Visualisation de la mitophagie avec des colorants fluorescents pour les mitochondries et le lysosome

Résumé

La mitophagie est le principal mécanisme du contrôle de la qualité mitochondriale. Cependant, l’évaluation de la mitophagie in vivo est entravée par le manque de tests quantitatifs fiables. Un protocole d’observation de la mitophagie dans les cellules vivantes est présenté ici à l’aide d’un colorant mitochondrial vert-fluorescent perméable de cellules et d’un colorant lysosome fluorescent rouge.

Résumé

Les mitochondries, étant les centrales électriques de la cellule, jouent un rôle important dans la bioénergétique, la génération de radicaux libres, l’homéostasie du calcium et l’apoptose. La mitophagie est le principal mécanisme de contrôle de la qualité mitochondriale et est généralement étudiée à l’aide d’observations microscopiques, mais les tests de mitophagie in vivo sont difficiles à réaliser. L’évaluation de la mitophagie par imagerie d’organites vivants est une méthode alternative et nécessaire pour la recherche mitochondriale. Ce protocole décrit les procédures d’utilisation du colorant mitochondrial vert-fluorescent MitoTracker Green et du colorant lysosome rouge-fluorescent LysoTracker Red dans les cellules vivantes, y compris le chargement des colorants, la visualisation des mitochondries et du lysosome, et les résultats attendus. Des étapes détaillées pour l’évaluation de la mitophagie dans les cellules vivantes, ainsi que des notes techniques sur les paramètres du logiciel de microscope, sont également fournies. Cette méthode peut aider les chercheurs à observer la mitophagie à l’aide de la microscopie fluorescente à cellules vivantes. En outre, il peut être utilisé pour quantifier les mitochondries et les lysosomes et évaluer la morphologie mitochondriale.

Introduction

Les mitochondries sont les centrales électriques de presque toutes les cellules eucaryotes ^1,2. En plus de la production d’ATP par phosphorylation oxydative, les mitochondries jouent un rôle essentiel dans d’autres processus tels que la bioénergétique, l’homéostasie du calcium, la génération de radicaux libres, l’apoptose et l’homéostasie cellulaire ^3,4,5. Comme les mitochondries génèrent des espèces réactives de l’oxygène (ROS) à partir de multiples complexes dans la chaîne de transport d’électrons, elles sont constamment stimulées par un stress oxydatif potentiel, ce qui peut éventuellement entraîner des dommages structurels et un dysfonctionnement lorsque le système de défense antioxydant s’effondre ^6,7. Il a été constaté que le dysfonctionnement mitochondrial contribue à de nombreuses maladies, notamment les troubles métaboliques, la neurodégénérescence et les maladies cardiovasculaires⁸. Par conséquent, il est crucial de maintenir des populations mitochondriales saines et leur bon fonctionnement. Les mitochondries sont des organites hautement plastiques et dynamiques; Leur morphologie et leur fonction sont contrôlées par des mécanismes de contrôle de la qualité mitochondriale, y compris les modifications post-traductionnelles (PTM) des protéines mitochondriales, la biogenèse mitochondriale, la fusion, la fission et la mitophagie ^9,10. La fission mitochondriale médiée par la protéine 1 liée à la dynamine (DRP1), une GTPase de la superfamille des protéines dynamin, donne des mitochondries petites et rondes et isole les mitochondries dysfonctionnelles, qui peuvent être éliminées et dégradées par la mitophagie^11,12.

