Co-fermentación de Marsdenia tenacissima con Ganoderma lucidum y efecto anti-cáncer de pulmón de los productos de fermentación

Resumen

Aquí, describimos un protocolo para establecer un sistema de co-fermentación sistemático y completo para producir productos de biotransformación ricos en saponinas picantes mediante el uso de Marsdenia tenacissima (Roxb.) Wight et Arn. (MT) como medio de fermentación para Ganoderma lucidum. Esto servirá como referencia metodológica para el desarrollo de otras drogas étnicas.

Resumen

Marsdenia tenacissima (Roxb.) Wight et Arn. (MT), como medicina herbal tradicional china y Dai, tiene propiedades antiinflamatorias, antibacterianas y antitumorales. Sin embargo, la mayoría de sus principales principios activos son agliconas, como la tenacigenina A y la tenacigenina B. Dado que la biodisponibilidad de la MT es baja y sus componentes activos medicinales son difíciles de sintetizar, se estudia principalmente mediante biotransformación. Este estudio tiene como objetivo producir productos de biotransformación ricos en saponinas picantes mediante el uso de MT como medio de fermentación para Ganoderma lucidum (G. lucidum).

A través de la selección preliminar de tres hongos medicinales, se encontró que G. lucidum y Ophiocordyceps sinensis (O. sinensis) generalmente pueden crecer en el medio para MT; Por lo tanto, la eficacia de la fermentación de los dos tipos de hongos se examinó utilizando un modelo de ratón de cáncer de pulmón. Finalmente, se seleccionó la cofermentación de G. lucidum y MT para una mayor investigación. Se realizó un análisis metabolómico no objetivo en los productos de MT con cofermentación de G. lucidum . Identificamos 12 saponinas específicas de MT a partir de los productos de fermentación y obtuvimos un compuesto monomérico, la tenacigenina A, a partir de los productos de fermentación.

La mayoría de las tenacigeninas mostraron una tendencia ascendente significativa, a través de los niveles de tenacigenina A y tenacigenina B. Los resultados mostraron que la eficacia de la MT mejoró después de la fermentación por G. lucidum. Además, la biotransformación de los glucósidos esteroideos C₂₁ en MT fue la reacción central en este proceso de fermentación. En resumen, este estudio estableció un sistema sistemático y completo de cofermentación y un método de evaluación farmacodinámica para la MT, que no solo mejoró la plena utilización de sustancias activas efectivas en la MT, sino que también proporcionó una referencia metodológica para el desarrollo de otros medicamentos étnicos.

Introducción

El cáncer de pulmón pertenece a la categoría de "carbunclo pulmonar" en la medicina tradicional china. La patogenia del carbunclo pulmonar es una debilidad del "Qi" saludable de los pacientes, desequilibrio del Yin y el Yang, toxinas y estancamiento en el pulmón, lo que conduce a disfunción pulmonar, bloqueo de la sangre y pérdida de líquidos en el pulmón. Por lo tanto, la estasis sanguínea a largo plazo y las toxinas del esputo en los pulmones forman una masa pulmonar¹. Por lo tanto, fortalecer el Qi y eliminar los factores patógenos es el principio básico del tratamiento del cáncer de pulmón. Los métodos de nutrir el Yin para equilibrar el Yin y el Yang, limpiar el calor, desintoxicar y dispersar el estancamiento, complementar el Qi y nutrir el Yin, y eliminar la flema se utilizan para tratar y prevenir la formación de carbuncos^pulmonares.

Marsdenia tenacissima (MT) es una planta medicinal perteneciente a la familia Asclepiadaceae (Marsdenia ssp.), también conocida como Wuguteng. Tiene los efectos de eliminar el calor y la desintoxicación, aliviar la tos y el asma, y tiene propiedades antitumorales³. La inyección de Xiaoaiping, una preparación hecha de una sola hierba de MT, ha sido ampliamente utilizada en clínicas y muestra un buen efecto terapéutico anticancerígeno⁴. Sin embargo, con el aumento de la población, la demanda de MT ha aumentado drásticamente. En consecuencia, el suministro de recursos silvestres de MT es insuficiente y la calidad de los materiales medicinales cultivados es desigual. Existen problemas como la mala calidad de los materiales herbáceos, el contenido inestable de los ingredientes y la baja biodisponibilidad, que amenazan seriamente el desarrollo de la MT. Entre estos compuestos bioactivos, las saponinas de la MT han sido ampliamente investigadas. Se han identificado más de 100 saponinas de MT; se pueden dividir en dos tipos principales: (1) glucósidos esteroideos C₂₁ en MT, incluidos tenacisósido A-P, marsdenósido A-M, tenacigenósido A-L y tenacigenina A-D. (2) Triterpenos pentacíclicos, como el ácido oleanólico y el ácido ursólico. Muchos estudios han indicado que la actividad anticancerígena de los extractos de éter de petróleo es mayor que la de las moléculas altamente polares de la MT. Por lo tanto, es ventajoso convertir el polisacárido principal de las saponinas de MT en otra aglicona menor de MT con mayor biodisponibilidad y bioactividades⁵.

