JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Митофагия является основным механизмом контроля качества митохондрий. Однако оценке митофагии in vivo препятствует отсутствие надежных количественных анализов. Здесь представлен протокол наблюдения митофагии в живых клетках с использованием клеточного проникающего зелено-флуоресцентного красителя митохондрий и красителя красных флуоресцентных лизосом.

Аннотация

Митохондрии, будучи электростанциями клетки, играют важную роль в биоэнергетике, генерации свободных радикалов, гомеостазе кальция и апоптозе. Митофагия является основным механизмом контроля качества митохондрий и обычно изучается с использованием микроскопических наблюдений, однако анализы митофагии in vivo трудно выполнить. Оценка митофагии путем визуализации живых органелл является альтернативным и необходимым методом митохондриальных исследований. Этот протокол описывает процедуры использования клеточного проникающего зелено-флуоресцентного красителя митохондрий MitoTracker Green и красного флуоресцентного лизосомного красителя LysoTracker Red в живых клетках, включая загрузку красителей, визуализацию митохондрий и лизосом, а также ожидаемые результаты. Также приведены подробные шаги по оценке митофагии в живых клетках, а также технические примечания о настройках программного обеспечения микроскопа. Этот метод может помочь исследователям наблюдать митофагию с помощью флуоресцентной микроскопии живых клеток. Кроме того, он может быть использован для количественной оценки митохондрий и лизосом и оценки морфологии митохондрий.

Введение

Митохондрии являются электростанциями почти всех эукариотических клеток 1,2. В дополнение к производству АТФ путем окислительного фосфорилирования, митохондрии играют жизненно важную роль в других процессах, таких как биоэнергетика, гомеостаз кальция, генерация свободных радикалов, апоптоз и клеточный гомеостаз 3,4,5. Поскольку митохондрии генерируют активные формы кислорода (АФК) из нескольких комплексов в цепи переноса электронов, они постоянно стимулируются потенциальным окислительным стрессом, который в конечном итоге может привести к структурным повреждениям и дисфункции, когда система антиоксидантной защиты разрушается 6,7. Было обнаружено, что митохондриальная дисфункция способствует развитию многих заболеваний, включая метаболические нарушения, нейродегенерацию и сердечно-сосудистые заболевания8. Поэтому крайне важно поддерживать здоровые митохондриальные популяции и их правильную функцию. Митохондрии являются высокопластичными и динамичными органеллами; их морфология и функция контролируются механизмами контроля качества митохондрий, включая посттрансляционные модификации (ПТМ) митохондриальных белков, митохондриальный биогенез, слияние, деление и митофагию 9,10. Митохондриальное деление, опосредованное связанным с динамином белком 1 (DRP1), ГТФазой надсемейства динаминов белков, приводит к малым и круглым митохондриям и изолирует дисфункциональные митохондрии, которые могут быть очищены и деградированы митофагией11,12.

Митофагия — это клеточный процесс, который избирательно разрушает митохондрии путем аутофагии, обычно происходящей в поврежденных митохондриях после травмы, старения или стресса. Впоследствии эти митохондрии доставляются в лизосомы для деградации10. Таким образом, митофагия является катаболическим процессом, который помогает поддерживать количество и качество митохондрий в здоровом состоянии в широком диапазоне типов клеток. Он играет решающую роль в восстановлении клеточного гомеостаза в нормальных физиологических и стрессовых условиях13,14. Клетки характеризуются сложным механизмом митофагии, который индуцируется различными сигналами клеточного стресса и изменений в развитии. Регуляторные пути митофагии классифицируются как убиквитин-зависимые илирецептор-зависимые 15,16; убиквитин-зависимая аутофагия опосредована киназой PINK1 и рекрутированием убиквитин-лигазы Parkin E3 в митохондрии17,18, в то время как рецептор-зависимая аутофагия включает связывание рецепторов аутофагии с микротрубочкой-ассоциированной белковой легкой цепью LC3, которая опосредует митофагию в ответ на повреждение митохондрий19.