La mitophagie est un processus cellulaire qui dégrade sélectivement les mitochondries par autophagie, se produisant généralement dans les mitochondries endommagées à la suite d’une blessure, du vieillissement ou du stress. Par la suite, ces mitochondries sont livrées aux lysosomes pour dégradation¹⁰. Ainsi, la mitophagie est un processus catabolique qui aide à maintenir la quantité et la qualité des mitochondries dans un état sain dans un large éventail de types de cellules. Il joue un rôle crucial dans la restauration de l’homéostasie cellulaire dans des conditions physiologiques et de stress normales^13,14. Les cellules sont caractérisées par un mécanisme de mitophagie complexe, qui est induit par différents signaux de stress cellulaire et de changements développementaux. Les voies de régulation de la mitophagine sont classées comme dépendantes de l’ubiquitine ou des récepteurs^15,16; l’autophagie dépendante de l’ubiquitine est médiée par la kinase PINK1 et le recrutement de l’ubiquitine ligase Parkin E3 dans les mitochondries 17,18^, tandis que l’autophagie dépendante des récepteurs implique la liaison des récepteurs de l’autophagie à la chaîne légère de protéines associée aux microtubules LC3 qui intervient dans la mitophagie en réponse aux dommages mitochondriaux¹⁹.

La microscopie électronique à transmission (MET) est la méthode la plus couramment utilisée, et toujours l’une des meilleures, pour observer et détecter la mitophagie²⁰. Les caractéristiques morphologiques de la mitophagie sont les autophagosomes ou autolysosomes formés par la fusion des autophagosomes avec les lysosomes, ce qui peut être observé à partir d’images de microscopie électronique²¹. La faiblesse de la microscopie électronique (EM), cependant, est l’incapacité de surveiller les processus dynamiques de la mitophagie, tels que la dépolarisation mitochondriale, la fission mitochondriale et la fusion des autophagosomes et des lysosomes, dans la cellule vivante²⁰. Ainsi, l’évaluation de la mitophagie par imagerie des organites vivants est une méthode alternative intéressante pour la recherche mitochondriale. La technique d’imagerie de cellules vivantes décrite ici utilise deux colorants fluorescents pour colorer les mitochondries et les lysosomes. Lorsque la mitophagie se produit, les mitochondries endommagées ou superflues englouties par les autophagosomes sont colorées en vert par le colorant mitochondrial, tandis que le colorant rouge colore les lysosomes. La fusion de ces autophagosomes et lysosomes, appelés autolysosomes, provoque le chevauchement de la fluorescence verte et rouge et se manifeste par des points jaunes, indiquant ainsi l’apparition de la mitophagie²². Le colorant mitochondrial perméable aux cellules (MitoTracker Green) contient une fraction chlorométhyle légèrement réactive au thiol pour marquer les mitochondries²³. Pour marquer les mitochondries, les cellules sont simplement incubées avec le colorant, qui diffuse passivement à travers la membrane plasmique et s’accumule dans les mitochondries actives. Ce colorant mitochondrial peut facilement colorer les cellules vivantes et est moins efficace pour colorer les cellules aldéhydes ou mortes. Le colorant lysosome (LysoTracker Red) est une sonde acidotrope fluorescente utilisée pour marquer et suivre les organites acides dans les cellules vivantes. Ce colorant présente une sélectivité élevée pour les organites acides et peut marquer efficacement les cellules vivantes à des concentrations nanomolaires²⁴.

Les procédures d’utilisation de ces colorants fluorescents dans les cellules vivantes, y compris le chargement des colorants et la visualisation des mitochondries et des lysosomes, sont présentées ici. Cette méthode peut aider les chercheurs à observer la mitophagie à l’aide de la microscopie fluorescente à cellules vivantes. Il peut également être utilisé pour quantifier les mitochondries et les lysosomes, et évaluer la morphologie mitochondriale.

Protocole

1. Culture cellulaire et passage

REMARQUE: Le protocole est décrit en utilisant des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) en culture de routine comme exemple.