La biotransformación, también conocida como biocatálisis, se refiere a las reacciones fisiológicas y bioquímicas de la transformación o modificación estructural de sustratos exógenos mediante el uso de enzimas relacionadas en sistemas biológicos⁶. Es más económica, más segura, regionalmente selectiva y estereoselectiva que la síntesis química tradicional y puede producir algunos compuestos bioactivos que son difíciles de preparar por la química sintética convencional ^7,8. Por lo tanto, el desarrollo de la medicina tradicional china y los medicamentos naturales es esencial para promover la modernización e internacionalización de la medicina tradicional china.

El sistema de cofermentación de MT se estableció mediante biotransformación. Los materiales medicinales originales fueron transformados por sistemas de enzimas microbianas. Por un lado, el extracto de MT se utilizó como sustrato para producir el cultivo de fermentación de hongos en esta modalidad. Al mismo tiempo, la fermentación fúngica acortó el ciclo de reproducción de bacterias, redujo los costos de producción y mejoró la eficiencia de la producción⁹. Por otro lado, el aumento de la precipitación de componentes activos por fermentación fúngica es beneficioso, produciendo componentes químicos y una mayor eficacia¹⁰. El uso de la tecnología de fermentación líquida bidireccional es útil para proteger los ingredientes activos de los materiales medicinales, mejorar la eficacia, ahorrar fuentes de medicamentos y puede producir una mejor efectividad al proporcionar técnicas para la modificación estructural de los ingredientes activos de los materiales herbales. Es de gran importancia mejorar el nivel de modernización de la medicina tradicional china.

En este estudio, se seleccionaron G. lucidum, O. sinensis e Inonotus obliquus (I. obliquus) como los microorganismos de fermentación en la etapa temprana después de la revisión de la literatura, y las cepas se seleccionaron preliminarmente. A continuación, se determinaron las cepas de fermentación final explorando la eficacia de las cepas cribadas a través del modelo de ratón tumoral. Finalmente, los metabolitos primarios y secundarios de los productos de fermentación se analizaron y evaluaron sistemáticamente mediante LC-MS, y se obtuvo un compuesto monomérico, la tenacigenina A, a partir de los productos de fermentación.

Protocolo

Este estudio se llevó a cabo siguiendo las recomendaciones del Centro de Animales Experimentales de la Universidad de Minzu (No. ECMUC2019008AA). El protocolo fue aprobado por el Comité Ético de Animales de Experimentación de la Universidad de Minzu. La MT se recolectó en Kunming, provincia de Yunnan.

1. Preparación para el estudio

1. Extraer MT con agua caliente (100 °C; MT/agua = 1/10, w/v) durante 30 min y recoja el residuo de extracción de MT como material de ensayo.
2. Mantener la línea celular de cáncer de pulmón de ratón LLC en el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero fetal bovino al 10%, 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina en una atmósfera humidificada a 37 °C bajo 5% de CO₂.
3. Mantenga a los ratones C57BL/6J, de 6 a 8 semanas de edad y con un peso de 19 ± 2 g, en una habitación controlada ambientalmente con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 h y con acceso ilimitado a alimentos y agua. Desinféctalos regularmente.

2. Cribado preliminar de cepas

1. Inocular tres cepas de hongos en un medio sólido de agar dextrosa (PDA) de patata utilizando técnicas estériles y cultivarlas en la oscuridad a 28 °C. Una vez que los platos estén completamente cubiertos de hongos, guárdelos a 4 °C.
2. Inocular las cepas conservadas en el medio sólido PDA en la solución de semillas del matraz de agitación de la primera etapa y cultivarlas a 28 °C, agitándolas a 120 rpm durante 4-5 días. Inocular el líquido de hongos de la primera etapa en el matraz de agitación que contiene el líquido de hongos secundarios en una proporción de volumen de 1:20 en un agitador de temperatura constante durante 4-5 días.
3. Diluir el MT con agua hasta 100 mg/L (MT/agua) y añadir la solución al agar para formar un medio sólido. Inocular 1 mL del líquido fúngico secundario de cada una de las tres cepas en el cultivo sólido que contiene solo MT, y luego dividir en sistemas de cultivo de G. lucidum-MT, I. obliquus-MT y O. sinensis-MT. Coloque estos sistemas de cultivo a 28 °C sin agitar en la oscuridad.
4. Después de un tiempo, observe el crecimiento de las cepas en los tres sistemas de cultivo anteriores y seleccione las cepas que solo pueden crecer con MT para una detección adicional.

