Co-fermentação de Marsdenia tenacissima com Ganoderma lucidum e efeito anticâncer de pulmão dos produtos de fermentação

Resumo

Aqui, descrevemos um protocolo para estabelecer um sistema de co-fermentação sistemático e abrangente para produzir produtos de biotransformação ricos em saponinas pungentes usando Marsdenia tenacissima (Roxb.) Wight et Arn. (MT) como meio de fermentação para Ganoderma lucidum. Isso servirá como referência metodológica para o desenvolvimento de outras drogas étnicas.

Resumo

Marsdenia tenacissima (Roxb.) Wight et Arn. (MT), como um medicamento fitoterápico tradicional chinês e Dai, tem propriedades anti-inflamatórias, antibacterianas e antitumorais. No entanto, a maioria de suas principais substâncias ativas são agliconas, como tenacigenina A e tenacigenina B. Como a biodisponibilidade do MT é baixa e seus componentes ativos medicinais são difíceis de sintetizar, ele é estudado principalmente por biotransformação. Este estudo tem como objetivo produzir produtos de biotransformação ricos em saponinas pungentes usando MT como meio de fermentação para Ganoderma lucidum (G. lucidum).

Através da triagem preliminar de três fungos medicinais, verificou-se que G. lucidum e Ophiocordyceps sinensis (O. sinensis) geralmente podem crescer no meio para MT; Assim, a eficácia da fermentação dos dois tipos de fungos foi rastreada usando um modelo de câncer de pulmão em camundongos. Finalmente, a co-fermentação de G. lucidum e MT foi selecionada para investigação posterior. A análise metabolômica não-alvo foi realizada nos produtos de MT com co-fermentação de G. lucidum . Identificamos 12 saponinas específicas de MT a partir dos produtos de fermentação e obtivemos um composto monomérico, tenacigenina A, a partir de produtos de fermentação.

A maior parte da tenacigenina apresentou tendência ascendente significativa, através dos níveis de tenacigenina A e tenacigenina B. Os resultados mostraram que a eficácia do MT melhorou após a fermentação por G. lucidum. Além disso, a biotransformação de glicosídeos esteróides C₂₁ em MT foi a reação central neste processo de fermentação. Em resumo, este estudo estabeleceu um sistema sistemático e abrangente de co-fermentação e método de avaliação farmacodinâmica para MT, que não apenas melhorou a utilização total de substâncias ativas eficazes em MT, mas também forneceu uma referência metodológica para o desenvolvimento de outras drogas étnicas.

Introdução

O câncer de pulmão pertence à categoria de "carbúnculo de pulmão" na medicina tradicional chinesa. A patogênese do carbúnculo pulmonar é uma fraqueza do "Qi" saudável dos pacientes, desequilíbrio de Yin e Yang, toxinas e estagnação no pulmão, levando à disfunção pulmonar, bloqueio sanguíneo e perda de líquido no pulmão. Assim, a estase sanguínea de longo prazo e as toxinas do escarro nos pulmões formam uma massa pulmonar¹. Portanto, fortalecer o Qi e eliminar fatores patogênicos é o princípio básico do tratamento do câncer de pulmão. Os métodos de nutrir o Yin para equilibrar o Yin e o Yang, limpar o calor, desintoxicar e dispersar a estagnação, suplementar o Qi e nutrir o Yin e limpar o catarro são usados para tratar e prevenir a formação de carbúnculos pulmonares².

Marsdenia tenacissima (MT) é uma planta medicinal pertencente à família Asclepiadaceae (Marsdenia ssp.), também conhecida como Wuguteng. Tem os efeitos de limpar o calor e desintoxicar, aliviar a tosse e a asma, e tem propriedades antitumorais³. A injeção de Xiaoaiping, uma preparação feita a partir de uma única erva de MT, tem sido amplamente utilizada em clínicas e apresenta bom efeito terapêutico anticancerígeno⁴. No entanto, com o aumento da população, a demanda por MT aumentou acentuadamente. Consequentemente, o fornecimento de recursos de MT selvagens é insuficiente e a qualidade dos materiais medicinais cultivados é desigual. Existem problemas como má qualidade dos materiais herbáceos, conteúdo instável dos ingredientes e baixa biodisponibilidade, que ameaçam seriamente o desenvolvimento da MT. Dentre esses compostos bioativos, as saponinas de MT têm sido altamente investigadas. Mais de 100 saponinas de MT foram identificadas; eles podem ser divididos em dois tipos principais: (1) glicosídeos esteróides C₂₁ em MT, incluindo tenacissosídeo AP, marsdenosídeo AM, tenacigenosídeo AL e tenacigenina AD. (2) Triterpenos pentacíclicos, como ácido oleanólico e ácido ursólico. Muitos estudos indicaram que a atividade anticancerígena dos extratos de éter de petróleo é maior do que as moléculas altamente polares do MT. Portanto, é vantajoso converter o polissacarídeo principal das saponinas do MT em outra aglicona menor do MT com maior biodisponibilidade e bioatividades⁵.