1. Culture de cellules MEF dans des boîtes de culture cellulaire de 10 cm avec 10 ml de milieu aigle modifié (DMEM) de Dulbecco. Incuber à 37 °C et 5% de CO₂ et surveiller les cellules au microscope à un grossissement de 100x.
2. Effectuer le passage de cellule de routine.
   1. Lorsque les cellules atteignent une confluence de 80 % à 90 % (tous les 3 jours), lavez les cellules avec 2 mL de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS). Ajouter ensuite 2 mL de trypsine-EDTA à 0,05% pendant 1 min pour dissocier les cellules, suivi de 2 mL de DMEM pour arrêter l’action de la trypsine-EDTA. Centrifuger la suspension cellulaire à 100 x g pendant 3 min et remettre en suspension la pastille de cellule dans 1 mL de DMEM.
   2. Compter les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé et de lames de chambre de comptage de cellules (voir le tableau des matériaux), puis inoculer 1,5 x 10⁶ cellules dans une nouvelle boîte de culture cellulaire de 10 cm contenant 10 ml de DMEM.
3. Pour le dosage de la mitophagie, préparer une suspension cellulaire comme à l’étape 1.2.1. Diluer la suspension cellulaire à 1 x 10⁵ cellules/mL dans du DMEM frais.
4. Ajouter 2 mL de la suspension cellulaire diluée à une capsule confocale de 20 mm (voir le tableau des matières) et agiter la capsule de culture en « croix ». Incuber la capsule de culture cellulaire dans un incubateur à 37 °C, 5% CO₂ pendant 24 h.

2. Coloration mitochondriale

1. Retirer les aliquotes de la solution mère du colorant mitochondrial fluorescent vert et du colorant lysosome fluorescent rouge (voir le tableau des matières) du congélateur à -20 °C.
2. Préparer les solutions de travail des colorants en diluant les solutions mères 1:1 000 dans du DMEM et bien mélanger. Par exemple, ajouter 2 μL chacun de colorant mitochondrial de 1 mM et de colorant lysosome à 2 mL de DMEM pour obtenir une concentration de travail de 1 μM pour les deux colorants.
3. Retirer le milieu de la capsule confocale de culture (étape 1.4). Ajouter 1 mL de la solution de coloration (préparée à l’étape 2.2) pour couvrir les cellules. Placer la capsule de culture cellulaire dans un incubateur à 37 °C, 5% de CO₂ pendant 20-30 min.

3. Imagerie confocale

1. Préparer 1 L de tampon Krebs-Henseleit (KH) (138,2 mM NaCl, 3,7 mM KCl, 0,25 mM CaCl2, 1,2 mM KH 2 PO 4,_1,2mM MgSO 4,7H2O, 15 mM de glucose et 21,85 mM HEPES; pHfinal_7,4) et conserver à₄ °C (jusqu’à 1 mois).
2. Le jour de l’imagerie confocale, retirez le tampon KH du réfrigérateur à l’avance et préchauffez-le à température ambiante (20 à 25 °C).
3. Réglez les paramètres du logiciel d’imagerie par microscopie confocale (voir le tableau des matériaux) : Pour les images à double excitation, utiliser l’excitation séquentielle à 488 nm et 543 nm, et recueillir l’émission à 505-545 nm et >560 nm, respectivement.
   Remarque : Définissez les paramètres de création d’image comme suit. Mode de numérisation: image; Vitesse: 9; Moyenne: nombre, 1; Gain : 450 à 600; Trou d’épingle : 30 à 200 ; Laser: <10%. Il est préférable de démarrer d’abord le logiciel d’imagerie, puis d’allumer complètement le laser 488 nm. Le laser 543 nm doit être allumé et stabilisé pendant 3 à 5 minutes avant d’être utilisé (Figure 1A).
4. Retirer le milieu de culture contenant le colorant de l’incubateur (étape 2.3) et ajouter 1 mL de tampon KH à la boîte.
5. Pour induire la mitophagie, traiter les cellules avec du cyanure de carbonyle-4-(trifluorométhoxy)phénylhydrazone (FCCP) à 1 μM (concentration finale) dans un tampon KH pendant 10 min à température ambiante, et procéder immédiatement à l’imagerie des cellules à l’aide du microscope confocal.
6. Appliquez une quantité appropriée d’huile sur le dessus de la lentille d’huile 63x (voir le tableau des matériaux). Placez l’échantillon de cellule sur l’étage d’échantillonnage du microscope confocal et déplacez-le directement au-dessus de la lentille de l’objectif.
7. Utilisez le logiciel de création d’images pour trouver l’échantillon en cliquant sur l’onglet Localiser dans le coin supérieur gauche de l’interface du logiciel (Figure 1B). Sélectionnez un jeu de filtres vert pour l’expérience.
8. Utilisez le bouton de réglage grossier pour effectuer rapidement la mise au point en déplaçant l’objectif de haut en bas. Une fois que l’échantillon de cellule est clairement visible à travers l’oculaire, recherchez et concentrez la zone des cellules individuelles et déplacez-la vers le centre du champ de vision.
9. Cliquez sur l’onglet Acquisition dans le coin supérieur gauche de l’interface du logiciel pour acquérir des images. Sélectionnez uniquement le canal 488 nm et la résolution d’image 1024 x 1024 pour l’aperçu.
10. Cliquez sur l’onglet En direct dans le coin supérieur gauche pour lancer une analyse en direct . Ajustez le champ de vision au maximum et réglez la puissance laser en déplaçant le curseur vers la gauche ou la droite (Figure 1A). Maintenez le réglage de gain en dessous de 600 pour éviter la surexposition.
11. Ajustez la valeur du sténopé à 156, la valeur du gain à 545 et la valeur du décalage numérique à 0.
12. Sélectionnez le meilleur champ de vision, vérifiez les deux canaux (488 nm et 543 nm) et choisissez la résolution d’image 1024 x 1024. Cliquez sur Accrochage pour acquérir des images 2D. Enregistrez les images acquises.
    NOTE: Le colorant mitochondrial vert a un pic d’excitation à 490 nm et un pic d’émission à 516 nm; Il peut être excité à l’aide d’un laser de 488 nm. Le colorant lysosome rouge a un pic d’excitation à 576 nm et un pic d’émission à 590 nm; Il peut être excité à l’aide d’un laser de 543 nm.