3. Recribado de selección de cepas

NOTA: Después de la selección preliminar, solo G. lucidum y O. sinensis pudieron crecer normalmente en medio sólido que contenía MT. Para seleccionar aún más el sistema con buen efecto antitumoral, se probó la eficacia antitumoral en un modelo de ratón tumoral trasplantado.

1. Inocular G. lucidum y O. sinensis en un medio líquido que contenga solo MT-MT con cofermentación de G. lucidum (MGF) y MT con cofermentación de O. sinensis (MOF), y fermentar durante 10 días a 28 °C con agitación a 180 rpm.
2. Después de la fermentación, filtre el micelio a través de una gasa y séquelo. Extracto con etanol al 80% 3 x 12 h.
3. Comprobar la actividad antitumoral de la MT fermentada y no fermentada en ratones C57BL/6J portadores de células tumorales LLC.
   1. Por vía subcutánea, inyecte células LLC (1,0 × 10⁶ células en 0,2 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) por ratón) en el flanco derecho de ratones machos C57BL/6J (excepto en el grupo de control).
   2. Para confirmar el establecimiento exitoso del modelo, toque los nódulos tumorales y verifique que tengan un tamaño de ~5 mm. Agrupe aleatoriamente los ratones portadores de tumores (n = 10 por grupo) en el grupo modelo, el grupo MGF, el grupo MOF, el grupo MT y el grupo cisplatino (control positivo). Administrar solución salina al grupo de control (sin células tumorales) y al grupo modelo. Sacrifique a los ratones después de 14 días de tratamiento y recoja el tejido tumoral.

4. Análisis de la composición química de los productos de fermentación

NOTA: Después de verificar la eficacia de la fermentación, se seleccionó G. lucidum como cepa de fermentación en este estudio. Se realizó análisis metabolómico de MGF por cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS)¹¹.

1. Extraiga 10 mg de MT, G. lucidum y MT con cofermentación (MGF) de G. lucidum con 500 μL de metanol:H₂O (7:3), agite a 4 °C durante 1 min, sonique durante 30 min y centrifugue durante 20 min a 1.200 × g. Recoja los sobrenadantes, fíltrelos a través de una membrana de fluoruro de polivinilideno de 0,22 μm e inyecte en la configuración de cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS).
   NOTA: Los metabolitos separados por cromatografía líquida de ultra rendimiento (UPLC) y una biblioteca de muestras de control de calidad (QC) se construyeron mediante espectrometría de masas de alta resolución (ver Tabla de Materiales).
2. Utilice las siguientes condiciones UPLC: una columna C18 (100 mm x 2,1 mm; 8 μm), fase móvil A-0,1% (v/v) de ácido fórmico en agua ultrapura, fase móvil B-acetonitrilo. Establezca el perfil de elución del gradiente en 0 min 5% B; 2 min 5% B; 14 min 98% B; 17 min 98% B; 17.1 min 5% B; 20 min 5% a un caudal de 0,3 mL/min.
3. Detectar e identificar los metabolitos mediante espectrometría de masas de alta resolución. Ajuste la temperatura de la columna a 40 °C, la temperatura del inyector automático a 4 °C y el volumen de inyección a 2 μL. Mantenga las siguientes condiciones de MS: el voltaje de la fuente de iones de electrospray: +5.500/-4.500 V; la presión del gas de cortina, fuente de iones 1 y fuente de iones 2: 35, 60 y 60 psi, respectivamente; la temperatura de la fuente de iones: 600 °C; el potencial de despolimerización: ± 100 V.
4. Prepare las muestras de control de calidad (QC) mezclando volúmenes iguales de extractos MT, GL y MGF, y nombre las tres réplicas QC 1-3, respectivamente. Procese y detecte muestras de control de calidad y análisis siguiendo los mismos pasos. Inserte una muestra de control de calidad por cada tres muestras para investigar la repetibilidad de la detección y el análisis.