A biotransformação, também conhecida como biocatálise, refere-se às reações fisiológicas e bioquímicas da transformação ou modificação estrutural de substratos exógenos pelo uso de enzimas relacionadas em sistemas biológicos⁶. É mais econômico, mais seguro, regionalmente seletivo e estereosseletivo do que a síntese química tradicional e pode produzir alguns compostos bioativos que são difíceis de preparar pela química sintética convencional ^7,8. Portanto, o desenvolvimento da medicina tradicional chinesa e dos medicamentos naturais é essencial para promover a modernização e internacionalização da medicina tradicional chinesa.

O sistema de co-fermentação de MT foi estabelecido usando biotransformação. Os materiais medicinais originais foram transformados por sistemas enzimáticos microbianos. Por um lado, o extrato de MT foi utilizado como substrato para produzir a cultura de fermentação de fungos neste modo. Ao mesmo tempo, a fermentação fúngica encurtou o ciclo de reprodução de bactérias, reduziu os custos de produção e melhorou a eficiência da produção⁹. Por outro lado, o aumento da precipitação de componentes ativos pela fermentação fúngica é benéfico, produzindo componentes químicos e uma eficácia^{melhorada 10}. O uso da tecnologia de fermentação bidirecional líquida é útil para proteger os ingredientes ativos de materiais medicinais, melhorar a eficácia, salvar fontes de medicamentos e pode produzir melhor eficácia ao fornecer técnicas para a modificação estrutural de ingredientes ativos de materiais herbáceos. É de grande importância melhorar o nível de modernização da medicina tradicional chinesa.

Neste estudo, G. lucidum, O. sinensis e Inonotus obliquus (I. obliquus) foram selecionados como microrganismos de fermentação no estágio inicial após a revisão da literatura, e as cepas foram selecionadas preliminarmente. Em seguida, as cepas de fermentação final foram determinadas explorando a eficácia das cepas rastreadas por meio do modelo de camundongo tumoral. Finalmente, os metabólitos primários e metabólitos secundários dos produtos de fermentação foram sistematicamente analisados e avaliados por LC-MS, e obtivemos um composto monomérico, tenacigenina A, a partir dos produtos de fermentação.

Protocolo

Este estudo foi conduzido seguindo as recomendações do Centro de Animais Experimentais da Universidade de Minzu (No. ECMUC2019008AA). O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Animais Experimentais da Universidade de Minzu. MT foi coletado em Kunming, província de Yunnan.

1. Preparação do estudo

1. Extrair MT com água quente (100 °C; MT/água = 1/10, p/v) durante 30 min e recolher o resíduo de extracção MT como material de ensaio.
2. Manter a linha celular de câncer de pulmão de camundongo LLC no meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino, 100 U / mL de penicilina e 100 μg / mL de estreptomicina em uma atmosfera umidificada a 37 ° C sob 5% de CO₂.
3. Manter os camundongos C57BL/6J, com idade entre 6 e 8 semanas e pesando 19 ± 2 g, em uma sala ambientalmente controlada com um ciclo claro/escuro de 12 h/12 h e com acesso ilimitado a alimentos e água. Desinfete-os regularmente.

2. Triagem preliminar de cepas

1. Inocular três estirpes de fungos em meio sólido de ágar-dextrose de batata (PDA) utilizando técnicas estéreis e cultivá-las à escura a 28 °C. Depois que os pratos estiverem totalmente cobertos com fungos, guarde-os a 4 °C.
2. Inocular as estirpes conservadas no meio sólido BDA na solução de sementes do balão agitado de primeira fase e cultivá-las a 28 °C, agitando a 120 rpm durante 4-5 dias. Inocular o líquido dos fungos da primeira fase no frasco agitado que contém o líquido secundário dos fungos numa proporção de volume de 1:20 num agitador de temperatura constante durante 4-5 dias.
3. Diluir o MT com água a 100 mg/l (MT/água) e adicionar a solução ao ágar-ágar para formar um meio sólido. Inocule 1 mL do líquido fúngico secundário de cada uma das três cepas na cultura sólida contendo apenas MT e, em seguida, divida em sistemas de cultura G. lucidum-MT, I. obliquus-MT e O. sinensis-MT. Colocar estes sistemas de cultura a 28 °C sem agitar no escuro.
4. Depois de algum tempo, observe o crescimento das cepas nos três sistemas de cultura acima e selecione as cepas que só podem crescer com MT para triagem adicional.