Просвечивающая электронная микроскопия (ТЭМ) является наиболее часто используемым методом и до сих пор одним из лучших методов для наблюдения и обнаружения митофагии20. Морфологическими особенностями митофагии являются аутофагосомы или аутолизосомы, образованные слиянием аутофагосом с лизосомами, что можно наблюдать по изображениям электронной микроскопии21. Слабость электронной микроскопии (ЭМ), однако, заключается в неспособности контролировать динамические процессы митофагии, такие как деполяризация митохондрий, деление митохондрий и слияние аутофагосом и лизосом, в живой клетке20. Таким образом, оценка митофагии с помощью визуализации живых органелл является привлекательным альтернативным методом митохондриальных исследований. Метод визуализации живых клеток, описанный здесь, использует два флуоресцентных красителя для окрашивания митохондрий и лизосом. Когда происходит митофагия, поврежденные или лишние митохондрии, поглощенные аутофагосомами, окрашиваются в зеленый цвет митохондриальным красителем, в то время как красный краситель окрашивает лизосомы. Слияние этих аутофагосом и лизосом, называемых аутолизосомами, приводит к тому, что зеленая и красная флуоресценция перекрываются и проявляются в виде желтых точек, что указывает на возникновение митофагии22. Клеточно-проницаемый краситель митохондрий (MitoTracker Green) содержит умеренно тиол-реактивный хлорметиловый фрагмент для маркировки митохондрий23. Чтобы метить митохондрии, клетки просто инкубируются с красителем, который пассивно диффундирует через плазматическую мембрану и накапливается в активных митохондриях. Этот краситель митохондрий может легко окрашивать живые клетки и менее эффективен при окрашивании альдегидно-фиксированных или мертвых клеток. Лизосомный краситель (LysoTracker Red) представляет собой флуоресцентный ацидотропный зонд, используемый для маркировки и отслеживания кислых органелл в живых клетках. Этот краситель проявляет высокую селективность для кислых органелл и может эффективно маркировать живые клетки при наномолярных концентрациях24.

Здесь представлены процедуры использования этих флуоресцентных красителей в живых клетках, включая загрузку красителей и визуализацию митохондрий и лизосом. Этот метод может помочь исследователям наблюдать митофагию с помощью флуоресцентной микроскопии живых клеток. Он также может быть использован для количественной оценки митохондрий и лизосом и оценки морфологии митохондрий.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Клеточная культура и пассаж

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол описан с использованием обычно культивируемых мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) в качестве примера.

  1. Культивируйте клетки MEF в чашках для культивирования клеток 10 см с 10 мл модифицированной орлиной среды Dulbecco (DMEM). Инкубируйте при 37 °C и 5% CO2 и контролируйте клетки под микроскопом при 100-кратном увеличении.
  2. Выполняйте рутинную передачу ячеек.
    1. Когда клетки достигнут 80%-90% конфлюзии (каждые 3 дня), промывайте клетки 2 мл фосфатного буферного физиологического раствора Dulbecco (DPBS). Затем добавляют 2 мл 0,05% трипсина-ЭДТА в течение 1 мин для диссоциации клеток, а затем 2 мл ДМЭМ, чтобы остановить действие трипсина-ЭДТА. Центрифугируют клеточную суспензию при 100 х г в течение 3 мин и повторно суспендируют ячейку гранулы в 1 мл ДМЭМ.
    2. Подсчитайте ячейки с помощью автоматизированного счетчика клеток и слайдов камеры подсчета клеток (см. Таблицу материалов), а затем привите 1,5 х 106 клеток в новую чашку для клеточной культуры размером 10 см, содержащую 10 мл DMEM.
  3. Для анализа митофагии подготовьте клеточную суспензию, как показано на этапе 1.2.1. Разбавить клеточную суспензию до 1 х 105 клеток/мл в свежем ДМЭМ.
  4. Добавьте 2 мл разбавленной клеточной суспензии в 20-миллиметровую конфокальную посуду (см. Таблицу материалов) и встряхните чашку для культивирования в «крестике». Инкубируют чашку для культивирования клеток в инкубаторе 37 °C, 5% CO2 в течение 24 ч.

