossomos são coradas de verde pelo corante mitocondrial, enquanto o corante vermelho mancha os lisossomos. A fusão desses autofagossomos e lisossomos, denominados autolisossomos, faz com que a fluorescência verde e vermelha se sobreponha e se manifeste como pontos amarelos, indicando a ocorrência de mitofagia²². O corante de mitocôndrias per-celular (MitoTracker Green) contém uma porção clorometil levemente reativa ao tiol para rotular as mitocôndrias²³. Para rotular as mitocôndrias, as células são simplesmente incubadas com o corante, que se difunde passivamente através da membrana plasmática e se acumula nas mitocôndrias ativas. Este corante mitocondrial pode facilmente manchar células vivas, e é menos eficaz na coloração de células fixas de aldeído ou mortas. O corante lisossomo (LysoTracker Red) é uma sonda acidotrópica fluorescente usada para marcar e rastrear organelas ácidas em células vivas. Este corante exibe uma alta seletividade para organelas ácidas e pode efetivamente rotular células vivas em concentrações nanomolares²⁴.

Os procedimentos para o uso desses corantes fluorescentes em células vivas, incluindo o carregamento dos corantes e a visualização de mitocôndrias e lisossomos, são apresentados aqui. Este método pode ajudar os pesquisadores a observar a mitofagia usando microscopia fluorescente de células vivas. Também pode ser usado para quantificar mitocôndrias e lisossomos e avaliar a morfologia mitocondrial.

Protocolo

1. Cultura celular e passaging

NOTA: O protocolo é descrito usando fibroblastos embrionários de camundongos (MEFs) rotineiramente cultivados como exemplo.

1. Cultura de células MEF em placas de cultura celular de 10 cm com 10 mL de Meio Águia Modificada (DMEM) da Dulbecco. Incubar a 37 °C e 5% de CO₂ e monitorizar as células ao microscópio a uma ampliação de 100x.
2. Realizar a passagem celular de rotina.
   1. Quando as células atingirem 80%-90% de confluência (a cada 3 dias), lave as células com 2 mL de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS). Em seguida, adicione 2 mL de tripsina-EDTA a 0,05% por 1 min para dissociar as células, seguido por 2 mL de DMEM para interromper a ação da tripsina-EDTA. Centrifugar a suspensão celular a 100 x g durante 3 min e ressuspender o pellet celular em 1 ml de DMEM.
   2. Conte as células usando um contador de células automatizado e lâminas de câmara de contagem de células (consulte Tabela de Materiais) e, em seguida, inocular 1,5 x 10⁶ células em uma nova placa de cultura celular de 10 cm contendo 10 mL de DMEM.
3. Para o ensaio de mitofagia, preparar uma suspensão celular como na etapa 1.2.1. Diluir a suspensão celular para 1 x 10⁵ células/ml em DMEM fresco.
4. Adicionar 2 ml da suspensão celular diluída a uma placa confocal de 20 mm (ver Tabela de Materiais) e agitar a placa de cultura numa "cruz". Incubar a placa de cultura celular em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO₂ por 24 h.

2. Coloração mitocondrial

1. Remover as alíquotas da solução-mãe do corante mitocondrial verde-fluorescente e do corante lisossoma vermelho-fluorescente (ver Tabela de Materiais) do congelador -20 °C.
2. Preparar soluções de trabalho dos corantes diluindo as soluções-mãe 1:1.000 em DMEM e misturar bem. Por exemplo, adicione 2 μL cada de corante mitocondrial de 1 mM e corante lisossomo a 2 mL de DMEM para obter uma concentração de trabalho de 1 μM para ambos os corantes.
3. Retirar o meio da placa de cultura confocal (passo 1.4). Adicionar 1 ml da solução corante (preparada no passo 2.2) para cobrir as células. Colocar a placa de cultura celular numa incubadora a 37 °C, 5% de CO₂ durante 20-30 min.