4. Analyse d’images

1. Ouvrez l’image enregistrée avec ImageJ et importez-y l’image fusionnée.
2. Comptez manuellement le nombre de points jaunes dans chaque cellule, ce qui indique que le lysosome engloutit les mitochondries.

Résultats

MitoTracker Green est une coloration mitochondriale verte-fluorescente capable de se localiser avec précision dans les mitochondries. Le colorant peut facilement colorer les cellules vivantes et est moins efficace pour colorer les cellules mortes ou fixées à l’aldéhyde (Figure 2). Le colorant lysosome fluorescent rouge LysoTracker Red est capable de marquer et de suivre les organites lysosomales acides et ne peut colorer que les cellules vivantes (Figure 2...

Discussion

Le protocole décrit ici fournit une méthode d’évaluation et de surveillance du processus dynamique de mitophagie dans les cellules vivantes, impliquant les autophagosomes, les lysosomes et la fission mitochondriale, par co-coloration avec des mitochondries perméables aux cellules et des colorants lysosomes. La méthode peut également être utilisée pour identifier les mitochondries et évaluer la morphologie mitochondriale. Les deux colorants utilisés dans cette étude doivent être protégés de la lumière, le...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automated cell counter	Countstar	IC1000
Cell counting chamber slides	Countstar	12-0005-50
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)	Corning	10-013-CV
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Corning	21-031-CVC
Glass bottom cell culture dish (confocal dish)	NEST	801002
Image J (Rasband, NIH)	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Krebs–Henseleit(KHB) buffer			Self-prepared
LysoTracker Red	Invitrogen	1818430	100 µmol/L, red-fluorescent lysosome dye
MitoTracker Green	Invitrogen	1842298	200 µmol/L stock, green-fluorescent mitochondria dye
Mouse Embryonic Fibroblasts			Self-prepared
Objective (63x oil lens)	ZEISS	ZEISS LSM 880
Trypsin-EDTA 0.25%	Gibico	Cat# 25200056
ZEISS LSM 880 Confocal Laser Scanning Microscope	ZEISS	ZEISS LSM 880
ZEN Microscopy Software 2.1 (confocal microscope imaging software)	ZEISS	ZEN 2.1