2. Окрашивание митохондрий

  1. Удалите из морозильной камеры раствора аликвоты зеленого флуоресцентного митохондриального красителя и красителя красных флуоресцентных лизосом (см. Таблицу материалов).
  2. Готовят рабочие растворы красителей, разбавляя исходные растворы 1:1000 в ДМЭМ и хорошо перемешивают. Например, добавьте 2 мкл каждого из 1 мМ митохондриального красителя и лизосомного красителя к 2 мл DMEM, чтобы получить рабочую концентрацию 1 мкМ для обоих красителей.
  3. Извлеките среду из чашки конфокальной культуры (шаг 1.4). Добавляют 1 мл окрашивающего раствора (приготовленного на стадии 2.2) для покрытия клеток. Поместите чашку для культивирования клеток в инкубатор при 37 °C, 5% CO2 в течение 20-30 мин.

3. Конфокальная визуализация

  1. Готовят 1 л буфера Кребса-Хенселеита (KH) (138,2 мМ NaCl, 3,7 мМ KCl, 0,25 мМ CaCl2, 1,2 мМ KH2PO4, 1,2 мМ MgSO 4,7H2O, 15 мМ глюкозы и 21,85 мМ HEPES; конечный рН 7,4) и хранить при 4 °C (до 1 месяца).
  2. В день конфокальной визуализации заранее извлеките буфер KH из холодильника и предварительно разогрейте его до комнатной температуры (от 20 до 25 °C).
  3. Установите параметры программного обеспечения для визуализации конфокальной микроскопии (см. Таблицу материалов): Для изображений двойного возбуждения используйте последовательное возбуждение при 488 нм и 543 нм и собирайте излучение при 505-545 нм и >560 нм соответственно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Установите параметры образа следующим образом. Режим сканирования: кадр; Скорость: 9; Среднее: количество, 1; Коэффициент усиления: от 450 до 600; Пинхол: от 30 до 200; лазер: <10%. Лучше всего сначала запустить программное обеспечение для обработки изображений, а затем полностью включить лазер 488 нм. Лазер 543 нм необходимо включить и стабилизировать в течение 3-5 мин перед использованием (рисунок 1А).
  4. Извлеките питательную среду, содержащую краситель, из инкубатора (этап 2.3) и добавьте в чашку 1 мл буфера KH.
  5. Чтобы индуцировать митофагию, обрабатывают клетки карбонильным цианидом-4-(трифторметокси)фенилгидразоном (FCCP) при 1 мкМ (конечной концентрации) в буфере KH в течение 10 мин при комнатной температуре и немедленно приступают к изображению клеток с помощью конфокального микроскопа.
  6. Нанесите соответствующее количество масла на верхнюю часть 63-кратной масляной линзы (см. Таблицу материалов). Поместите образец клетки на стадию образца конфокального микроскопа и переместите его непосредственно над объективом.
  7. Используйте программное обеспечение для создания образов, чтобы найти образец, щелкнув вкладку Locate в левом верхнем углу интерфейса программного обеспечения (рисунок 1B). Выберите зеленый фильтр для эксперимента.
  8. Используйте грубую ручку регулировки для быстрой фокусировки, перемещая объектив вверх и вниз. После того, как образец ячейки будет хорошо виден через окуляр, выполните поиск и сфокусируйте область отдельных ячеек и переместите ее в центр поля зрения.
  9. Нажмите на вкладку «Приобретение » в левом верхнем углу интерфейса программного обеспечения, чтобы получить изображения. Для предварительного просмотра выберите только канал 488 нм и разрешение кадра 1024 x 1024.
  10. Нажмите на вкладку Live в левом верхнем углу, чтобы начать сканирование в реальном времени. Отрегулируйте поле зрения до максимально резкого и отрегулируйте мощность лазера, переместив ползунок влево или вправо (рисунок 1A). Держите коэффициент усиления ниже 600, чтобы избежать передержки.
  11. Отрегулируйте значение точечного отверстия на 156, значение усиления на 545 и значение цифрового смещения на 0.
  12. Выберите лучшее поле зрения, проверьте два канала (488 нм и 543 нм) и выберите разрешение кадра 1024 x 1024. Нажмите кнопку Привязать , чтобы получить 2D-изображения. Сохраните полученные изображения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Зеленый краситель митохондрий имеет пик возбуждения при 490 нм и пик излучения при 516 нм; его можно возбуждать с помощью лазера 488 нм. Красный краситель лизосом имеет пик возбуждения при 576 нм и пик излучения при 590 нм; его можно возбуждать с помощью лазера 543 нм.