3. Imagem confocal

1. Preparar 1 L de tampão Krebs-Henseleit (KH) (138,2 mM NaCl, 3,7 mM KCl, 0,25 mM CaCl 2, 1,2 mM KH 2 PO 4, 1,2 mM MgSO4,7H₂ O, 15 mM de glicose e 21,85 mM HEPES; pH final 7,4) e armazenar a₄ °C (por até 1 mês).
2. No dia da imagiologia confocal, retire o tampão KH do frigorífico com antecedência e pré-aqueça-o à temperatura ambiente (20 a 25 °C).
3. Defina os parâmetros do software de imagem de microscopia confocal (ver Tabela de Materiais): Para imagens de excitação dupla, use excitação sequencial a 488 nm e 543 nm e colete a emissão a 505-545 nm e >560 nm, respectivamente.
   Observação : defina as configurações de imagem da seguinte maneira. Modo de digitalização: quadro; Velocidade: 9; Média: número, 1; Ganho: 450 a 600; Pinhole: 30 a 200; laser: <10%. É melhor iniciar o software de imagem primeiro e, em seguida, ligar completamente o laser de 488 nm. O laser de 543 nm precisa ser ligado e estabilizado por 3-5 min antes do uso (Figura 1A).
4. Retirar o meio de cultura que contém o corante da incubadora (passo 2.3) e adicionar 1 ml de tampão KH ao prato.
5. Para induzir a mitofagia, trate as células com carbonilcianeto-4-(trifluorometoxi) fenilhidrazona (FCCP) a 1 μM (concentração final) em tampão KH por 10 min à temperatura ambiente, e proceda imediatamente à imagem das células usando o microscópio confocal.
6. Aplique uma quantidade apropriada de óleo na parte superior da lente de óleo 63x (consulte Tabela de materiais). Coloque a amostra de célula no estágio de amostra do microscópio confocal e mova-a diretamente acima da lente objetiva.
7. Use o software de imagem para encontrar a amostra clicando na guia Localizar no canto superior esquerdo da interface do software (Figura 1B). Selecione um conjunto de filtros verde para o experimento.
8. Use o botão de ajuste grosso para focar rapidamente, movendo a lente objetiva para cima e para baixo. Depois que a amostra de célula estiver claramente visível através da ocular, procure e concentre a área de células individuais e mova-a para o centro do campo de visão.
9. Clique na guia Aquisição no canto superior esquerdo da interface do software para adquirir imagens. Selecione apenas o canal de 488 nm e a resolução de quadros 1024 x 1024 para visualização.
10. Clique na guia Live no canto superior esquerdo para iniciar uma verificação ao vivo. Ajuste o campo de visão para o mais nítido e ajuste a potência do laser movendo o controle deslizante para a esquerda ou para a direita (Figura 1A). Mantenha a configuração de ganho abaixo de 600 para evitar a superexposição.
11. Ajuste o valor do orifício para 156, o valor de ganho para 545 e o valor de deslocamento digital para 0.
12. Selecione o melhor campo de visão, verifique os dois canais (488 nm e 543 nm) e escolha a resolução do quadro 1024 x 1024. Clique em Ajustar para adquirir imagens 2D. Salve as imagens adquiridas.
    NOTA: O corante verde das mitocôndrias tem um pico de excitação a 490 nm e um pico de emissão a 516 nm; ele pode ser excitado usando um laser de 488 nm. O corante lisossomo vermelho tem um pico de excitação a 576 nm e um pico de emissão a 590 nm; ele pode ser excitado usando um laser de 543 nm.

4. Análise de imagem

1. Abra a imagem salva com o ImageJ e importe a imagem mesclada para ela.
2. Conte manualmente o número de pontos amarelos em cada célula, que indicam que o lisossomo está engolindo mitocôndrias.

Resultados

MitoTracker Green é uma mancha mitocondrial verde-fluorescente que é capaz de localizar com precisão as mitocôndrias. O corante pode facilmente corar células vivas e é menos eficaz na coloração de células fixas ou mortas com aldeído (Figura 2). O corante lisossomo vermelho-fluorescente LysoTracker Red é capaz de marcar e rastrear organelas lisossômicas ácidas e só pode manchar células vivas (Figura 2). A imagem em microscópio confocal permite a v...

Discussão

O protocolo aqui descrito fornece um método para avaliar e monitorar o processo dinâmico de mitofagia em células vivas, envolvendo autofagossomos, lisossomos e fissão mitocondrial, através da co-coloração com mitocôndrias e corantes lisossômicos permeant por células. O método também pode ser usado para identificar mitocôndrias e avaliar a morfologia mitocondrial. Ambos os corantes utilizados neste estudo devem ser protegidos da luz, múltiplos ciclos de congelamento-descongelamento devem ser evitados e os co...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automated cell counter	Countstar	IC1000
Cell counting chamber slides	Countstar	12-0005-50
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)	Corning	10-013-CV
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Corning	21-031-CVC
Glass bottom cell culture dish (confocal dish)	NEST	801002
Image J (Rasband, NIH)	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Krebs–Henseleit(KHB) buffer			Self-prepared
LysoTracker Red	Invitrogen	1818430	100 µmol/L, red-fluorescent lysosome dye
MitoTracker Green	Invitrogen	1842298	200 µmol/L stock, green-fluorescent mitochondria dye
Mouse Embryonic Fibroblasts			Self-prepared
Objective (63x oil lens)	ZEISS	ZEISS LSM 880
Trypsin-EDTA 0.25%	Gibico	Cat# 25200056
ZEISS LSM 880 Confocal Laser Scanning Microscope	ZEISS	ZEISS LSM 880
ZEN Microscopy Software 2.1 (confocal microscope imaging software)	ZEISS	ZEN 2.1