3. Seleção de cepas novamente

NOTA: Após a triagem preliminar, apenas G. lucidum e O. sinensis puderam crescer normalmente em meio sólido contendo MT. Para selecionar ainda mais o sistema com bom efeito antitumoral, a eficácia antitumoral foi testada em um modelo de camundongo tumoral transplantado.

1. Inocular G. lucidum e O. sinensis em meio líquido contendo apenas MT-MT com cofermentação de G. lucidum (MGF) e MT com cofermentação de O. sinensis (MOF) e fermentar durante 10 dias a 28 °C com agitação a 180 rpm.
2. Após a fermentação, filtre o micélio com gaze e seque-o. Extrato com 80% de etanol 3 x 12 h.
3. Verifique a atividade antitumoral do MT fermentado e não fermentado em camundongos C57BL / 6J portadores de células tumorais LLC.
   1. Injete células LLC por via subcutânea (1,0 × 10⁶ células em 0,2 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) por camundongo) no flanco direito de camundongos C57BL / 6J machos (exceto no grupo controle).
   2. Para confirmar o estabelecimento bem-sucedido do modelo, toque nos nódulos tumorais e verifique se eles têm ~ 5 mm de tamanho. Agrupe aleatoriamente os camundongos portadores de tumor (n = 10 por grupo) no grupo modelo, grupo MGF, grupo MOF, grupo MT e grupo cisplatina (controle positivo). Administre solução salina ao grupo controle (sem células tumorais) e ao grupo modelo. Sacrifique os camundongos após 14 dias de tratamento e colete o tecido tumoral.

4. Análise da composição química dos produtos de fermentação

NOTA: Após verificar a eficácia da fermentação, G. lucidum foi selecionada como a cepa de fermentação neste estudo. Realizamos análise metabolômica de MGF por cromatografia líquida-espectrometria de massas (LC-MS)¹¹.

1. Extrair 10 mg de MT, G. lucidum e MT com cofermentação de G. lucidum (MGF) com 500 μL de metanol: H₂O (7:3), agitar a 4 °C por 1 min, sonicar por 30 min e centrifugar por 20 min a 1.200 × g. Colete os sobrenadantes, filtre-os através de uma membrana de fluoreto de polivinilideno de 0,22 μm e injete na configuração de cromatografia líquida-espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS).
   NOTA: Metabólitos separados por cromatografia líquida de ultra eficiência (UPLC) e uma biblioteca de amostras de controle de qualidade (CQ) foram construídos por espectrometria de massa de alta resolução (consulte a Tabela de Materiais).
2. Use as seguintes condições de UPLC: uma coluna C18 (100 mm x 2,1 mm; 8 μm), fase móvel A-0,1% (v/v) ácido fórmico em água ultrapura, fase móvel B-acetonitrila. Defina o perfil de eluição do gradiente como 0 min 5% B; 2 min 5% B; 14 min 98% B; 17 min 98% B; 17,1 min 5% B; 20 min 5% a uma taxa de fluxo de 0,3 mL / min.
3. Detectar e identificar os metabólitos por espectrometria de massa de alta resolução. Defina a temperatura da coluna para 40 °C, a temperatura do injetor automático para 4 °C e o volume de injeção para 2 μL. Mantenha as seguintes condições de MS: a tensão da fonte de íons eletrospray: +5.500/-4.500 V; a pressão do gás da cortina, fonte de íons 1 e fonte de íons 2: 35, 60 e 60 psi, respectivamente; a temperatura da fonte de íons: 600 °C; o potencial de despolimerização: ± 100 V.
4. Prepare as amostras de controle de qualidade (QCs) misturando volumes iguais de extratos MT, GL e MGF e nomeie as três réplicas QC 1-3, respectivamente. Processe e detecte amostras de controle e análise de qualidade seguindo as mesmas etapas. Insira uma amostra de CQ para cada três amostras para investigar a repetibilidade da detecção e análise.