4. Анализ изображений

  1. Откройте сохраненное изображение с помощью ImageJ и импортируйте в него объединенное изображение.
  2. Вручную подсчитайте количество желтых точек в каждой клетке, которые указывают на то, что лизосома поглощает митохондрии.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

MitoTracker Green представляет собой зелено-флуоресцентное митохондриальное пятно, которое способно точно локализоваться в митохондриях. Краситель может легко окрашивать живые клетки и менее эффективен при окрашивании альдегидно-фиксированных или мертвых клеток (рисунок 2). ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Протокол, описанный здесь, предоставляет метод оценки и мониторинга динамического процесса митофагии в живых клетках, включая аутофагосомы, лизосомы и деление митохондрий, путем совместного окрашивания с клеточными проницаемыми митохондриями и лизосомными красителями. Метод также м...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Благодарности

Эта работа была частично профинансирована Национальной ключевой программой исследований и разработок Китая (2017YFA0105601, 2018YFA0107102), Национальным фондом естественных наук Китая (81970333,31901044, и Программой для профессора специального назначения в Шанхайских высших учебных заведениях (GZ2020008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Automated cell counterCountstarIC1000
Cell counting chamber slidesCountstar12-0005-50
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)Corning10-013-CV
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)Corning21-031-CVC
Glass bottom cell culture dish (confocal dish)NEST801002
Image J (Rasband, NIH)NIHhttps://imagej.nih.gov/ij/download.html
Krebs–Henseleit(KHB) bufferSelf-prepared
LysoTracker RedInvitrogen1818430100 µmol/L, red-fluorescent lysosome dye
MitoTracker GreenInvitrogen1842298200 µmol/L stock, green-fluorescent mitochondria dye
Mouse Embryonic FibroblastsSelf-prepared
Objective (63x oil lens)ZEISSZEISS LSM 880
Trypsin-EDTA 0.25%GibicoCat# 25200056
ZEISS LSM 880 Confocal Laser Scanning MicroscopeZEISSZEISS LSM 880
ZEN Microscopy Software 2.1 (confocal microscope imaging software)ZEISSZEN 2.1