5. Extracción y aislamiento de productos de fermentación

1. Disuelva el extracto de fermentación obtenido del caldo de fermentación en agua destilada y revuelva bien.
   NOTA: Aquí, se obtuvieron 2 kg de extracto de fermentación a partir de 40 L de caldo de fermentación.
2. A partir de la sección 4, eluir fracciones de etanol al 10%, 30%, 50%, 70% y 95% utilizando una columna de resina de adsorción macroporosa y recoger las fracciones.
   NOTA: Aquí se obtuvieron 10,72 g de la fracción de etanol al 95%, 34,72 g de la fracción de etanol al 70%, 61,57 g de la fracción de etanol al 50% y 79,7 g de la fracción de etanol al 30%.
3. En función de la polaridad de las fracciones, eluir la fracción de etanol al 70% mediante cromatografía en columna de gel de sílice con elución de acetato de etilo:metanol y recoger las fracciones.
   NOTA: Aquí se recogieron los P. 1-P. 7.
4. Realice la cromatografía en columna Sephadex LH-20 para purificar aún más las fracciones (aquí, Fr. 3 y Fr. 4) seguida de la separación semipreparativa de la fase líquida después de la purificación utilizando 1,0 g de cada fracción.
   NOTA: Mediante el uso de cromatografía líquida semipreparativa y cromatografía en columna de gel de sílice, aislamos y purificamos la fracción de etanol al 95%.
5. Realizar microespectroscopía y espectroscopia de resonancia magnética nuclear y comparar la estructura del (los) compuesto (s) con estructuras de bases de datos para 600M y 700M y determinar la estructura plana del (los) compuesto (s).
   NOTA: Aquí, se utilizó un espectrómetro de masas híbrido para determinar el peso molecular de la mezcla. Identificamos la estructura de un compuesto (ver Figura Suplementaria S1).

6. Análisis estadístico

1. Repite todos los experimentos de fermentación seis veces. Evalúe la significación estadística utilizando la prueba t de Student. Exprese todos los datos como la media ± DE, repita todos los experimentos por triplicado y establezca p < 0,05 para la significación estadística (*0,01 ≤ p ≤ 0,05, **0,001 ≤ p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001).
2. Utilice el software SCIEX OS para identificar metabolitos principalmente en función del error de masa, el tiempo de retención, la coincidencia de isótopos, la puntuación de pureza de la biblioteca MS/MS y la fórmula molecular computacional. Utilice los siguientes parámetros de configuración de biblioteca: error de masa < 5 ppm, diferencia de relación de isótopos < 20 y puntuación de biblioteca > 50.

Resultados

Resultados preliminares del cribado de las cepas
Para explorar hongos capaces de co-fermentar con MT, seleccionamos tres hongos: G. lucidum, I. obliquus y O. sinensis. En primer lugar, se activaron las cepas: G. lucidum, I. obliquus y O. sinensis se inocularon en el medio PDA como se muestra en la Figura 1A-C; La Figura 1D-F

Discusión

Después de los experimentos de detección de cepas, descubrimos que no todos los hongos medicinales pueden sobrevivir normalmente en materiales herbáceos. Sin ningún medio adicional, la supervivencia de los hongos medicinales depende de la degradación de los componentes de los materiales medicinales a través de sus propias enzimas para sintetizar las fuentes de carbono y nitrógeno requeridas. Se puede inferir que I. obliquus puede no contener enzimas capaces de degradar la...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile	Tonguang Fine Chemicals Company, Beijing, China	20200923
Agar	Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd., USA	NO.20080107
Autoclave	BinJiang Medical Co., Ltd., Jiangyin, China	LS-50LD
constant shaking incubator	Zhicheng Inc. All rights reserved., Shanghai, China	ZWY-100D
Ganoderma lucidum	BeNa Culture Collection, Beijing, China	31732
Inonotus obliquus	BeNa Culture Collection, Beijing, China	117822
LLC Mouse lung cancer cell	National Infrastructure of Cell Line Resource, Beijing, China	PUMC000673
Male C57BL/6J mice	Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd., Beiijng, China	No.110011210107024684
Methanol	Tonguang Fine Chemicals Company, Beijing, China	20210723
Ophiocordyceps sinensis	BeNa Culture Collection, Beijing, China	118371
Poly tetra fluoroethylene	Jinteng Experiment Equipment Co., Ltd., Tianjing,China	No.997
QTRAP 5500 LC/MS	AB Sciex Pte. Ltd., USA	CV20231711
Rotary Evaporator	BUCHI Co., Ltd., Shanghai, China	R-300
Syringe	Zhiyu Medical Instrument Co., Ltd., Jinagsu, China	V500111
Ultra-clean bench	BOXUN Medica Bioological Instrument Co., Ltd., Shanghai, China	SW-CJ-LFD