5. Extração e isolamento de produtos de fermentação

1. Dissolver o extracto de fermentação obtido do caldo de fermentação em água destilada e agitar bem.
   NOTA: Aqui, 2 kg de extrato de fermentação foram obtidos a partir de 40 L de caldo de fermentação.
2. A partir da secção 4, eluir as fracções de etanol a 10%, 30%, 50%, 70% e 95% utilizando uma coluna de resina de adsorção macroporosa e recolher as fracções
   NOTA: Aqui, foram obtidos 10,72 g da fração etanol 95%, 34,72 g da fração etanol 70%, 61,57 g da fração etanol 50% e 79,7 g da fração etanol 30%.
3. Com base na polaridade das frações, eluir a fração etanol a 70% usando cromatografia em coluna de sílica gel com eluição de acetato de etila:metanol e coletar as frações.
   NOTA: Aqui, Fr. 1-Fr. 7 foram coletados.
4. Realize a cromatografia em coluna Sephadex LH-20 para purificar ainda mais as frações (aqui, Fr. 3 e Fr. 4) seguida de separação de fase líquida semipreparativa após a purificação usando 1,0 g de cada fração.
   NOTA: Usando cromatografia líquida semipreparativa e cromatografia em coluna de sílica gel, isolamos e purificamos a fração etanol a 95%.
5. Realizar microespectroscopia e espectroscopia de ressonância magnética nuclear e comparar a estrutura do(s) composto(s) com estruturas de bancos de dados para 600M e 700M e determinar a estrutura planar do(s) composto(s).
   NOTA: Aqui, um espectrômetro de massa híbrido foi usado para determinar o peso molecular da mistura. Identificamos a estrutura de um composto (ver Figura Suplementar S1).

6. Análises estatísticas

1. Repita todos os experimentos de fermentação seis vezes. Avalie a significância estatística usando o teste t de Student. Expresse todos os dados como a média ± DP, repita todos os experimentos em triplicata e defina p < 0,05 para significância estatística (* 0,01 ≤ p ≤ 0,05, ** 0,001 ≤ p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001).
2. Use o software SCIEX OS para identificar metabólitos principalmente com base em erro de massa, tempo de retenção, correspondência de isótopos, pontuação de pureza da biblioteca MS/MS e fórmula molecular computacional. Use os seguintes parâmetros de configuração da biblioteca: erro de massa < 5 ppm, diferença de proporção de isótopos < 20 e pontuação da biblioteca > 50.

Resultados

Resultados preliminares da triagem de cepas
Para explorar fungos capazes de co-fermentar com MT, selecionamos três fungos: G. lucidum, I. obliquus e O. sinensis. Primeiramente, as cepas foram ativadas: G. lucidum, I. obliquus e O. sinensis foram inoculadas no meio BDA conforme mostrado na Figura 1A-C; A Figura 1D-F

Discussão

Após experimentos de triagem de cepas, descobrimos que nem todos os fungos medicinais podem sobreviver normalmente em materiais de ervas. Sem qualquer meio adicional, a sobrevivência dos fungos medicinais depende da degradação dos componentes em materiais medicinais por meio de suas próprias enzimas para sintetizar as fontes de carbono e nitrogênio necessárias. Pode-se inferir que I. obliquus pode não conter enzimas capazes de degradar saponinas de MT. Para G. lucidu...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile	Tonguang Fine Chemicals Company, Beijing, China	20200923
Agar	Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd., USA	NO.20080107
Autoclave	BinJiang Medical Co., Ltd., Jiangyin, China	LS-50LD
constant shaking incubator	Zhicheng Inc. All rights reserved., Shanghai, China	ZWY-100D
Ganoderma lucidum	BeNa Culture Collection, Beijing, China	31732
Inonotus obliquus	BeNa Culture Collection, Beijing, China	117822
LLC Mouse lung cancer cell	National Infrastructure of Cell Line Resource, Beijing, China	PUMC000673
Male C57BL/6J mice	Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd., Beiijng, China	No.110011210107024684
Methanol	Tonguang Fine Chemicals Company, Beijing, China	20210723
Ophiocordyceps sinensis	BeNa Culture Collection, Beijing, China	118371
Poly tetra fluoroethylene	Jinteng Experiment Equipment Co., Ltd., Tianjing,China	No.997
QTRAP 5500 LC/MS	AB Sciex Pte. Ltd., USA	CV20231711
Rotary Evaporator	BUCHI Co., Ltd., Shanghai, China	R-300
Syringe	Zhiyu Medical Instrument Co., Ltd., Jinagsu, China	V500111
Ultra-clean bench	BOXUN Medica Bioological Instrument Co., Ltd., Shanghai, China	SW-CJ-LFD