ミトコンドリアとリソソームの蛍光色素によるマイトファジーの可視化

要約

マイトファジーは、ミトコンドリアの品質管理の主要なメカニズムです。しかしながら、 in vivoでの マイトファジーの評価は、信頼できる定量アッセイの欠如によって妨げられている。ここでは、細胞透過性の緑色蛍光ミトコンドリア色素と赤色蛍光リソソーム色素を使用して、生細胞内のマイトファジーを観察するためのプロトコルを紹介します。

要約

細胞の原動力であるミトコンドリアは、生体エネルギー学、フリーラジカル生成、カルシウム恒常性、およびアポトーシスにおいて重要な役割を果たしています。マイトファジーはミトコンドリアの品質管理の主要なメカニズムであり、一般的に顕微鏡観察を使用して研究されていますが、 in vivo マイトファジーアッセイは実行が困難です。生きた細胞小器官をイメージングしてマイトファジーを評価することは、ミトコンドリア研究のための代替的かつ必要な方法です。このプロトコルでは、細胞透過性緑色蛍光ミトコンドリア色素MitoTracker Greenおよび赤色蛍光リソソーム色素LysoTracker Redを生細胞で使用するための手順を、色素の負荷、ミトコンドリアおよびリソソームの可視化、および期待される結果を含めて説明します。生細胞中のマイトファジーを評価するための詳細な手順、および顕微鏡ソフトウェアの設定に関するテクニカルノートも提供されています。この方法は、研究者が生細胞蛍光顕微鏡を使用してマイトファジーを観察するのに役立ちます。さらに、ミトコンドリアとリソソームの定量化やミトコンドリアの形態の評価にも使用できます。

概要

ミトコンドリアは、ほぼすべての真核細胞の原動力です^1,2。酸化的リン酸化によるATP産生に加えて、ミトコンドリアは、生体エネルギー、カルシウム恒常性、フリーラジカル生成、アポトーシス、細胞恒常性などの他のプロセスにおいて重要な役割を果たします^3,4,5。ミトコンドリアは電子伝達系内の複数の複合体から活性酸素種(ROS)を生成するため、潜在的な酸化ストレスによって絶えず刺激され、抗酸化防御システムが崩壊すると、最終的には構造的損傷や機能不全につながる可能性があります^6,7。ミトコンドリア機能障害は、代謝障害、神経変性、心血管疾患など、多くの疾患に寄与することがわかっています⁸。したがって、健康なミトコンドリア集団とその適切な機能を維持することが重要です。ミトコンドリアは非常に可塑的で動的な細胞小器官です。それらの形態と機能は、ミトコンドリアタンパク質の翻訳後修飾(PTM)、ミトコンドリア生合成、融合、分裂、およびマイトファジーを含むミトコンドリア品質管理メカニズムによっ....

プロトコル

1. 細胞培養と継代

注:プロトコルは、例としてルーチン培養マウス胚性線維芽細胞(MEF)を使用して説明されています。

1. 10 mLのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を含む10 cm細胞培養皿でMEF細胞を培養します。37°Cおよび5%_CO2 でインキュベートし、顕微鏡下で細胞を100倍の倍率でモニターします。
2. 定期的な細胞継代を実行します。
   1. 細胞が80%〜90%のコンフルエントに達したら(3日ごと)、2 mLのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で細胞を洗浄します。次に、2 mLの0.05%トリプシン-EDTAを1分間添加して細胞を解離し、続いて2 mLのDMEMを加えてトリプシン-EDTAの作用を停止します。細胞懸濁液を100 x g で3分間遠心分離し、細胞ペレットを1 mLのDMEMに再懸濁します。
   2. 自動セルカウンターとセルカウントチャンバースライド( 材料表を参照)を使用して細胞をカウントし、10 mLのDMEMを含む新しい10 cm細胞培養皿に1.5 x 10⁶ 細胞を接種します。
3. マイトファジーアッセイでは、ステップ1.2.1のように細胞懸濁液を調製します。細胞懸濁液を新鮮なDMEMで1 x 10^....

結果

MitoTracker Greenは、ミトコンドリアに正確に局在することができる緑色蛍光ミトコンドリア染色剤です。この色素は生細胞を簡単に染色できますが、アルデヒド固定細胞や死細胞の染色にはあまり効果がありません(図2)。赤色蛍光リソソーム色素LysoTracker Redは、酸性リソソーム細胞小器官の標識と追跡が可能で、生細胞のみを染色することができます(図2

ディスカッション

ここで説明するプロトコルは、オートファゴソーム、リソソーム、およびミトコンドリア分裂を含む生細胞におけるマイトファジーの動的プロセスを、細胞透過性ミトコンドリアおよびリソソーム色素との共染色を通じて評価およびモニタリングする方法を提供します。この方法は、ミトコンドリアを同定し、ミトコンドリアの形態を評価するためにも使用できます。この研究で使用される?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automated cell counter	Countstar	IC1000
Cell counting chamber slides	Countstar	12-0005-50
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)	Corning	10-013-CV
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Corning	21-031-CVC
Glass bottom cell culture dish (confocal dish)	NEST	801002
Image J (Rasband, NIH)	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Krebs–Henseleit(KHB) buffer			Self-prepared
LysoTracker Red	Invitrogen	1818430	100 µmol/L, red-fluorescent lysosome dye
MitoTracker Green	Invitrogen	1842298	200 µmol/L stock, green-fluorescent mitochondria dye
Mouse Embryonic Fibroblasts			Self-prepared
Objective (63x oil lens)	ZEISS	ZEISS LSM 880
Trypsin-EDTA 0.25%	Gibico	Cat# 25200056
ZEISS LSM 880 Confocal Laser Scanning Microscope	ZEISS	ZEISS LSM 880
ZEN Microscopy Software 2.1 (confocal microscope imaging software)	ZEISS	ZEN 2.1