Ссылки

  1. Tao, M., et al. Animal mitochondria: evolution, function, and disease. Current Molecular Medicine. 14 (1), 115-124 (2014).
  2. Henze, K., Martin, W. Evolutionary biology: essence of mitochondria. Nature. 426 (6963), 127-128 (2003).
  3. Kiriyama, Y., Nochi, H. Intra- and intercellular quality control mechanisms of mitochondria. Cells. 7 (1), (2017).
  4. Rossmann, M. P., Dubois, S. M., Agarwal, S., Zon, L. I. Mitochondrial function in development and disease. Disease Models & Mechanisms. 14 (6), 048912(2021).
  5. Suliman, H. B., Piantadosi, C. A. Mitochondrial quality control as a therapeutic target. Pharmacological Reviews. 68 (1), 20-48 (2016).
  6. Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 16804-16809 (2017).
  7. Zhao, R. Z., Jiang, S., Zhang, L., Yu, Z. B. Mitochondrial electron transport chain, ROS generation and uncoupling (Review). International Journal of Molecular Medicine. 44 (1), 3-15 (2019).
  8. Murphy, M. P., Hartley, R. C. Mitochondria as a therapeutic target for common pathologies. Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (12), 865-886 (2018).
  9. Fan, H., et al. Mitochondrial quality control in cardiomyocytes: a critical role in the progression of cardiovascular diseases. Frontiers in Physiology. 11, 252(2020).
  10. Ma, K., et al. Mitophagy, mitochondrial homeostasis, and cell fate. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 467(2020).
  11. Kraus, F., Roy, K., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. Function and regulation of the divisome for mitochondrial fission. Nature. 590 (7844), 57-66 (2021).
  12. Ren, L., et al. Mitochondrial dynamics: fission and fusion in fate determination of mesenchymal stem cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 580070(2020).
  13. Onishi, M., Yamano, K., Sato, M., Matsuda, N., Okamoto, K. Molecular mechanisms and physiological functions of mitophagy. The EMBO Journal. 40 (3), 104705(2021).
  14. Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Mechanisms of mitophagy in cellular homeostasis, physiology and pathology. Nature Cell Biology. 20 (9), 1013-1022 (2018).
  15. Khaminets, A., Behl, C., Dikic, I. Ubiquitin-dependent and independent signals in selective autophagy. Trends in Cell Biology. 26 (1), 6-16 (2016).
  16. Fritsch, L. E., Moore, M. E., Sarraf, S. A., Pickrell, A. M. Ubiquitin and receptor-dependent mitophagy pathways and their implication in neurodegeneration. Journal of Molecular Biology. 432 (8), 2510-2524 (2020).
  17. Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).
  18. Lazarou, M., Jin, S. M., Kane, L. A., Youle, R. J. Role of PINK1 binding to the TOM complex and alternate intracellular membranes in recruitment and activation of the E3 ligase Parkin. Developmental Cell. 22 (2), 320-333 (2012).
  19. Chen, M., et al. Mitophagy receptor FUNDC1 regulates mitochondrial dynamics and mitophagy. Autophagy. 12 (4), 689-702 (2016).
  20. Ding, W. X., Yin, X. M. Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis. Biological Chemistry. 393 (7), 547-564 (2012).
  21. Parzych, K. R., Klionsky, D. J. An overview of autophagy: morphology, mechanism, and regulation. Antioxidants and Redox Signaling. 20 (3), 460-473 (2014).
  22. Hasegawa, J., et al. Autophagosome-lysosome fusion in neurons requires INPP5E, a protein associated with Joubert syndrome. The EMBO Journal. 35 (17), 1853-1867 (2016).
  23. Presley, A. D., Fuller, K. M., Arriaga, E. A. MitoTracker Green labeling of mitochondrial proteins and their subsequent analysis by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. Journal of Chromatography B. Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 793 (1), 141-150 (2003).
  24. Chazotte, B. Labeling lysosomes in live cells with LysoTracker. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571(2011).
  25. Pickles, S., Vigie, P., Youle, R. J. Mitophagy and quality control mechanisms in mitochondrial maintenance. Current Biology. 28 (4), 170-185 (2018).
  26. Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 31-42 (2013).
  27. Berezhnov, A. V., et al. Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy. Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).
  28. Takemori, H., et al. Visualization of mitophagy using LysoKK, a 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole-(arylpropyl)benzylamine derivative. Mitochondrion. 62, 176-180 (2022).
  29. Maeda, M., et al. The new live imagers MitoMM1/2 for mitochondrial visualization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 562, 50-54 (2021).
  30. Feng, X. R., Yin, W., Wang, J. L., Feng, L., Kang, Y. J. Mitophagy promotes the stemness of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Experimental Biology and Medicine. 246 (1), 97-105 (2021).
  31. Chu, C. T., et al. Cardiolipin externalization to the outer mitochondrial membrane acts as an elimination signal for mitophagy in neuronal cells. Nature Cell Biology. 15 (10), 1197-1205 (2013).
  32. Sentelle, R. D., et al. Ceramide targets autophagosomes to mitochondria and induces lethal mitophagy. Nature Chemical Biology. 8 (10), 831-838 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

189

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены